척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에<em> Ciona intestinalis의</em
Summary
우리는 Ciona intestinalis의, 미세 주입하고 전기 기술을 사용하여 척추 동물에 척색 자매 그룹에 과도 형질 전환 유전자 최저를 제시한다. 이러한 방법은 척색 머리 감각 상피, 인간의 질병 관련 유전자의 많은 orthologs을 포함한 척추 동물의 기본적인 특성, 기능이 단순한 무척추 동물에서 기능 유전체학을 용이하게한다.
Abstract
Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.
Introduction
최근 게놈 서열 및 전사 유전자 레파토리 모형 유기체의 숫자에 접근하게되었다. 그러나, 유전자 기능 링크를 결정하고, 이러한 연결은 배아 시간 및 공간에 걸쳐 전사 활성을 실행하는 DNA에 하드 와이어되는 방법, 특히 척추 동물에서 주요 도전 남아있다. 특히 척추 동물에서 규제의 상호 작용의 복잡성과 게놈 1,2의 복잡성, 생체 내에서 DNA 수준에서 특히 효율적인 기능 분석을, 천천히. 사실, 더 GRN은 현재 개발 유기체의 마지막, 말기 차별화 된 상태로 수정에서 분석되지 않습니다.
멍게의 C. intestinalis는 전체 GRN이 가능하다 분석하는 모델 생물을 나타냅니다. 그것은 작은 유전자 중복과 무척추 동물의 전형 중복되지 않은 게놈을 보유하고 있습니다. 척추 동물은 반대로 근래 게놈 중복의 두 라운드를받은전자는 더 큰 유전자 가족과 기능 다양 화뿐만 아니라 paralogs 사이의 중복을 생성합니다. C. 컴팩트 시스 규정하는 서열 (GRNs의 제어 유닛) intestinalis, 그리고 몇 가지 세포와의 불변의 배아 계보는 C. 연상 간스. 또한, 척색 동물에서 척추 동물에 무척추 동물의 자매 그룹으로 독특한 계통 발생 위치는 형성 척색 몸 계획 3-6의 세포 해상도, 발달 관찰 할 수 있습니다.
모델 생물에서 기능 유전체학의 미래의 성공을 보장 중요한 문제는 양적 생체 섭동에 대한 배아 많은 수의 생성이다. Ciona 달걀 7의 마이크로 인젝션 법, 신속 Ciona 수백 생체 일렉트로 많은 일시적 형질 전환 동물을 얻을 수있는 가능성의 개발 8,9 돌파구되었습니다 접합자 <em> Ciona 기능 유전체학. 여기, 우리가 처음 특히 산모의 성적 증명서의, 모르 폴리 노 (MO) – 매개 유전자 최저에 대한 선택의 방법을 유지 개별 유전자를 타겟팅 더 힘든 미세 주입 기술을 제시한다. MO 올리고는 일반적으로 개시 ATG 또는 RNA의 스플 라이스 사이트를 대상으로 단백질 번역을 방해. 우리는 이렇게 함께, 생체 내에서 조직 별 이득이 또는 함수 접근법 손실의의 증강 효율적인 분석의 길을 열고, Ciona의 수정란에 전기가 양적 방식으로 분석 할 배아의 많은 수를 허용하는 방법을 보여줍니다 동시 조작 및 분석에 대한 가능성. 우리는 더 Ciona 커뮤니티 도구가 규제 지역 및 발현 벡터 전체 오픈 리딩 프레임 (ORF를)의 효율적인 복제의 실리 예측에 활용하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 차동 세포 내 현지화가의 찬란 태그 보여또는 전기에 의해 과발현에 따라 단백질을 표시.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA 또는 DNA와 DNA의 전기의 미세 주입 : 유전자 변형 Ciona 배아를 생성하는 두 가지 방법이 있습니다. Ciona 배아의 유전자 교란에 대한 이러한 기술은 먼저 1990 년대 7,8에서 사용되는 다음에서에 연속적으로 개선, 지금은 전 세계적으로 Ciona (및 기타 멍게의 장군) (20)에 사용되었다.
프로토콜의 중요한 단계
쉽게 성인 동물로부터 수집 Ciona의 배우자에 성공 형질 전환은 중요한 요소의 수에 따라 달라집니다. 배우자의 품질 (성인 2 ~ 4 주 동안 건강을 유지 올바른 염분에 위치) 수족관에서 바다 수질에 (물 온도와 산소로 변화, 북부 대서양에서 일반적으로 월 ~ 12 월)에 산란 시즌에 따라 달라집니다 , 그리고 마지막의 다양한 단계는 아래에 설명 된대로 성인에서 추출시 배우자의 올바른 취급에실험 계획안.
