医疗器械细菌高通量鉴定驱蚊聚合物

1.琼脂糖包膜幻灯片的制备注：制造聚合物微阵列之前，氨基烷基硅烷涂覆的玻璃载片涂覆有琼脂糖的IB以减少非特异性背景结合，并允许结合或排斥菌6的聚合物的评价。硅烷涂层有利于琼脂糖以幻灯片的结合。 补2％（重量/体积）琼脂糖ⅠB的在蒸馏水中的250毫升瓶中溶液。 松散封盖瓶子后，加热在微波炉的悬浮液在30秒时间段直至溶解。确保该帽不紧紧关闭，以避免任何可能的压力累积。定期取出瓶子，轻轻摇动。 确保固体溶解，将溶液是明确的。倒在65℃的水浴此琼脂糖溶液的100毫升烧杯中，并地方保持液体溶液。 浸硅烷包被的载玻片放入琼脂糖溶液，以确保均匀的涂层，和WiPE的幻灯片用棉纸背面。 干的幻灯片，用涂边了，在无尘的环境中（ 例如 ，一个柜子里或通风柜）最少24小时。 确认通过目测均匀的涂层。会形成冷凝非涂布地区 – 涂层可以通过呼吸到幻灯片很容易评估。只有完全和均匀包被的载玻片应该用于微阵列打印。 2.印刷聚合物溶液的制备选择包括在玻璃小瓶N-甲基吡咯烷酮（NMP）中的聚丙烯酸酯，聚丙烯酰胺和聚氨基甲酸乙酯预形成聚合物的制备溶液（1％重量/体积）。 （制备各1ml聚合物）。涡旋直至聚合物完全溶解。聚合物的合成在别处6中描述。 用微型移液管，填充用25微升的聚合物溶液384微孔板的各孔中，以确保不存在交叉CONTA萌发和每个孔含有独特的聚合物。使用NMP作为在至少2个孔的阴性对照。记录上的孔板模板或电子表格文件在每个孔中的聚合物溶液的身份。 3.印刷聚合物微阵列使用接触打印机注：使用接触打印机进行芯片的打印。关于聚合物微阵列打印具体说明如下。有关使用打印机和安全建议的一般准则，遵循从制造商的用户手册。虽然我们使用一个接触打印机，合适的手动冲压设备也可使用。 作为在打印机的用户手册劝，创建例程（参见步骤3.3），允许的384液体（聚合物溶液或NMP）中一式四份的印刷，使用的是32针microarraying头（设置为8行和4列）。 打印排列为48行和32列的1536点。编程例程在12节打印S， 即 ，在时间32的解决方案，从而使打印机能够打印每个部分，以允许销清洗后停止。 要创建一个打印程序： 打开软件，然后从可用选项中选择“创建一个新的程序”。选择“说明”选项卡，在实验的输入信息。选择“头”选项卡，然后选择'32 -pin microarraying头“。 选择“源”选项卡，然后选择板夹（来源板支架（1×5）），板型（板384点¯x6000），总板（1）和源顺序（按列）。 在选项卡“幻灯片设计”，选择“3X1'滑'，并选择通过排列田间号”。然后选择“组阵模式”。输入“现货视图”作为“布局”和“布局尺寸”为“行数”（6），“列数”（8），“行间距”（750）和“列间距”（560）。选择一款打印冷杉吨。 在“幻灯片版式”选项卡中输入用于打印幻灯片的数量。选择“打印”选项卡输入打印参数（每墨邮票数量：1，每点邮票数量：100毫秒5，冲压时间：200毫秒，墨时间）。 注：现在一式肆份打印384液体（聚合物溶液或NMP），采用32引脚microarraying头（排列为8行4列）创建的程序。总共日常应打印排列为48行和32列具有750微米的行距和560微米的行距1536点。 放置在平台上的琼脂糖包被的载玻片，并确保良好的真空密封以保持滑动就位。 调整打印头，使得所有管脚处于相同的高度。通过手动降头在载玻片上，并确认该引脚在同一时间拉升检查。如果有与高度的任何差异，通过使用黑色PU皮ip调整E在针向上或向下。 放置在正确的方向在板夹持器， 即 ，A1孔是在支架的右上角的孔板并确保孔板被牢固地固定。 使用高度调节，确保该板保持器的高度是这样的，采摘聚合物溶液时，销不接触孔的底部。 注：这是均一的聚合物斑点重要，也避免了聚合物溶液的蔓延到相邻的井，从而造成交叉污染。 选择“开始”选项卡，选择“运行类型”为“正常”。点击“运行”，并确认该幻灯片，孔板等 ，在出现提示时在适当的位置。 在一个时间（每次32解决方案; 12节）打印1部分，允许部分之间的引脚清洁。清洁销在丙酮彻底用纸巾浸渍，接着干燥的薄纸，以确保销完全干燥。 