JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

La micro-injection et l'électroporation d'embryons dans le chordés<em> Ciona intestinalis</em

Published: October 16, 2016
doi:
10.3791/54313
, , , ,
1Department of Evolution and Developmental Biology, Zoological Institute,University Innsbruck

Summary

Nous présentons transgénèse transitoire et knockdown de gènes dans Ciona intestinalis, un groupe de soeur chordés aux vertébrés, en utilisant des techniques de microinjection et électroporation. Ces méthodes facilitent la génomique fonctionnelle dans cet invertébré simple qui comporte des caractéristiques rudimentaires de vertébrés, y compris notochorde et la tête épithéliums sensorielle, et de nombreux orthologues de gènes de maladies humaines associées.

Abstract

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Introduction

Récemment, la séquence du génome et de répertoires de gènes transcrits sont devenus accessibles dans un certain nombre d'organismes modèles. Détermination de gènes liens fonctionnels, cependant, et la façon dont ces connexions sont câblés dans l'ADN pour exécuter une activité de transcription à travers le temps et l'espace embryonnaire, reste un défi majeur, en particulier chez les vertébrés. La complexité des interactions réglementaires et de la complexité des génomes 1,2, notamment chez les vertébrés, ralentissent les analyses fonctionnelles efficaces, en particulier au niveau de l' ADN in vivo. En effet, aucun GRN est actuellement analysée de la fécondation à l'état final, terminale différenciée de l'organisme en développement.

L'ascidie C. intestinalis représente un organisme modèle où une telle complète GRN analyse peut être possible. Il a un génome non dupliquées typique des invertébrés avec peu de redondance génique. Vertébrés, en revanche ont subi deux séries de duplications que HAVe généré familles de gènes plus grandes et la diversification fonctionnelle, mais aussi la redondance entre les paralogues. Les séquences -Informations règlementaires cis compactes (les unités de commande de GRNS) de C. intestinalis, et une lignée embryonnaire invariables avec quelques cellules rappellent C. elegans. En outre, sa position phylogénétique unique en tant que groupe soeur invertébrés aux vertébrés dans les chordés permet l' observation du développement, à une résolution cellulaire, du plan de corps de chordés formant 3-6.

La question clé qui assure le succès futur de la génomique fonctionnelle dans des organismes modèles est la génération d' un grand nombre d'embryons pour quantitatives perturbations in vivo. Le développement de la technique de micro – injection dans les œufs Ciona 7, et la possibilité d'obtenir rapidement de nombreux animaux transgéniques transitoirement par électroporation in vivo dans des centaines de Ciona zygotes 8,9 a été une percée dans <em> Ciona génomique fonctionnelle. Ici, nous présentons d'abord la technique de microinjection plus laborieuse pour le ciblage des gènes individuels qui reste la méthode de choix pour morpholino (MO) knockdown du gène médiée, notamment des transcriptions maternelles. oligos MO généralement cibler l'ATG initiateur ou les sites d'épissage de l'ARN et interfèrent avec la traduction des protéines. Nous montrons ensuite comment électroporation dans les œufs fécondés de Ciona permet à un grand nombre d'embryons à analyser de façon quantitative, ouvrant ainsi des voies d'analyse efficace des exhausteurs in vivo et d'intensité forte tissu-spécifique ou perte d'approches de fonction, avec le possibilité pour les manipulations et analyses simultanées. Nous démontrons aussi comment Ciona outils communautaires sont utilisés pour la prévision silico des régions régulatrices et le clonage efficace des pleins cadres de lecture ouverts (ORF) dans des vecteurs d'expression. Enfin, nous démontrons différentielles subcellulaire des localisations marquées par fluorescenceou des protéines marquées sur la surexpression par électroporation.