준비 단계 동안, 수돗물로 파스퇴르 피펫을 배양하는 아가로 오스에서 출시 유해 물질을 제거 고집하고 아가로 오스 – 코팅 배양 접시의 해수 사전 배양에서 배아를 방지 할 수 있습니다. 일반적으로, 식기는 세균 성장을 피하기 위해 4 ℃에서 보관 사용 전 이주, 최대 제조 될 수 있으며, 사용 전에 세정 갓. 옛날 어느 날, 작은 접시는 주사를 위해 최선을 보인다.
dechorionation의 효율성과 길이는 발전을 해칠 계란 / 배아의 장기 치료와 프로토콜의 중요한 단계입니다. 주의 깊은 준비 (아무 흔들림) 및 (최대 일주 4 ° C에서) 정확한 기억은 dechorionation 솔루션의 품질을 유지. 어느 긴 시간 / 일 동안 실온에서 유지 특히 경우, 제제 또는 시간 경과에 너무 격렬하게 혼합하면 용액 프로테아제 효율을 잃는다. 우리는 편리 신선한 dechorionation 솔루션을 사용하여이 중요한 단계를 최적화 한20 배 원액의 냉동 분취에서 준비했습니다.
피펫은 해로운 반면 깨지기 쉬운 dechorionated 계란 / 배아의 올바른 취급 필수 및 전단 또는 배아의 찔러입니다. 피펫, 배아는 정지에서 수평이 아닌 수직으로 유리 피펫을 누른 상태에서, (부드럽게 부드러운하지만 빠른 피펫 다음에 그들을 소용돌이 액체를 '불어'에 의해) 가능한 한 많이 유지합니다. 이러한 치료는 세척, 재 부유하고 알을 전송하기위한 모든 피펫 단계에 적용 / 배아 및 튜브, 큐벳 또는 접시, 중 전과 고정 후입니다. 고정 배아 대 라이브는 고정 제의 유적에서 어떤 독성을 방지하기 위해 고정시 특별한주의는 별도의 피펫 팅 장치에주의해야한다.
미세 주입으로 인해 작은 크기와 난황 막의 탄성에 Ciona 계란 / 배아에서 다소 까다 롭습니다 비판적으로의 최적화 팁 크기에 따라 달라집니다주사 바늘, (계란 반경을 따라 한 줄에 바늘 이동) 주입의 완벽한 각도와 (주입을위한 사전 열망에 흡입에 의해) 난황 막의 미세 조정, 수동 속보입니다. 기포가 완전히 흡입 / 분사 압력을 평활화 광유를 포함하는 주입 튜브로부터 제거되는 경우, 후자는 가능하다. 또한, 먼지 나 부스러기 계란의 작은 조각 바늘을 방해 할 것이며, 쉽게 깨끗한 작업 환경 사출 접시에 전송하기 전에 계란 세정 공정에 의해 회피된다. 포스트 분사는, 신선한 요리 위에 계란의 전송은 사출 과정에서 살아남은 데없는 죽은 배아에서 독성을 방지 할 수 있습니다.
문제 해결
절차에 잠재적 인 문제는 다음 방법에 의해 해결 될 수있다. 낮은 수정률이 부족 정자 활성화, 낮은 계란 청결 또는 큰 수정 볼륨에서 발생할 수있다. freshl 사용y를 풀 적은 정자를 희석. 활성화시 정자의 움직임을 확인합니다. 단계 4.2에 설명 된대로 이전에 수정에 ASWH와 계란을 씻으십시오. 물 볼륨을 줄이고 / 잘 시비 접시 당 계란의 양을 줄일 수 있습니다. 제조 단계 동안 잃어 배아보다 효율적 undechorionated 계란 / 배아 아래 원심 분리기 dechorionation 용액 한 방울을 첨가하여 피할 수있다. Dechorionation 시간이되지 침전물과 연장 dechorionation은 독성이 배아가 폭발하는 원인이됩니다 부분적으로 dechorionated 계란으로 최적화해야한다.