在微阵列的打印完成时，将它们放置在滑动架和在炉中在45℃以除去NMP中的聚合物斑点真空过夜干燥。用UV光30分钟灭菌后，将微阵列准备好细菌的接种。 细菌接种幻灯片之前，请背景荧光的测量（如第5节）。细菌结合的计算中使用这种测量。 4.聚合物微阵列接种细菌注：确保良好的无菌技术。培养物的所有处理应该在无菌环境中进行的：要么使用本生灯或在流罩。培养物应当用氧的可用性，生长培养基，和温度调节到每个物种的要求来生长。 接种5毫升的Luria-BERTANI肉汤（LB准备过夜培养10克L- -1细菌用蛋白胨，5克L -1 NaCl的，和10克L- <SUP> -1酵母抽提物）与从板的殖民地。在37℃下孵育过夜，以200rpm振荡。 通过添加甘油（10％浓度的整体）的准备过夜培养的冷冻库存，并存储在股票-80℃。 为了从解冻的细菌种群的样品确定的细胞数，进行各股票的连续稀释并过夜生长的细菌在固体培养基上。在股细胞数量的准确测定可确保各种6的适当接种。 微阵列准备接种。单一物种培养物如上述生长并直接施用到微阵列。 BacMix-1是肺炎克雷伯氏菌 （ 肺炎克雷伯 ）， 腐生葡萄球菌 （ 腐生葡萄球菌 ）和金黄色葡萄球菌 （ 金黄色葡萄球菌 ）的细菌混合物。BacMix-2是由链球菌（变形链球菌）的细菌混合物， S.金黄色葡萄球菌 </eM>，K.肺炎和粪肠球菌 （ 粪肠球菌 ）。 ，以产生混合培养，在相同体积（3毫升每个）混合过夜并稀释四次新鲜LB（到50 ml终体积）。 放置紫外线灭菌的聚合物微阵列在矩形4孔板并用6ml的混合细菌培养物，在37℃，轻轻摇动（30转）5天孵育它们。 孵育后，轻轻地用磷酸缓冲盐水冲洗微阵列两次（PBS：137mM的氯化钠，2.7mM的氯化钾，10毫的 Na 2 HPO 4，1.8毫摩尔KH 2 PO 4），并用1微克毫升的溶液孵育4 -1 '，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在PBS中染色30分钟。 用PBS覆盖，并轻轻摇动，改变了PBS洗一次在一个新的孔板染色芯片幻灯片。空气流下干燥。应用盖玻片的微阵列及密封的地方用胶水。一旦ðRY，消毒的外表面，用70％（体积/体积）乙醇。 根据自己的防护水平的安全文化处分的权利。 5.芯片成像和分析捕捉每个聚合物点单幅图像在明和DAPI（前/ EM = 358纳米/ 361纳米）的通道。用安装有一20X物镜的荧光显微镜或使用自动荧光显微镜（由图像获取软件控制的XYZ载物台）手动执行此。 注意：请参考手册18操作软件和调整显微镜获得使用明和DAPI通道的图像。确保用于图像捕获的增益和曝光时间对于所有的微阵列是相同的。 通过选择的点区域和量化用图像处理软件的荧光获得在DAPI通道中的每个点的平均荧光强度。 对于每个点的背景荧光，OBTA在复制芯片聚合物点的图像只能用无细菌培养的媒体。从点的强度扣除背景荧光从细菌获得的荧光。 从四个点计算平均归一化值，代表每个聚合物，用于比较细菌各种聚合物6的结合。 识别表现出最少的细菌结合（最低荧光）为“重灾区”聚合物6聚合物。 6.涂层盖玻片为“重灾区”验证与聚合物涂层盖玻片： 制备“击中”的聚合物的溶液（〜2％重量/体积）在四氢呋喃（THF），或其它适当的溶剂。 用旋涂器以2000rpm进行10秒的聚合物溶液的合适尺寸的旋涂圆形盖玻片。 注意：在不存在旋涂器，盖玻片或其它材料可以是浸涂，虽然旋涂层产生更均匀的表面。 干燥的对流烘箱中涂覆的盖玻片在40℃下过夜，并使用UV光进行接种细菌之前30分钟消毒。 与琼脂糖大衣盖玻片阴性对照： 清洁盖玻片或者通过等离子体处理10分钟或在1M氢氧化钠中浸渍4小时。 沉浸盖玻片在含有1％（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷过夜乙腈。用丙酮清洗盖玻片3次，并放入烘箱（100℃）1小时。 浸涂用1％琼脂糖水溶液干燥盖玻片，在60℃的水浴中保持。放置在平坦的表面上的琼脂糖包被的盖玻片在24小时无尘环境条件和使用UV光进行接种细菌之前30分钟消毒。 