Protocol

1. Préparatifs pour microinjection et électroporation en Ciona Oeufs et zygotes Préparer 10 L d'eau de mer artificielle avec HEPES (ASWH) pour la culture d'embryons. Dissoudre mM NaCl 420, 9 mM de KCl, 10 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 24,5 mM MgCl 2 · 6H 2 O, 25,5 mM MgSO 4 · 7H 2 O, et 2,15 mM NaHCO 3 dans l' eau distillée deux fois (ddH 2 O) en agitant pendant une nuit. Ajouter 5 mM HEPES, pH 8,0, et de vérifier / ajuster le pH à 8,0. Stocker le ASWH à 4 ° C. Chauffez jusqu'à 18 ° C et le filtrer avec du papier filtre avant utilisation. Préparer une solution 20x inactivée dechorionation: thioglycolate de sodium à 20%, 1% dans la pronase ASWH. Stockez 500 aliquotes pi à -20 ° C, et diluer à un volume final de 10 ml ASWH avant utilisation. Préparer 15 à 20 boîtes de culture pour les œufs / embryons. Verser fondue d'agarose à 1% dans ASWH à 3,5, 5, 9 ou 15 cm des boîtes de Petri, en les enrobant d'une mince couche de 1 à 2 mm.Que l'agarose solidifier et couvrir les plaques avec ASWH. Stock eux à 4 ° C pendant 1-2 semaines maximum. Remplacez le ASWH avant utilisation. Préparer des plats d'injection spéciale. Versez une couche épaisse de 5-7 mm de fondu 1% d'agarose dans un plat de 5 cm de Pétri, et placer un moule sur l'agarose (comme une fermeture zip lock collé à une lamelle en plastique) pour produire une empreinte lors de la solidification de l'agarose qui peut contenir des oeufs. Préparer 4 à 5 plats d'injection et couvrir avec ASWH. Conserver à 4 ° C et le remplacer par ASWH frais avant utilisation. Utilisez uniquement des plaques fraîches pour injection (maximum de vieux un jour). Préparer β-galactosidase (LacZ) du tampon de coloration: 1 mM MgCl 2 .6H 2 O, 3 mM de K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O, 3 mM de K 3 [Fe (CN) 6] dans le tampon au phosphate salin (PBS) avec du Tween (PBT) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, 0,05% de Tween). Magasin in l'obscurité à 4 ° C. Préparer le substrat LacZ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-gal, 10 U / ml) dans des aliquotes de 40 mg / ml dans du diméthylformamide (DMF) et les stocks de conserver à -20 ° C jusqu'à ce que utilisation. Tremper pipettes Pasteur dans l'eau du robinet pendant la nuit pour éviter les embryons de coller. Préparer des aiguilles d'injection. Mettre en place un extracteur micropipette à des conditions telles que la chaleur 425, tirez 75, vitesse 75 et le temps 200 (à partir d'un test de filament de rampe de 415). Tirez 4 à 5 capillaires en verre contenant filament pour produire 8 à 10 longues, fines aiguilles normalement fermées à la pointe. Stocker les aiguilles dans une boîte à aiguilles sans poussière, attachée à un ruban adhésif double sur un support surélevé, pour éviter de casser les conseils et ce qui est pratique pour le remplissage de l'aiguille. REMARQUE: Testez les aiguilles obtenues en injectant quelques oeufs avec colorant vital vert (tel que décrit dans la section 6) et régler l'aiguille en tirant les conditions pour obtenir une forme de pointe qui permet d'affiner et de REPETITive injection comme décrit dans 6.6. Préparer la solution d'injection. 4 ul de la préparation de la solution d'injection, par exemple, composé de 1 ul de 2 mM MO, 2 ul de 10 ug / ul de colorant vital vert et 1 ul ddH 2 O. Ajouter une concentration finale de 0,05 à 0,5 pg / pl d'ARNm coiffés ou 20 ng / pl d'ADN de plasmide selon la question expérimentale. Bien mélanger. Gardez sur la glace si la solution contient l'ARNm. 2. Collecte des gamètes Adultes Dissect Ciona dans un 18 ° C refroidi salle d'embryon. Utilisez de petits ciseaux et commencer à partir de la fin qui oppose les siphons sur le côté de l'exhalation (plus court) siphon sous lequel l'oviducte et la course de canal du sperme. Exposer l'oviducte et de faire délicatement une incision dans l'oviducte en utilisant la pointe des ciseaux. Laissez tomber les oeufs écoule directement dans une plaque de 6 puits contenant ASWH en appuyant doucement l'oviducte avec les ciseaux fermés décapage hors exgs. Transférer les oeufs restants avec une pipette Pasteur pré-rincé avec ASWH. Déposer les œufs provenant de différents animaux dans différents puits. Observer la qualité des œufs dans le champ de dissection. NOTE: les œufs bien développés sont ronds et roses à légèrement jaune. Ils sont entourés d'une couche vitelline non cellulaire, le chorion qui forme un espace périvitellin bien défini autour de l'oeuf. Chorion est associée à des cellules de test dans ses cellules de follicules à l'intérieur et en forme d'étoile à l'extérieur. Les œufs de faible qualité manquent souvent de l'espace périvitelline ou les cellules folliculaires. Ils apparaissent moins rond, plus granulaire ou de couleur différente. ovocytes immatures sont plus petits et ont une couleur blanc argenté. Couper le canal du sperme avec des ciseaux et recueillir le sperme concentré dans un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pipette Pasteur séparée. Rassembler le sperme provenant de différents animaux (au moins deux) dans le même tube. sperme de magasin à 4 ° C pendant plusieurs jours. 3.Fertilisation Recueillir le sperme et les œufs à 18 ° C comme décrit à l'étape 2. Activer le sperme. Préparer 1 ml ASWH dans un tube de 1,5 ml et on mélange avec 50 pi de Tris 1 M pH 9,5. Ensuite, ajouter 20 ul de sperme concentré et mélanger doucement en inversant le tube. Vérifiez l'activation du sperme dans une goutte de sperme placé sur un couvercle d'une petite boîte de Pétri ou une lame de verre et d'observer dans le champ de dissection. Les spermatozoïdes doivent être nager frénétiquement. Ajouter 100 à 200 ul de la solution de sperme activé à chaque puits d'oeufs (contenant entre 100 et 1000 œufs), bien mélanger par pipetage vers le haut et vers le bas, de sorte que les oeufs flottent dans le milieu. Attendre 10 min sans déplacer les embryons. 4. dechorionation des ovules et des embryons Diluer une aliquote de 500 pi de 20x solution dechorionation à 10 ml en ASWH. Activer la solution dechorionation en ajoutant goutte à goutte 200 pi de 2.NaOH 5 M à la solution 10 ml 1x dechorionation. Un précipité laiteux se formera. Mélanger doucement en inversant le tube. Collecter les oeufs ou les zygotes (après 10 minutes d'attente à l'étape 3.3) dans des tubes en verre à l'aide d'une pipette Pasteur. Réunir les oeufs de 2 à 3 animaux dans un tube (autour de 1.000-5.000 oeufs / tube). Sédiments avec une centrifugeuse à la main en faisant tourner à grande vitesse (1200 xg) pendant environ 20 secondes pour former une pastille d'embryon au fond du tube. Lentement arrêter la centrifugeuse et enlever le ASWH avec une pipette Pasteur. Ajouter 4 ml de solution de dechorionation activé aux oeufs / zygotes sédimentées dans chaque tube. Suspendre les œufs / zygotes en les pipetant doucement monter et descendre à l'aide d'une pipette Pasteur robinet traitée eau surmonté d'une petite poire en caoutchouc. La solution doit tourner jaunâtre après 1-3 min. Suivre la dechorionation en retirant une petite aliquote de la suspension d'oeuf / zygote dechorionating à l'aide de la pipette Pasteur. Déposez une goutte sur une lame et d'observer sous le s disséquantchape. Gardez pipetage oeufs / zygotes de haut en bas et de vérifier toutes les 20-30 secondes. NOTE: les cellules Premières follicule se détachent, le chorion devient jaune et opaque, et enfin il se détache des zygotes. Rose dechorionated oeufs / zygotes vont tomber au fond du tube de verre. Le dechorionation ne devrait pas prendre plus de max. 5 min. Remplir le tube avec ASWH fois 50% des œufs / zygotes sont dechorionated. NOTE: Très doucement centrifugeuse (8 xg) pendant environ 10-15 secondes correspondant à une vitesse très faible, juste assez pour sédimenter les œufs / embryons dechorionated. Lentement arrêter la centrifugeuse pour ne pas perturber le culot d'oeufs / zygotes au fond du tube. Éliminer la quasi-totalité du liquide du tube de verre, y compris le matériau flottant avec incomplètement dechorionated oeufs / zygotes et les remplacer par ASWH. pipeter lentement et pour laver et centrifuger doucement à nouveau comme dans l'étape 4.2. Sinon, attendez zygotes à régler par gravité. Laver une fois de plus jusqu'à ce qu'aucun débris chorionique est lauche. les oeufs de transfert / zygote fraîchement rincé des boîtes de culture à l'aide d'une pipette Pasteur. Gardez les zygotes (pas d'œufs) à faible densité (environ 200 embryons par boîte de 10 cm) pour éviter leur coller ensemble. Culture des embryons au stade désiré à des températures comprises entre 13 et 20 ° C. Alternativement, électroporation les zygotes (étape 5) ou injecter les œufs non fécondés (étape 6). 