JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

Embryo micro-injectie en elektroporatie in de chordate<em> Doorschijnende zakpijp</em

Published: October 16, 2016
doi:
10.3791/54313
, , , ,
1Department of Evolution and Developmental Biology, Zoological Institute,University Innsbruck

Summary

We presenteren voorbijgaande transgenese en gen knock-down in doorschijnende zakpijp, een chordate zus groep gewervelde dieren, met behulp van micro-injectie en elektroporatie technieken. Dergelijke methoden vergemakkelijken functionele genomica in dit eenvoudige ongewervelde dat rudimentaire kenmerken van gewervelde dieren, met inbegrip van notochord en hoofd sensorische epitheel, en vele orthologen van de ziekte bij de mens geassocieerde genen beschikt.

Abstract

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Introduction

Onlangs hebben genoomsequentie en getranscribeerd gen repertoires beschikbaar in verschillende modelorganismen geworden. Het bepalen van gen-functionele verbindingen, echter, en hoe deze verbindingen zijn hardwired in het DNA om transcriptie activiteit uit te voeren gedurende de embryonale tijd en ruimte, blijft een belangrijke uitdaging, vooral in gewervelde dieren. De complexiteit van regulerende interacties en de complexiteit van genomen 1,2, met name bij vertebraten, vertragen efficiënte functionele analyses, met name op het DNA-niveau in vivo. Inderdaad, geen GRN momenteel geanalyseerd van bevruchting tot de finale, terminaal gedifferentieerde toestand van het zich ontwikkelende organisme.

De ascidian C. intestinalis is een modelorganisme waar dergelijke volledige GRN analyses mogelijk zijn. Het heeft een unduplicated genoom een ​​typisch voorbeeld van ongewervelde dieren met weinig gen redundantie. Gewervelde dieren, in tegenstelling tot zijn twee rondes van genoomduplicaties dat hav ondergaane gegenereerd grotere genfamilies en functionele diversificatie, maar ook redundantie tussen paralogen. De compacte cis van regelgevende sequenties (de controle-eenheden van GRNs) van C. intestinalis, en een onveranderlijke embryonale lijn met weinig cellen doen denken aan C. elegans. Bovendien zijn unieke fylogenetische positie als ongewervelde zus groep gewervelde dieren binnen chordates laat ontwikkelingsstoornissen observatie, op cellulair resolutie, van de vorming van chordate lichaamsplan 3-6.

Het belangrijkste probleem dat het toekomstige succes van functionele genomica in model organismen zorgt is de generatie van grote aantallen embryo's voor kwantitatieve in vivo verstoringen. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek Ciona eieren 7, en de mogelijkheid om snel veel tijdelijk transgene dieren te verkrijgen van in vivo elektroporatie in honderden Ciona zygoten 8,9 is een doorbraak geweest <em> Ciona functionele genomica. Hier, geven wij eerst het omslachtiger micro-injectie techniek voor het richten afzonderlijke genen die de voorkeursmethode voor morfolino (MO) gemedieerde gen knockdown blijft, met name van maternale transcripten. MO oligo richten typisch het initiator ATG of splitsingsplaatsen van het RNA en interfereren met eiwittranslatie. Vervolgens hebben we laten zien hoe elektroporatie in bevruchte eieren van Ciona zorgt voor grote aantallen embryo's te analyseren op een kwantitatieve manier, dus lanen van efficiënte analyse van enhancers openen in vivo en weefsel-specifieke gain of verlies-van-functie benadering, met de mogelijkheid voor gelijktijdige manipulaties en analyses. We laten zien hoe verder Ciona community tools worden gebruikt voor het in silico voorspellen van regulerende gebieden en efficiënte klonen van volledige open reading frames (ORF) in expressievectoren. Ten slotte tonen we differentiële subcellulaire lokalisatie van fluorescent gelabeldof gelabelde eiwitten na overexpressie door middel van elektroporatie.