7.附件和盖玻片利用扫描电镜分析（SEM） 后灭菌用UV光30分钟，放置在标准的12孔板或24孔板（取决于盖玻片的大小）的盖玻片（聚合物/琼脂糖涂覆或未涂覆的玻璃）中，用菌孵育作为部分所述4。 与细菌培养后，用0.1M二甲胂酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤未涂覆和涂覆的盖玻片两次，然后用2.5％（重量/体积）在0.1M二甲胂酸盐缓冲液戊二醛（pH7.4）中固定2小时。 修复交样品用1％（重量/体积）的四氧化锇在室温下1小时，并用连续的乙醇洗涤，在50，70％，90％和100％（V / V），每30分钟脱水。 在CO 2的干样品根据标准方法19。干燥时间取决于样品的性质。 涂层样品在用溅射镀膜机，在30毫安的电流，并在真空在0.75乇的金/钯合金（60/40％）。电子显微镜按标准协议，20岁以下的检查。 注：少尉URE足够的安全预防措施，以管理来自贮存，处理和处置的四氧化锇导致的风险，因为它是剧毒。 直观比较的无涂层盖玻片的图像和那些涂有琼脂糖或“重灾区”的聚合物，以确认聚合物的细菌结合/排斥能力。 注：附件的阻力应尽量减少细胞存在容易看到。 选择最有前途的“重灾区”非约束性聚合物用于医疗设备（ 例如 ，中心静脉导管）6涂层的研究。 8.一种溶剂为涂料导管的选择评估各种溶剂为它们与导管的留置部分的相容性，以及它们以溶解“击中”聚合物的能力。切割导管-1，并进入圆筒件5毫米份的长度，并用数字游标卡尺测量。 评估各种溶剂如ACET集成电路酸，氨，丙酮，乙腈，二乙醚，四氢呋喃（THF），二甲基甲酰胺（DMF），N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP），乙醇，甲醇，乙二醇，甲苯和二甲苯。沉浸在溶剂导管件12小时，对导管和溶剂清晰度的完整性目视评价。 注意：选择不会导致导管膨胀或崩解或导致混浊溶剂的溶剂。溶剂必须溶解“重灾区”的聚合物。 9.激光共聚焦显微镜上的导管细菌吸附分析制备2.5％（重量/体积）的丙酮或其它合适的溶剂的聚合物溶液作为第8.将5毫米导管件确定成一个小玻璃小瓶（5毫升）和沉浸其中在1ml的聚合物溶液2分钟。除去多余的聚合物溶液，并在40℃的真空烘箱中过夜干燥所述导管件。 通过混合细菌解冻ST接种准备ocks，得到约10 6各自物种的细胞在50ml的LB 6。 消毒涂覆和未涂覆的导管件用UV光30分钟，并用1ml在24孔平板接种LB孵育，在37℃下进行3天，用温和搅拌6。 温育后，冲洗导管，用PBS（2×2毫升）中，固定用在PBS中的10％的多聚甲醛的菌30分钟，并用PBS（1ml）中洗涤。染色上导管件用DAPI细菌（1微克毫升- 1）20分钟，并用PBS（1ml）中洗涤。 获得使用以下设置导管件共聚焦图像：405纳米的蓝色激光二极管，检测范围414到502纳米，销孔 – Airy1，图像大小 – 1,024×1,024像素，像素宽度 – 105.2纳米，Z-栈间距0.5μ米，放大倍率 – 40X 1.25。 由Z-堆叠横跨导管的100微米长50幅图像完成共焦成像。 分析使用suitab图像乐分析软件：扁平化的Z堆叠图像Z平面，使用功能来扩展景深，创造了导管件的单个图像。 注：然后将该图像进行分析，以获得由细菌覆盖导管的区域中，之后使用“弄平背景'功能背景校正。 通过SEM导管上细菌附着10.分析制备10％的丙酮的聚合物溶液（重量/体积）。 按一个枪头（200微升微量）插入切片导管的中间部分，以保持它与浸在聚合物溶液中的一块约30秒。干在环境条件下涂覆的片30分钟。通过再次浸入在环境条件下在聚合物溶液中并干燥过夜施加第二涂层。 紫外线处理和培养细菌后洗片（N = 3）用PBS（2×1毫升），并将它们转移到含有1 48孔板在PBS 0％甲醛30分钟。定影后，洗片用PBS（1ml）中，在室温下干燥过夜，安装在用导电性碳磁盘存根和金涂层用溅射涂布机（见步骤7.5）。 获得使用扫描电子显微镜6的图像。