5. électroporation Fertiliser les oeufs et les zygotes dechorionate à 18 ° C, comme dans les sections 3 et 4. Fournir entre 50 et 400 œufs par échantillon d'électroporation. Préparer l' ADN de plasmide de 50 ul dans un tube de 1,5 ml (max. D' ADN plasmidique à 100 ug dans 50 ul ddH 2 O) et ajouter 200 ul de 0,95 M de mannitol. Bien mélanger par tourbillonnement. Dispatch et la gravité sédimentent les zygotes dechorionated dans siliconés tubes de 1,5 ml. Retirez le ASWH jusqu'à la marque de 100 pi sur le tube. Procéder, consécutivement, pour chaque tube de zygote comme suit: ajouterune solution d'ADN / mannitol à l'aide d'une pipette Pasteur. Mélanger délicatement avec les zygotes et instantanément prendre le / mannitol / zygote suspension et de transfert d'ADN à une cuvette d'électroporation de 4 mm. Placez la cuvette immédiatement dans le support d'électroporation et de donner une impulsion unique de 16 msec à 50 V. Retirez les zygotes de la cuvette en utilisant la même pipette Pasteur et les étaler sur une boîte de culture contenant ASWH frais et filtré. Pipeter les zygotes avant qu'ils ne commencent à cliver environ 1 après la fécondation heures (HPF) à 18 ° C. Rinçage de la pipette entre les échantillons dans un bêcher de ASWH. Culture zygotes à 15-20 ° C à faible densité suffisante d'environ 200 embryons par boîte de 10 cm pour éviter leur coller ensemble. 6. microinjection Préparer dechorionated oeufs pour l'injection. Dechorionate les œufs séparément, de 2-4 animaux, tel que décrit dans la section 4. Gardez l'e unfertilized et dechorionatedgg dans un petit agarose des boîtes de culture revêtues séparés. Lavez les oeufs plusieurs fois dans les plats pour enlever les débris. Test de fertiliser petits lots des œufs dechorionated (environ 50) de chaque individu. Utilisez un 5 cm plat séparé pour chaque lot et appliquer 2 ul de sperme activé (étape 3.2). Bien mélanger en faisant tourbillonner les plats et étaler les oeufs dans le plat en déplaçant les plats de côté. Gardez le sperme et les oeufs ensemble pendant environ 10 minutes sans bouger. Éliminer un maximum de sperme comme suit: transférer les oeufs fécondés dans un plat de culture frais ou rincer deux fois avec ASWH frais. Laissez les embryons clivant non perturbés jusqu'au stade 32 cellules (à 18 ° C pendant environ 3 heures après la fécondation). Choisissez des œufs de la meilleure développement lot (meilleur pourcentage de fécondation et le plus tendance de clivage régulier) pour la microinjection. Mettre en place les aiguilles d'injection. Remblai 4 aiguilles d'injection dans une position verticale pour permettre la gravité flow le long du filament. 0,5 solution de dépôt ul d'injection (étape 1.8) contenant un colorant vital vert à l'extrémité arrière des aiguilles qui sont positionnées l'aiguille pointe vers le bas. Attendez que le liquide pour remplir la pointe de l'aiguille au fond. Repositionner les aiguilles à l'horizontale et de les remblayer avec de l'huile minérale à l'aide d'un métal fin et long ou embout de pipette en plastique. superposer lentement la solution d'injection d'huile minérale expulser toutes les bulles d'air lors du remplissage de l'aiguille. Configuration du micromanipulateur dans un 18 ° C Refroidi Chambre. Raccorder le tuyau en plastique du porte-aiguille pour une seringue en verre de 10 ml rempli d'une huile minérale. Remblayer le tube et le porte-aiguille avec l'huile et chasser les bulles d'air. Insérez l'aiguille dans le porte-aiguille et positionner le support sur le micromanipulateur. Ajuster le mouvement du support d'aiguille le long d'une ligne droite à un angle de 45 ° par rapport à la surface. Orientez le dechorionaoeufs ted le long de l'empreinte d'agarose de la coupelle d'injection de sorte que les œufs peuvent être injectés par une une sous le microscope de dissection. Briser la pointe de l'aiguille, si nécessaire, en poussant doucement l'aiguille contre l'agarose ou contre un morceau de couverture en verre de glissement placé sur l'agarose. Légèrement pression sur le bouton de la seringue pour vérifier que la pointe de l'aiguille est ouverte (contenu d'aiguilles vertes expulser). Injecter les œufs fécondés, un par un, en introduisant d'abord l'aiguille dans l'oeuf et un peu d'aspiration pour briser la membrane d'oeuf suivie d'une injection. Injecter la solution d'injection vert dans le milieu de l'œuf jusqu'à un maximum de 1/3 du diamètre de la cellule. (Ce qui correspond à environ 30 pl pour un diamètre d'oeuf de 140 um). Transférer les œufs non fécondés injectés dans un plat de culture frais et incuber à 15-18 ° C jusqu'à ce que la fécondation. Fertiliser les oeufs injectés avec du sperme fraîchement activé comme dans les fécondations de test (étape 6.1.2). éliminaea maximale du sperme en transférant les zygotes à un plat de culture frais. Etaler les embryons et ne les perturbe pas pendant les étapes de clivage (jusqu'au stade 32 cellules). Culture des embryons au stade désiré à une température comprise entre 13 et 20 ° C. Recueillir les embryons en les agitant dans le milieu de la plaque et de les transférer dans siliconés tubes de 1,5 ml. Fix et aux taches, ou monter (étapes 7 et 8). Comparez les phénotypes obtenus aux embryons de contrôle injecté. NOTE: Injecter une seconde MO, sans chevauchement qui cible la même transcription pour obtenir des phénotypes identiques. Rescue le phénotype MO spécifique (s) avec un ARNm modifié codant pour votre protéine d'intérêt, mais qui ne sont pas reconnus par les organisations membres. Injecter un MO de contrôle qui ne donne pas de phénotype. 7. LacZ Coloration Recueillir les embryons à un stade souhaité dans siliconés tubes de 1,5 ml et les fixer à 0,2% de glutaraldéhyde dans 1 ml ASWH 15à 30 min au maximum. Laver 2x 10 min avec 1 ml 1x PBT. Rincer une nouvelle fois dans 500 tampon de coloration LacZ ul. Remplacer avec le substrat X-Gal additionné de 1 ml tampon de coloration (utiliser 10 pl / ml de 40 mg / ml X-Gal stock). Transférer les embryons dans une plaque à 12 puits pour une meilleure observation de la coloration. Incuber dans l'obscurité. Faire varier une incubation de 0,5 heure à une nuit à 4 ° C, à la température ambiante ou à 37 ° C en fonction de la résistance du conducteur en exprimant LacZ. Laver les embryons jusqu'à 4 fois dans 1 ml 1X PBT pour éliminer le tampon de coloration. Post-fix pendant 10 min à température ambiante avec 2% de paraformaldehyde (PFA) dans 1 ml 1x PBT ou 0,2% de glutaraldéhyde dans 1 ml 1x PBT pour l'interprétation et la visualisation des embryons colorés. 8. Montage de par fluorescence Wmbryos Labelled Fixer les embryons d'un stade de développement souhaité pendant 20 min à 2% PFA dans 1 ml ASWH. Laver les embryons 2x dans 1 ml 1x PBT. Évitez les expositions lumineusesure en gardant les embryons dans des conditions sombres. Transférez jusqu'à 50 embryons à une diapositive. Retirer un maximum de PBT d'abord avec une pipette et soigneusement avec une serviette en papier. Ajouter 20-25 pi de milieu de montage. Ajouter une lamelle en le positionnant dans un angle (d'un côté de la première) et abaissez lentement avec un objet pointu (aiguille, pince, pointe de la pipette) en évitant les bulles jusqu'à ce que l'échantillon est couvert. Fixer la lamelle sur ses bords en utilisant des points d'un vernis à ongles transparent. Sceller l'ensemble de la lamelle avec un vernis à ongles après séchage. Conserver dans l'obscurité à -20 ° C.