Protocol

1. De voorbereidingen voor micro-injectie en elektroporatie in Ciona Eieren en Zygotes Bereid 10 liter kunstmatig zeewater met HEPES (ASWH) voor het kweken van embryo's. Ontbinding van 420 mm NaCl, 9 mM KCI, 10 mM CaCl2 · 2 H 2 O, 24,5 mM MgCl2 · 6H 2 O, 25,5 mM MgSO4 · 7H 2 O, en 2,15 mmol NaHCO3 in dubbel gedistilleerd water (DDH 2 O) door roeren gedurende de nacht. Voeg 5 mM HEPES pH 8,0, en controleer / breng de pH op 8,0. Bewaar de ASWH bij 4 ° C. Warm het tot 18 ° C en filteren met filter papier voor gebruik. Bereid 20x geïnactiveerd dechorionation oplossing: 20% natrium thioglycolaat, 1% pronase in ASWH. WINKEL 500 gl aliquots bij -20 ° C, en verdund tot een eindvolume van 10 ml ASWH vóór gebruik. Bereid 15 tot 20 kweekschalen van de eitjes / embryo. Pour gesmolten 1% agarose in ASWH tot 3,5, 5, 9 of 15 cm petrischalen, coaten met een 1-2 mm dikke laag.Laat de agarose stollen en bedek de platen met ASWH. Voorraad ze bij 4 ° C gedurende maximaal 1-2 weken. Vervang de ASWH voor gebruik. Bereid speciale injectie gerechten. Giet een 5-7 mm dikke laag gesmolten 1% agarose in een 5 cm petrischaal en plaats een schimmel op de agarose (zoals een hersluitbare sluiting verlijmd op een plastic dekglaasje) een inkeping produceren na stollen van de agar die kunnen de eieren te houden. Bereid 4-5 injectie gerechten en bedek met ASWH. Bewaar bij 4 ° C en te vervangen door frisse ASWH voor gebruik. Gebruik alleen verse platen voor injectie (maximaal één dag oud). Bereid β-galactosidase (LacZ) vlekken buffer: 1 mM MgCl2 · 6H 2 O 3 mm K4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O 3 mm K 3 [Fe (CN) 6] in fosfaat-gebufferd zoutoplossing (PBS) met Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2PO 4, 0,05% Tween). wINKEL ikn het donker bij 4 ° C. Bereid LacZ substraat 5-broom-4-chloor-3-indolyl-ß-D galactopyranoside (X-gal, 10 U / ml) in porties van 40 mg / ml in dimethylformamide (DMF) en voorraden bewaar bij -20 ° C tot gebruiken. Geniet Pasteurpipetten in leidingwater 's nachts om te voorkomen dat de embryo's kleven. Bereid injectienaalden. Het opzetten van een micropipet trekker bij omstandigheden zoals hitte 425, trekt 75, snelheid 75 en 200 keer (uit een filament ramp test van de 415). Trek 4-5-filament met glas haarvaten tot 8 tot 10 lange, fijne naalden normaal gesloten aan het uiteinde te produceren. Bewaar de naalden in een stofvrije naald doos, verbonden aan plakband verdubbelen op een verhoogde steun, om te voorkomen dat het breken van de tips en die handig is voor de naald vulling. LET OP: Test de verkregen naalden door het injecteren van een paar eieren met groene vitale kleurstof (zoals beschreven in hoofdstuk 6) en stel de naald trekken voorwaarden om een ​​tip vorm die het mogelijk maakt voor verfijnd en repetit verkrijgenive injectie zoals beschreven in 6.6. Bereid injectieoplossing. Bereid 4 pl injectieoplossing, bijvoorbeeld bestaande uit 1 pi 2 mM MO, 2 pl 10 ug / ul groene vitale kleurstof en 1 pl DDH 2 O. Voeg een uiteindelijke concentratie van 0,05-0,5 ug / ul capped mRNA of 20 ng / ul plasmide-DNA volgens de wetenschappelijke vraag. Goed mengen. Houd op het ijs als de oplossing bevat mRNA. 2. Het verzamelen van gameten Ontleden Ciona volwassenen in een 18 ° C afgekoeld embryo kamer. Gebruik maken van kleine schaar en begin van het einde dat de hevels verzet aan de zijkant van het uitademen (kortere) sifon waaronder de eileider en het sperma kanaal run. Maak de eileider en subtiel een insnijding in de eileider met de punt van de schaar. Laat de uitstromende eieren direct in een 6-wells plaat met ASWH door zachtjes te drukken op de eileider met de gesloten schaar strippen van de bvgs. Breng de overgebleven eieren met een Pasteur pipet pre-gespoeld met ASWH. Stort de eieren van verschillende dieren in verschillende putten. Let op de kwaliteit van de eieren onder het ontleden