비동기 개발 해부 동안 방출 잔류 정자에서 발생할 수있다. 통제되지 않은 교차 수정을 방지하기 위해 다른 동물로부터 분리 된 계란 배치를 유지합니다. 이상 개발은 여러 가지 원인이있을 수 있습니다. 시작과 계절의 끝에서 분리 된 다른 개체의 배아를 유지 한 후, 최적의 배치가 선택 될 수있다. 의 배아를 방해하지 마십시오수정을 따라 10 분은 ooplasmic 분리를 방해 방지 할 수 있습니다. 피펫이 부분 배아에서 자매 할구과 결과를 분리로 전송되는 동안 배아 분할이 시작되지 않았 음을 확인합니다. 다 수정을 방지하기 위해 dechorionated 계란 적은 정자를 사용합니다. 갓 준비하지만 세척 아가로 오스 요리를 사용합니다. 피펫 장치가 정착이 없는지 확인합니다. dechorionated되지 않고 중단 된 단계 개발을 감지하는 전기 천공되지 않은 제어 배아를 유지합니다. 오염 및 분해가 발생하는 경우 항생제로 배아를 보충합니다.
사출 장치가 '막힘'경우 주사 바늘 개구는 염색 콘텐츠의 추방에 의해 검증 될 수있다. 막힘 물질을 조심스럽게 아가로 오스를 통해 바늘 끝을 드래그하여 닦아 할 수있다. 공기 주입 튜브에 거품 및 / 또는 바늘을 제거해야합니다. 니로 주입 부피보다 잘 제어 바늘 변경DLE 팁은 휴식 또는 주사에 따라 방해 할 수 있습니다. 계란을 씻어 이물질이 접시에 축적 된 경우 깨끗한 주입 접시에 배치합니다. 어떤 작은 입자 또는 결정을 침전시키기 위해 신선한 바늘을 충전하기 전에 주입 용액을 원심 분리기. 또한 도움은 중요한 염료 주입을 연습한다. 주입과 비 주입 계란 시비하여 주입 기술을 확인한다. 마지막으로, 경험있는 동료와 상담하는 사출 기술을 개선하기 위해 도움이 될 수 있습니다.
오프 대상 효과를 제어하기 위해 두 번째 비 중첩 충실 Ciona에서 불특정 표현형 효과를 배제 할 수있는 MO들에 의해 인식되지 않는 수정의 mRNA와 MO 및 구조를.
미세 주입 : 의의와 한계
Ciona에 미세 주입은 척색 (11)에 전체 배아의 유전자 조절 네트워크 (GRN)에 대한 첫 번째 청사진을 생성하기 위해 사용 하였다. 그러나, 이러한 REMA 불구Ciona 배아에서 rkable 업적, 미세 주입으로 인해 Ciona 계란의 상대적으로 작은 크기 (직경 0.14 mm)에 제한이 있습니다. 외국 DNA / mRNA의이 microinjections에 의해 도입되는 다른 척색 종에 비해, Ciona 달걀 취급 비교적 어려운 실험 당 주입 Ciona 배아의 비율은 정량적 분석을 방해, (실험 당 평균 30 ~ 50 배아에) 낮은 남아있다. 그럼에도 Ciona의 섭동 모체 인자 모스의 미세 주입법은 또한 16 내지 32 세포의 발달 접합체 발병 그들의 관련 15 단계 공부 선택의 방법이다. 또한, 더 어려운가 16-32 세포 단계까지 각각의 할구를 microinject 할지라도 가능하다. 마지막으로, 마이크로 인젝션은 Ciona 이외 멍게의 종 (또는 mRNA의 DNA 주입에 의해) 트랜스 제닉 태아를 생성하기위한 가장 효율적인 방법을 완전하게 유지하는 데이터 최적화데이빗 전기 천공 프로토콜이 존재하지 않는다.
전기 : 의의와 한계
이 개발 젤러 등에 의해 최적화 및 표준화 프로토콜로 발행 된 이후에 낮은 번호와 미세 주사의 다른 제약 조건을 극복하기 위해 Ciona 커뮤니티의 대부분은 플라스미드 DNA의 전기를 사용하고있다. 2004 9. 사실, 유전자 변형 Ciona 배아의 수천 동시에 하나의 베트에 일렉트로 500 배아 16 밀리 초 중 하나의 50 V의 펄스를 이용하여 한 시간 내에 생성 될 수있다. 형질 전환 배아 대규모 번호를 생성하는 방법은 여전히 척색 모델 유기체 중에서 유일하다. 신속하게 생체 내에서 수행하기위한 강력한 모델 시스템으로 인식 여기에 예시 된 바와 같이 이것은 잠재적 인 시스 규정하는 지역 및 세포 내 / 셀룰러 지역화 분석 Ciona을 주도했다.