Representative Results

Microinjection pour le gène de régulation des études de réseau Embryons de l'ascidie Ciona intestinalis sont bien adaptés pour géniques études réglementaires fonctionnels ou gènes au niveau de la lignée cellulaire et avec une résolution cellulaire. ARNm, MOS ou les étiquettes peuvent être microinjection dans l'œuf non fécondé ou en blastomères individuels qui suivent la fécondation. MO gène à médiation knockdown utilisant la technique de microinjection est décrite à l'étape 6. OM ciblent spécifiquement l'ARNm des gènes sélectionnés et empêchent leur traduction en protéine. MO perte de fonction (LOF) des gènes du développement modifie l'expression d'un large éventail de gènes en aval médiée, révélant globalement un aperçu de l'embryon GRN 10. De telles analyses en Ciona à condition que le premier projet de réglementation de l' embryon entier dans un métazoaires 11. Figure 1 montre un exemple de la façon dont microinjectisur a été utilisée pour étudier la régulation en amont de l'expression de la Ci -Myelin Transcription Factor conservé (Ci -MYT) au stade de la gastrula d'embryons Ciona. Suivis par l' hybridation in situ (ISH), l' expression endogène (figure 1a, schématisés sur la figure 1a ') en est observée dans les six rangées de précurseurs de plaque de neurones , notamment le cerveau (lignes III / IV, en rouge) et la moelle épinière ( rangée I, en vert). En outre, Ci -MYT régulation en amont a été analysé par injection MO ciblant plusieurs facteurs qui sont exprimés ou adjacents à des précurseurs neuronaux avant Ci expression -MYT apparition (figure 1b-g). MO knockdown de facteurs embryonnaires précoces, telles que la boîte Aa Forkhead (FOXA-a) et le facteur de transcription du facteur de croissance des fibroblastes 16/09/20 (FGF9 / 16/20) (figure 1b ou 1c, respectivement) élimine globalement Ci -MYT expression. D'autres facteurs de transcriptionseulement affecter partiellement expression -MYT Ci résultant dans la régulation négative de MO-médiation dans un sous – ensemble de précurseurs du cerveau (têtes de flèche bleue dans la figure 1d, f et g). A l' inverse, Ci -MYT expression ectopique activé lors de la régulation négative de Nodal (Figure 1E, têtes de flèches rouges), ce qui suggère que Nodal refoule normalement Ci -MYT expression dans ces précurseurs latéraux nerfs de la moelle. Électroporation pour des études fonctionnelles et enhancer gène efficace L' électroporation d'ADN plasmidique dans des zygotes Ciona est une méthode efficace pour la transgenèse transitoire et de l' observation subséquente des changements phénotypiques in vivo. Contrairement à microinjection d'ARNm, l'électroporation permet la surexpression spécifique de tissu, dans lequel les régions de gènes codant (ORF, cadres de lecture ouverts) sont exprimés sous contrôledes conducteurs de tissus spécifiques. Ceux – ci constituent normalement les régions de gènes cis -Informations règlementaires bien connus (tels que l'activateur de brachyury pour l' expression des précurseurs notochorde 8). A l' inverse, l' électroporation est un instrument efficace pour l'analyse de régions régulatrices , où de nouveaux gènes rapporteurs LacZ (ou la protéine fluorescente verte, GFP) révèlent leur activité in vivo. Le flux de travail pour l'identification et l' analyse ultérieure médiée par électroporation d'une telle région régulatrice de nouveau (pour -MYT Ci) est représentée sur la figure 2. Un vaste répertoire de Ciona données communautaires, facilement accessibles dans les ascidies navigateurs génomiques spécifiques 12,13, comme le Réseau ascidie pour In Expression in situ et Embryological données (ANIS) 23, est inspecté pour l'identification in silico des régions régulatrices (Figure 2A). la réaction en chaîne par polymérase subséquente (PCR) le clonage à base de ces régions dans des vecteurs d'expression permet de tester électroporation in vivo à médiation. (Figure 2B). Le navigateur de génome capture d'écran de la figure 2A montre la région en amont du modèle de transcription KH pour Ci -MYT (trois premiers exons, en orange, et deux introns sont visibles). Différentes pistes de navigateur génome annoter les données génomiques fonctionnelles prévues pour cette région, tels que la chromatine immunoprécipitation (ChIP) données 14 (représentés ici pour ZicL, Ci de doigt du cervelet L), la conservation de séquence entre deux espèces Ciona connexes 15,24 ou nucléosome 16,17 occupation (de haut en bas sur la figure 2A). En général, les régions codantes de protéines sont hautement conservés exonique (piste d'alignement sur la figure 2A). pics supplémentaires de conservation élevée apparaissent dans les régions non codantes en amont et dans le premier intron. Deux d'entre eux sont prévus pour être nucléosome gratuitelon un algorithme de séquence basée 16,17 (trames rouge sur la figure 2A) , ce qui suggère l' accessibilité des facteurs de transcription. En effet, les signaux Chip-on-Chip 14 pour la liaison Ci -ZicL facteur de transcription (barres vertes dans la figure 2A) sont enrichis dans ces deux régions conservées. En outre, en utilisant une interface 25 qui recherche des sites de liaison du facteur de transcription potentiels, nous avons identifié les sites ZIC situés dans les séquences génomiques marquées par des amas Ci -ZicL ChIP (flèches oranges et des séquences avec souligné ZIC-core, la figure 2A). La liaison de Ci -ZicL facteur de transcription dans conservée et prévisible nucléosome régions régulatrices libres Ci -MYT est compatible avec la régulation négative de l' expression Ci -MYT observée dans MO-injection médiation expériences knockdown ciblant ZicL (Figure 1d). Après découragerl' exploitation minière des régions cis potentiels -Informations règlementaires en silico pour l' expression Ci -MYT, ceux – ci sont amplifiés par PCR à partir d' ADN génomique Ciona et insérés par recombinaison clonage dans LacZ reporter plasmides 19. Les constructions sont ensuite soumis à une électroporation dans des oeufs fécondés Ciona (figure 2B) et analysées pour leur activité par coloration de LacZ (figure 3). La figure 3 montre que par une approche in silico tel , il était possible d'identifier deux séquences distinctes cis -Informations règlementaires qui récapitulent Ci -MYT ARNm domaines d'expression (comparer Figure 1a). En général, les embryons transitoirement transgéniques électroporation avec l'ADN plasmidique montrent l'expression mosaïque dans ces cellules seulement qui ont intégré l'ADN. Expression Mosaic LacZ est donc entraînée par pmyt-R3 et peut être trouvé dans tous les précurseurs qui expriment également Ci </em> -MYT ARNm ie précurseurs de plaque neuronaux de la rangée postérieure I et les lignes antérieures III / IV à gastrula et stades neurula précoces (Figure 3a, b, têtes de flèches violettes et rouges, respectivement). En revanche, pmyt-R5 est actif seulement dans postérieure (ligne I) précurseurs de la plaque neurale et à partir de l'étape ultérieure de neurula (Figure 3c, têtes de flèches rouges). Les deux régions codent donc deux aspects distincts spatiales et temporelles de la régulation des gènes Ci-myt. Fait intéressant, les deux régions régulatrices colorent également des précurseurs supplémentaires ne voit pas dans l'ISH, notamment dans la partie antérieure et la plaque neurale latérale et dans le muscle (Figure 3a, b, rose, blanc, jaune et pointes de flèches, respectivement). Une telle expression plus large peut pointer vers répressifs des éléments qui ne sont pas contenus dans les fragments réglementaires isolés (tels que pour Nodal qui réprime le destin neuronal latéral, voir la figure 1E) ou à de faibles niveaux d'expression détectés avec l' accumulationLacZ le signal enzymatique. En plus des études enhancer, électroporation Ciona facilite également les analyses fonctionnelles des gènes codant Ciona par leur surexpression. Une grande collection de Ciona pleine longueur CLO est disponible à la communauté, et a en outre été annotée pour orthologues humains, y compris les gènes associés à des