scope. LET OP: Goed ontwikkeld eieren zijn rond en roze tot lichtgeel van kleur. Zij worden omgeven door een niet-cellulair vitelline laag, het chorion dat een goed gedefinieerde perivitelline ruimte rond het ei vormt. Het chorion is geassocieerd met testcellen aan zijn binnenzijde en stervormige follikel cellen op zijn buitenzijde. Eieren van lage kwaliteit hebben vaak niet de perivitelline ruimte of de follikel cellen. Ze lijken meer ronde, gedetailleerdere of anders van kleur. Onrijpe eicellen zijn kleiner en hebben een zilveren witte kleur. Snijd de zaadleider met de schaar en verzamel geconcentreerd sperma in een 1,5 ml buis met een aparte Pasteur pipet. Verzamel de sperma van verschillende dieren (ten minste twee) in dezelfde buis. WINKEL sperma bij 4 ° C gedurende enkele dagen. 3.Bevruchting Verzamel sperma en eicellen bij 18 ° C zoals beschreven in stap 2. Activeer het sperma. Bereid 1 ml ASWH in een 1,5 ml buis en meng met 50 ui 1 M Tris pH 9,5. voeg 20 ul geconcentreerd sperma en meng door het buisje. Controleer of het sperma activering in een druppel sperma geplaatst op een cover van een kleine petrischaal of een glasplaatje en te observeren onder het ontleden scope. De spermatozoïden moet verwoed zwemmen. Voeg 100-200 ul van de geactiveerde sperma oplossing in elk putje van eieren (die tussen 100 en 1000 eieren), meng goed door en neer te pipetteren, zodat de eieren zweven in het medium. Wacht 10 minuten zonder de embryo's. 4. Dechorionation van eieren en embryo's Verdun een 500 pi hoeveelheid van 20x dechorionation oplossing van 10 ml in ASWH. Activeer de dechorionation door toevoeging druppelsgewijze 200 gl 2.5 M NaOH aan de 10 ml 1x dechorionation oplossing. Een melkachtige neerslag zal vormen. Meng door het omkeren van de buis. Verzamel de eieren of zygoten (na 10 min wachten in stap 3.3) in glazen buizen met behulp van een Pasteur pipet. de eieren Pool 2-3 dieren in één buis (ongeveer 1000-5000 eieren / tube). Sediment met een hand centrifuge door het draaien op hoge snelheid (1200 x g) gedurende ongeveer 20 seconden om een ​​embryo pellet op de bodem van de buis te vormen. Langzaam stoppen met de centrifuge en verwijder de ASWH met een Pasteur pipet. Voeg 4 ml geactiveerde dechorionation oplossing van het gepelleteerde eieren / zygoten in elke buis. Hang de eieren / zygoten door ze voorzichtig en neer te pipetteren met behulp van een kraan met water behandelde Pasteur pipet overgoten met een kleine rubberen peer. De oplossing moet gelige slaan na 1-3 min. Volg de dechorionation door het verwijderen van een kleine hoeveelheid van de dechorionating ei / zygote ophanging met behulp van het Pasteur pipet. Stort een druppel op een glijbaan en observeren onder het ontleden shet hoofd te bieden. Houd pipetteren eieren / zygotes op en neer en laat elke 20-30 sec. LET OP: De eerste follikel cellen los, dan is de chorion wordt geel en ondoorzichtig, en tenslotte los van de zygoten. Roze dechorionated eieren / zygoten zal zinken naar de bodem van de glazen buis. De dechorionation zou niet meer dan max. 5 minuten. Vul de buis met ASWH eens 50% van de eieren / zygoten worden dechorionated. OPMERKING: Heel voorzichtig centrifugeren (8 xg) gedurende ongeveer 10-15 seconden dat ze een zeer lage snelheid net genoeg om de dechorionated eitjes / embryo sedimenteren. Langzaam stop de centrifuge om de pellet eieren / zygoten niet verstoren op de bodem van de buis. Verwijdert nagenoeg alle vloeistof uit de glazen buis onder het drijvende materiaal met onvolledig dechorionated eieren / zygoten en vervangen ASWH. pipet langzaam op en neer te wassen en voorzichtig weer gecentrifugeerd zoals in stap 4.2. Als alternatief, wacht zygoten te vestigen door de zwaartekracht. Was eenmaal meer tot er geen chorion puin is left. Transfer eieren / zygoten naar vers gespoeld cultuur gerechten met behulp van een Pasteur pipet. Houd de zygoten (geen eieren) met een lage dichtheid (ongeveer 200 embryo's per 10 cm schotel) om hun kleven samen te vermijden. Cultuur van de embryo's naar de gewenste fase bij temperaturen tussen 13 en 20 ° C. Als alternatief electroporate de zygoten (Stap 5) of injecteer de onbevruchte eitjes (Stap 6). 