electroporati 있지만Ciona의 접합자에 근본적으로 척색 GRN의 연구 분야를 혁명에,이 기술은 그럼에도 불구하고 몇 가지 한계에 직면 해있다. 첫째, 플라스미드는 일시적으로 Ciona 배아에 도입하고 대부분 투기 전기 천공 플라스미드 DNA의 안정성을, 염색체 외 배열로 상속됩니다. 또한, 이와 같이 형질 변동 결과 접합체 당 흡수한다 일렉트로 플라스미드의 카피를 제어하기 위해, 심지어 불가능 매우 어렵다. 전기의 결과를 해석하기 어렵게 만드는 또 다른 문제는 우리가 염색체를 부르는 현상이다. 일렉트로 플라스미드 DNA는 한 세포 단계 배아의 상이한 위치에서 채택 될 수있다; 이는 후손 할구 상속 할과 접합자의 많은 분기 플라스미드를 받게됩니다 방법을 결정합니다. 이러한 변형은 명백히 정량적 효과의 해석을 더욱 어렵게 만든다. 그러나 electropora으로 대부분의 문제를 와서 그기 변동을 계산하고, 일괄 적 입수가 용이 LacZ를 (또는 GFP) 양성 세포의 통계, 생물학적 시료의 적정량에 의해 해결된다.
다양성 및 유전 공학에 대한 전기의 가능성
전기는 결국 한 번 기자 또는 발현 플라스미드에 클로닝 가능성 시스 규정하는 지역과 유전자 기능의 정량적 분석의 중간 스크리닝 수 있습니다. 때문에 소형 Ciona 게놈을 식별하고 잠재적 규제 지역의 복제하면 3 매우 간단합니다. 커뮤니티 데이터의 재산을 사용하는 전략도 2a에 설명된다. 기자와 유전자 코딩 플라스미드의 복제가 더 Ciona의 발생에 의해 적응 용이, GATEWAY 호환 벡터 스위트 룸 (19)와 호환되는 전체 길이 ORF 라이브러리 18. 두 도구는 지역 사회에 사용할 수 있으며,도 2b에 도시 된 바와 같이, 규제 드라이버 및 코딩 영역의 효율적인 제한 효소없는 재조합 허용한다.
최근, 일렉트로 성공적 조직의 드라이버 (21, 22)의 제어하에 CRISPR / Cas9 성분 등 유전자 편집 도구를 발현 플라스미드 조직 타겟 유전자 조작을 실현하도록한다. 이러한 접근 방식은 신속하게 전사 인자의 조직 형성에 관여하는 코드와 만능의 단계적 출구를 포함 GRNs의 역학 및 잠재적으로 보존 신호 메커니즘에 대한 우리의 이해를 진출하게됩니다. 또한, 전기를 사용하여 조직 특이 loss- 또는 (CRISPR / Cas9에 의해 또는 과발현에 의해) 이득의 기능 방식은 인간의 질병 관련 유전자의 Ciona의 orthologs을 연구하는 수단이 될 것입니다. 사실, 클론을 코딩 Ciona 인간 질병 유전자의 orthologs과 전체 길이 ORF에 대한 카탈로그를 쉽게 availab이다Ciona 1 8 분석을위한 제작. 척추 동물의 게놈 넓은 중복으로 인해, 대부분의 인간의 유전자는 유전자 기능 (1)의 분석을 복잡하게 기능적으로 중복 paralogs을 가지고있다. Ciona는 중요한 종종 기능적으로 보존 된 유전자의 근본적인 역할을 발견한다 유충의 전형적인 척색 조직 구성과 간단한 시스템을 주도했습니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).
Materials
| Lab with constant temp. (~ 18°C) | For embryo work | ||
| Ciona intestinalis adults | UPMC – Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
| KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
| CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
| MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
| MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
| NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
| Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
| Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
| Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
| Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
| Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
| Plastic petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
| Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
| NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
| Tris | Roth | 5429.3 | 1M pH9.5, for sperm activation |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12h |
| Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
| 2ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
| Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
| Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
| Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
| Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
| Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
| X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
| K5Fe(CN)6 | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
| K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
| Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
| Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
| Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
| Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
| Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection |
| Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
| Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
| All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
| Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5mM | |
| Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
| Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
| Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
| Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 |
Riferimenti
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