maladies 18. Gènes ou groupes de gènes de cette compatible bibliothèque complète ORF ADNc de recombinaison-clonage (Figure 2B) individuels sont facilement transférées dans des vecteurs de destination contenant les pilotes appropriés pour être exprimés dans les embryons. Les clones résultants d'expression peuvent en outre être co-électroporation avec de la cis -produits de construction rapporteurs pour tester leur rôle potentiel dans l' activation d'amplificateur. La figure 2B illustre l'isolement de clones complets de l' ORF pour les facteurs de transcription Ci -ZicL et Ci- GATAa et leur recombination dans des vecteurs de destination adaptés qui peuvent contenir des balises traductionnelles 19 (par exemple fluorescente verte Vénus – ou hémagglutinine virale (HA) -tag) et un pilote spécifique des tissus tels que l'ami de Gata région régulatrice (pilote pfog) pour le début de l' expression pan-ectodermique 15 utilisé dans la présente étude. L'effet de Ci -ZicL surexpression dans les tissus de l' ectoderme et neuroectodermiques a été analysé par une co-électroporation de pmyt-R3> LacZ et pmyt-R5> LacZ la presse (figure 3b ', b' 'et c', c '', respectivement). Nos analyses d'électroporation suggèrent que Ci -ZicL peut activer l' expression Ci -MYT par pmyt-R3 et régions amplificatrices pmyt-R5 que les deux constructions rapporteurs ont présenté une expression de LacZ ectopique dans les régions ectodermiques (vert têtes de flèche sur la figure 3b ', b' 'et c &# 39; c ''). Comme le montre la figure 3d, l' électroporation d'ADN plasmidique dans des centaines d'œufs Ciona permet de quantifier statistiquement pertinente des changements d'expression, illustrés pour ectopique pmyt-R3> expression LacZ de la concentration dépendante, pan-ectodermique expression Ci -ZicL. Électroporation in vivo pour la localisation subcellulaire dans La figure 4 montre la localisation subcellulaire des facteurs de transcription dans la catégorie lorsqu'il est exprimé sur une électroporation dans blastomères ectodermiques utilisant des constructions d'expression adaptés (schématisés sur la figure 2B). Par des facteurs C-terminale marquage transcription (tels que Ci -GATAa) avec une étiquette de Vénus (figure 4b) ou un HA-tag (Figure 4c) et les surexprimant dans les tissus ectodermiques (pfog) On a pu observer que , in vivo, 'Ci -GATAa est principalement localisée dans les noyaux, comme attendu pour un facteur de transcription, tandis que l' expression Vénus est omniprésente, y compris le cytoplasme. Des expériences similaires peuvent être effectués pour étudier la dynamique de la localisation subcellulaire au fil du temps, de l'individu ou des combinaisons de facteurs de transcription, peut révéler leur co-localisation avec différents tags. Figure 1:. Évaluation de la réglementation des -MYT Ci par microinjection dans les œufs Ciona expression Ci -MYT ARNm dans WT et morpholino (MO) injecté embryons. (A) motif d'expression de WT Ci -MYT dans la plaque neurale. (A) Représentation schématique des précurseurs colorés dans la plaque neurale (NP). Ligne I / II: le destin neural postérieur; ligne III / IV: sort neural antérieur; ligne V / VI: palpe destin. ( <stron.. g> b – g) Ci -MYT d'expression sur microinjection de divers OMs pour abattre des gènes indiqués qui participent au début du Ciona GRN (images adapté de Imai et al, 2006) 11 Ci -MYT, Ci -myelin facteur de transcription; WT, de type sauvage; flèches bleues: perte de signal -MYT Ci; flèches rouges: ectopique signaux Ci -MYT. Barre d'échelle = 100 um se réfère à toutes les images. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Flux de travail pour la recherche in silico des régions activatrices et recombinaison clonage pour la transgenèse transitoire par électroporation dans des embryons Ciona (A) Un instantané de l'ANIS 23 asques.navigateur génome dian identifie des séquences régulatrices en amont de Ci – myt. Cadres rouges marquent deux régions cis potentiels -Informations règlementaires, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) et pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) qui ont été sélectionnés pour l' analyse par électroporation. Les noms des pistes: sondes ZicL: ChIP-on-Chip données 14; KH2012 Transcriptions: Ciona intestinalis modèles de transcription; Alignement Score Cs / Ci LastZ: conservation de séquence entre Ciona savignyi (Cs) / Ciona intestinalis (Ci) 15,24; . Segal 2006 prédit la version d'occupation nucléosome 1: poussin formé algorithme de calcul par Segal et al, 2006 16 appliqué à Ci comme dans Khoueiry et al, 2010 17 barres vertes:.. Ci -ZicL ChIP pics 14; flèches orange: prédit les sites ZIC; GCTG: site de liaison de base ZIC. (B) Schéma pour générer des constructions de surexpression d'un Cionune pleine longueur bibliothèque ORF ADNc, recombiné dans des vecteurs de destination contenant les pilotes de tissus spécifiques (pfog) et les étiquettes de protéines par la suite co-électroporation avec des constructions rapporteurs (tels que pmyt-R3> LacZ ou pmyt-R5> LacZ) pour in vivo lecture Ci. – MYT, Ci facteur de transcription -myelin; Ci -ZicL, Ci -Zinc doigt du cervelet facteur l de transcription;. pfog, région régulatrice de Ci de GATA : Ami S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: embryons électroporées Ciona montrant Ci -ZicL inductible cis – régulation spatio-temporelle de Ci -MYT LacZ embryons colorés à mi-gastrul.un (mG) / fin-gastrula (lG) ou neurula précoce (eN) stade sont présentées qui ont été co-électroporation avec soit pmyt-R3> LacZ ou pmyt-R5> LacZ et une construction de commande (pfog> mCherry) ou pfog> ZicL. Le pilote pfog 19 médie ectopique (pan-animal) expression ZicL en ectoderme et neurectoderme et provoque ectopique tache de LacZ dans ces cellules. (A) l' activité pmyt-R3 LacZ dans des embryons de stade mG / lg (petites pointes de flèches, panneau gauche) ou dans des territoires schématiques de couleur correspondante (cercles bleus, panneau de droite); vue végétale (vg). Ligne I / II: le destin neural postérieur; Row III / IV: sort neural antérieur; Ligne V / VI: palpe destin. (B) l' activité pmyt-R3 à des stades eN dans les tissus que dans une. (B ') l' activité ectopique pmyt-R3 sur -ZicL Ci co-électroporation est indiquée par des flèches vertes. (B '') Mêmes embryons comme dans b ', pôle animal orienté vers le haut (e). ( <strong> c) l' activité pmyt-R5 LacZ à des stades eN (c ') activité ectopique pmyt-R5 sur Ci -ZicL co-électroporation est indiquée par des flèches vertes. (C '') Mêmes embryons comme dans c 'mais orientée pôle animal vers le haut (e). (D) Quantification des expériences représentatives pour Ci -ZicL sur-activation pmyt-R3 à faibles concentrations. Une répétition biologique est représenté Ci -MYT, Ci -myelin facteur de transcription;. Ci -ZicL, Ci -Zinc doigt du facteur cervelet L de transcription; Ci -FOG, Ci de GATA : Ami; WT, de type sauvage; mG, mi-gastrula; lG, fin-gastrula; eN, neurula précoce; Une vue animale; vg, vue végétal; nls LacZ, signal de localisation nucléaire pour LacZ. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4:. Localisation subcellulaire différentielle des protéines sur électroporation Localisation de Venus-tagged ou Hemagglutinin- (HA) -tagged protéines surexprimés dans les cellules ectodermiques en utilisant le pilote de pfog 19. (A – c) des images DIC. (A ', b') correspondant des images de fluorescence. (C ') image de fluorescence correspondant à l' étiquetage histologique immunitaire avec TRITC. Barre d'échelle = 100 um se réfère à toutes les images. DIC, Contraste interférentiel différentiel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Il existe deux grandes techniques pour générer des embryons Ciona transgéniques: microinjection de l' ARN ou de l' ADN et l' électroporation de l' ADN. Ces techniques de perturbation des gènes dans les embryons Ciona ont été utilisés d' abord dans les années 1990 , 7,8 et à partir de là successivement améliorées, et maintenant utilisés dans Ciona (et d' autres genres de ascidie) 20 dans le monde entier.

Les étapes critiques dans le protocole

Transgénèse réussie en gamètes Ciona qui sont facilement collectées à partir d' animaux adultes dépend d'un certain nombre de facteurs critiques. La qualité des gamètes dépend de la saison de reproduction (généralement de mai à Décembre dans l'Atlantique Nord, l'évolution de la température de l'eau et de l'oxygénation), sur la qualité de l'eau de mer dans les aquariums (au bon salinité, les adultes restent en bonne santé pendant 2-4 semaines) , et enfin sur la manipulation correcte des gamètes lors de l'extraction des adultes, comme détaillé ci-dessous pour les différentes étapes duprotocole.

Au cours des étapes de préparation, incubation pipettes Pasteur avec de l'eau du robinet empêchera embryons de coller et de l'eau de mer pré-incubation des boîtes de Pétri agarose revêtu va éliminer les substances toxiques libérées de l'agarose. En général, les plats peuvent être préparés jusqu'à 2 semaines avant son utilisation, stocké à 4 ° C pour éviter la croissance des bactéries et on les rince fraîchement avant leur utilisation. Un jour vieux, petits plats semblent meilleures pour les injections.

L'efficacité et la durée de dechorionation est une étape cruciale dans le protocole comme un traitement prolongé des œufs / embryons va nuire au développement. Une préparation minutieuse (pas d'agitation) et de stockage correct (à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine) préserver la qualité de la solution de dechorionation. Proteases dans la solution perdent de leur efficacité si l'un mélange trop violemment à la préparation ou au fil du temps, notamment si elles sont conservées à la température ambiante pendant de longues heures / jours. Nous avons optimisé cette étape critique en utilisant une solution de dechorionation frais commodémentpréparé à partir d'aliquotes congelées de 20x solution stock.

La manipulation correcte des fragiles œufs dechorionated / embryons est essentielle et le cisaillement ou poignarder des embryons alors pipetage sera préjudiciable. Lors de pipetage, les embryons sont maintenus autant que possible dans la suspension (en douceur "soufflage" de liquide à tourbillonner les suivie par une pipetage lisse mais rapide), tout en maintenant la pipette en verre à la verticale plutôt que horizontale. Ces soins applique à toutes les étapes de pipetage pour le lavage, la remise en suspension et de transfert des oeufs / embryons dans et hors des tubes, des cuvettes ou des plaques, avant et après fixation. Lors de la fixation, une attention particulière devrait également être pris à des dispositifs de pipetage séparés pour vivre contre embryons fixes pour éviter toute toxicité à partir de restes de fixateurs.

Microinjection est assez délicate dans Ciona œufs / embryons en raison de leur petite taille et de la résilience de la membrane vitelline et dépend de la taille de la pointe optimisée de façon critiquel'aiguille d'injection, un angle parfait d'injection (mouvement de l'aiguille en une seule ligne, le long du rayon d'oeuf) et un finement réglé, l'ouverture manuelle de la membrane vitelline (par aspiration avant l'aspiration à l'injection). Celui-ci est seulement possible si les bulles d'air soient complètement éliminées de la tubulure d'injection qui contient de l'huile minérale pour lisser la pression d'aspiration / d'injection. En outre, les plus petits morceaux de débris de poussière ou de l'œuf se bouchent l'aiguille, et sont facilement évités par des conditions de travail propres et étapes de rinçage pour les oeufs avant le transfert sur le plat d'injection. injection Post, le transfert des oeufs sur des boîtes fraîches évitera des effets toxiques à partir d'embryons morts ne pas avoir survécu à la procédure d'injection.

Dépannage

Les problèmes potentiels dans la procédure peuvent être adressées par les solutions suivantes. taux de fécondation faibles peuvent provenir de l'activation de sperme insuffisant, faible propreté d'oeuf ou de gros volumes de fertilisation. Utilisez freshly ont été réunies et le sperme moins dilué. Vérifier le mouvement du sperme lors de l'activation. Lavez les oeufs avec ASWH avant la fécondation, comme décrit dans l'étape 4.2. Réduire le volume de l'eau et de réduire la quantité d'oeufs par boîte de fertilisation / puits. embryons Losing au cours des étapes de préparation peuvent être évitées en ajoutant une goutte de solution de dechorionation pour centrifuger plus efficacement vers le bas les œufs / embryons undechorionated. Dechorionation temps devrait être optimisée en oeufs partiellement dechorionated ne sédiments et dechorionation prolongée est toxique, à l'origine des embryons à exploser.

le développement Asynchronous peut provenir de sperme résiduel libéré lors de la dissection. Gardez les lots d'œufs séparés de différents animaux pour éviter incontrôlée fertilisation croisée. Un développement anormal peut avoir diverses causes. Au début et à la fin de la saison, après avoir maintenu l'embryon à partir de différents individus séparés, les meilleurs lots peuvent être sélectionnés. Eviter de perturber les embryons pour la10 min qui suivent la fécondation pour éviter d'interférer avec leur ségrégation ovoplasmique. Veiller à ce que les embryons ne commencent à se diviser, tout en étant transféré comme pipetage sépare les blastomères sœurs et les résultats dans les embryons partiels. Utiliser moins de sperme pour les œufs dechorionated pour éviter polyspermie. Utilisez des plats agarose fraîchement préparés, mais rincés. Assurez-vous que le dispositif de pipetage est fixateur libre. Gardez embryons de contrôle qui ne sont pas dechorionated et non électroporation pour détecter au cours de laquelle le développement étape a été perturbée. Compléter les embryons avec des antibiotiques en cas de contamination et de décomposition se produit.

Si le dispositif d'injection est «bouché», l'ouverture de l'aiguille d'injection peut être vérifiée en expulsant une partie de son contenu souillé. matériau de colmatage peut être effacé en faisant glisser soigneusement la pointe de l'aiguille à travers l'agarose. Les bulles d'air dans la tubulure d'injection et / ou de l'aiguille doit être supprimée. Changez l'aiguille pour un meilleur contrôle du volume d'injection comme neetip dle peut se briser ou se boucher le long injection. Rincer les œufs et les placer dans un plat d'injection propre si des débris se sont accumulés dans le plat. Centrifuger la solution d'injection avant le remplissage des aiguilles fraîches afin de sédimenter toutes les petites particules ou des cristaux. Aussi utile est la pratique de l'injection uniquement avec colorant vital. Vérifiez la technique d'injection par la fertilisation des œufs injectés et non injectées. Enfin, la consultation avec un collègue expérimenté peut être utile pour améliorer la technique d'injection.

Pour contrôler les effets hors-cible un deuxième non-chevauchement des MO et de sauvetage avec un ARNm modifié qui est pas reconnu par les OM peut fidèlement exclure des effets phénotypiques non spécifiques à Ciona.

Microinjection: signification et les limites

Microinjection dans Ciona a été utilisé pour générer le premier plan pour un réseau de régulation génique de l' embryon entier (GRN) dans un chordés 11. Cependant, en dépit d'une telle remaréalisation rkable, microinjection dans des embryons Ciona a ses limites, en raison de la taille relativement petite (0,14 mm de diamètre) des œufs Ciona. Par rapport à celles d'autres espèces de chordés où l' ADN étranger / ARNm est introduit par microinjection, les œufs Ciona sont relativement difficiles à manipuler et le taux d'embryons Ciona injectés par expérience reste faible (en moyenne 30 à 50 embryons par expérience), ce qui empêche des analyses quantitatives. Néanmoins, pour les facteurs maternels perturbatrices dans Ciona, microinjection de MOs est la méthode de choix aussi d'étudier leur implication dans l' apparition zygotique du développement de la cellule 16 à 32 stades 15. En outre, il est possible cependant beaucoup plus difficile de micro-injection blastomères individuels jusqu'au stade 16-32 cellulaire. Enfin, la microinjection reste la technique la plus efficace pour générer des embryons transgéniques (par l' ARNm ou l' injection d'ADN) dans les espèces d'ascidies autres que Ciona, pour lequel entièrement optimiprotocoles d'électroporation zed n'existent pas.

Électroporation: signification et les limites

Pour surmonter le faible nombre et d' autres contraintes de microinjection, la plupart de la communauté Ciona a utilisé électroporation d'ADN plasmidique depuis qu'il a été élaboré et publié en tant que protocole optimisé et normalisé par Zeller et al. En 2004 9. En effet, des milliers d'embryons Ciona transgéniques peuvent être générés en une heure jusqu'à 500 embryons électroporées simultanément dans une cuve à l'aide d'une seule impulsion de 50 V de 16 ms. L'approche consistant à générer un nombre considérable d'embryons transgéniques est encore unique parmi les organismes modèles des chordés. Cela a conduit Ciona être rapidement reconnu comme un système de modèle puissant pour réaliser in vivo l' analyse des potentiels régions cis et -Informations règlementaires localisation cellulaire / subcellulaire, comme illustré ici.

Bien que electroporatidans zygotes Ciona a fondamentalement révolutionné le domaine de la recherche chordés GRN, la technique néanmoins fait face à certaines limites. Tout d' abord, les plasmides sont transitoirement introduits dans des embryons Ciona et sont très probablement hérité sous forme de tableaux extrachromosomiques, ce qui rend la stabilité de l' ADN plasmidique électroporation spéculative. En outre, il est très difficile, voire impossible, de contrôler les copies de plasmides par électroporation qui seront absorbés par zygote, entraînant ainsi des variations phénotypiques. Un autre problème qui rend difficile d'interpréter les résultats d'électroporation est un phénomène que nous appelons mosaïcisme. ADN plasmidique par électroporation peut être pris en des positions différentes de l'embryon au stade d'une cellule; qui détermine qui et combien de quarts du zygote recevront plasmidique être héritée par les blastomères descendants. Ces variations font clairement l'interprétation des effets quantitatifs plus difficile. Cependant, la plupart des problèmes qui viennent avec electroporation variabilité sont résolus par une quantité appropriée d'échantillons biologiques, avec comptage et des statistiques de LacZ (ou GFP) des cellules positives, ce qui est facile à obtenir en un seul lot.

Polyvalence et le potentiel de l'électroporation pour le génie génétique

Électroporation permet éventuellement pour le dépistage à mi-débit des potentiels régions cis et -Informations règlementaires analyses quantitatives de la fonction des gènes , une fois clonées dans reporter ou d' expression des plasmides. En raison du génome Ciona compact, l' identification et le clonage des régions régulatrices potentielles est assez simple 3. Une stratégie pour l' utilisation de la richesse des données de la communauté est mise en évidence dans la figure 2A. Clonage de rapporteurs et de gènes codant des plasmides est en outre facilitée par la génération de Ciona adapté, GATEWAY compatibles suites de vecteurs 19 et une longueur compatible ORF de la bibliothèque 18. Les deux outils sont disponibles à la communauté etpermettre efficace restriction recombinaison, sans enzyme des conducteurs de régulation et les régions codantes, comme représenté sur la figure 2B.

Au cours des dernières années, l' électroporation a été adapté avec succès pour réaliser la manipulation génétique des tissus ciblés avec des plasmides qui expriment gènes outils d'édition tels que les composants CRISPR / cas9 sous le contrôle des pilotes spécifiques du tissu 21,22. Ces approches vont rapidement progresser notre compréhension de la dynamique des GRNS et les mécanismes de signalisation potentiellement conservés, y compris les codes de facteurs de transcription impliqués dans la formation des tissus et la sortie progressive de la pluripotence. En outre, déficitaire tissu-spécifique ou gain de fonction des approches (par CRISPR / cas9 ou par surexpression) en utilisant électroporation seront déterminants pour étudier orthologues Ciona de gènes associés à des maladies humaines. En effet, les catalogues pour orthologues Ciona de gènes de maladies humaines et leur longueur ORF codant clones sont facilement available pour l' analyse en Ciona 1 8. En raison du génome large duplications chez les vertébrés, la plupart des gènes humains possèdent des paralogues fonctionnellement redondantes qui compliquent l' analyse de la fonction génique 1. Ciona étant un système plus simple , avec l'agencement typique des tissus cordé dans les larves doivent découvrir des rôles fondamentaux de ces gènes importants, souvent fonctionnellement conservés.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).

Materials

Lab with constant temp. (~ 18°C)  For embryo work
Ciona intestinalis adults UPMC – Station Biologique,
Roscoff, France		 For collecting gametes
NaCl Roth 3957.1 For ASWH
KCl Roth 6781.1 For ASWH
CaCl2x2H2O Roth A119.1 For ASWH
MgCl2x6H2O Roth 2189.1 For ASWH
MgS04x7H2O Roth P027.2 For ASWH
NaHCO3 Roth 6885.1 For ASWH
Hepes  Roth HN78.3 For ASWH
Sodium thioglycolate  Sigma MZ-6 For Dechorionation
Pronase  Sigma T0632-100G For Dechorionation
D-Mannitol  Sigma Aldrich M9546-250G For electroporation
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) Macherey-Nagel 740410.100 For electroporation or microinjection
Agarose any supplier For coating embryo culture dishes
Plastic petri dishes VWR 612-2079 Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH
Small scissors any supplier For dissecting gametes
NaOH  Roth 6771.1 For activating dechorionation solution
Tris  Roth 5429.3 1M pH9.5, for sperm activation
Pasteur pipettes  VWR 612-1701 Treated by immersion in tap water for at least 12h
Hand centrifuge Hettich Zentrifugen 1011 Use glass centrifuge tubes
1.5ml Eppendorf tubes Sigma T3406-250EA
2ml Eppendorf tubes Sigma T3531-200EA
Square electroporator Bio Rad Gene Pulser Xcell
Electroporation cuvettes 4 mm Eurogentec CE-0004-50
Coverslips Sto Premium PR248212600
Glass slides VWR ECN 613-1551
Glutaraldehyde Sigma G6257-10ML For fixation in LacZ staining
Paraformaldehyde Sigma  P6148-500G For fixation of fluorescent samples
Vectashield Vector H-1000 For mounting of fluorescent samples
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) Roth 2315.2 LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide)
K5Fe(CN)6 Merck 4984 For LacZ staining buffer
K3Fe(CN)6 Merck 4973 For LacZ staining buffer
Na22HPO4 Roth 4984.2 For PBT
KH2PO4 Roth 3904.2 For PBT
Tween  Sigma SLBJ5103V For PBT
Mineral Oil Sigma M8410 Embryo culture tested
Green Vital Dye Fast Green Sigma  F7251 for microinjection; 10µg/µl
Micropipette Puller (Flaming/Brown) Sutter Instruments Model P-97 For pulling injection needles
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 Harvard Apparatus Ltd. UK 30-0038 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection
Micromanipulator Narishige MWS-2 Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection
Injection holder Narishige 1M-H1 For holding injection needles, entire system filled with mineral oil
All Glass Syringe Walter Graf & Co GmbH & Co. KG  No. 95199.10427A4 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure 
Morpholinos  GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA Injection at 0.25-0.5mM
Capped mRNA Ambion mMessage mMashine kit Injection at 0.05-0.5µg/µl 
Plasmid DNA Injection at 20 ng/µl
Recombination cloning kit Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen 11789-013
Recombination cloning kit Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen 11791-019
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).
  2. Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).
  3. Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).
  4. Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).
  5. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
  6. Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).
  7. Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux’s Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).
  8. Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124 (3), 589-602 (1997).
  9. Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).
  10. Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).
  11. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).
  12. Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).
  13. Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. , (2015).
  14. Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).
  15. Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).
  16. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
  17. Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).
  18. Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).
  19. Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2 (9), e916 (2007).
  20. Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).
  21. Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).
  22. Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).

Tags

Ciona IntestinalisEmbryo MicroinjectionEmbryo ElectroporationGene RegulationChordate DevelopmentMolecular GeneticsStem Cell ResearchDrug DiscoveryDechorionationZygoteSperm Activation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image