5. Elektroporatie Bevruchten de eieren en dechorionate de zygoten bij 18 ° C als in de secties 3 en 4. Zorg voor tussen de 50 en 400 eieren per elektroporatie monster. Bereid 50 pi plasmide-DNA in een 1,5 ml buis (max. 100 ug plasmide-DNA in 50 pl DDH 2 O) en voeg 200 ul 0,95 M mannitol. Meng goed door vortexen. Dispatch en de zwaartekracht sedimenteren de dechorionated zygotes in gesiliconiseerde 1,5 ml buizen. Verwijder de ASWH naar de 100 ul markering op de buis. Gaat achtereenvolgens voor elke zygote buis als volgt: voegDNA / mannitol oplossing wordt met een pasteurpipet. Meng met de zygoten en onmiddellijk het nemen van de DNA / mannitol / zygote schorsing en overplaatsing naar een 4 mm elektroporatie cuvette. Plaats de cuvette direct in de elektroporatie houder en geven een enkele puls van 16 ms bij 50 V. Verwijder de zygoten uit de cuvette met dezelfde Pasteur pipet en spreid ze uit op een cultuur schotel met vers en gefilterd ASWH. Pipetteer de zygoten voordat ze beginnen met het splitsen van ongeveer 1 uur na de bevruchting (HPF) bij 18 ° C. Spoel de pipet tussen de monsters in een beker ASWH. De cultuur van de zygoten bij 15-20 ° C bij laag genoeg dichtheid van ongeveer 200 embryo's per 10 cm schotel aan hun kleven samen te vermijden. 6. Micro-injectie Bereid dechorionated Eieren voor de injectie. Dechorionate de eieren los, 2-4 dieren, zoals beschreven in paragraaf 4. Houd de onbevruchte en dechorionated eGGS in aparte kleine agarose gecoate cultuur gerechten. Was de eieren meermaals in de schalen in het vuil te verwijderen. Test bevruchten kleine batches van de dechorionated eieren (ongeveer 50) van elk individu. Gebruik een aparte 5 cm schotel voor elke partij en 2 pl toepassen geactiveerd sperma (stap 3.2). Meng goed door zwenken van de gerechten en verspreid de eieren in de schaal door het bewegen van de gerechten zijwaarts. Houd het sperma en eicellen tezamen ongeveer 10 minuten zonder te bewegen. Elimineer een maximum van sperma als volgt: de overdracht van de bevruchte eieren naar een nieuwe cultuur schotel of spoel tweemaal met verse ASWH. Laat de splitsende embryo onverstoord tot aan het 32-cellig stadium (bij 18 ° C gedurende ongeveer 3 uur na de bevruchting). Kies eieren van de beste ontwikkeling van batch (beste percentage van de bevruchting en de meest regelmatige splitsing patroon) voor de micro-injectie. Stel de injectienaalden. Backfill 4 injectienaalden in een verticale positie om de ernst flow langs het filament. Deposit 0,5 pl injectieoplossing (stap 1,8) met groene vitale kleurstof op de achterkant van de naalden die gepositioneerd naaldpunt naar beneden. Wacht tot de vloeistof de naaldpunt onderaan vullen. Verplaats de naalden horizontaal en opvulling ze met minerale olie met een fijne en lange metalen of plastic pipet tip. overlay langzaam de oplossing voor injectie met minerale olie verdrijven van alle luchtbellen tijdens het vullen van de naald. Stel de micromanipulator in een 18 ° C gekoelde ruimte. Sluit de plastic slang van de naaldhouder een 10 ml glazen injectiespuit gevuld met minerale olie. Backfill de slang en de naald houder met olie en te verdrijven eventuele luchtbellen. Steek de naald in de naaldhouder en de positie van de houder op de micromanipulator. Stel de naaldhouder beweging langs een rechte lijn onder een hoek van 45 ° ten opzichte van het oppervlak. Richt de dechorionated eieren langs de agarose inspringing van de injectie schotel, zodat de eieren geïnjecteerd worden één voor één onder de dissectie microscoop. Breek de naald, indien nodig, door voorzichtig de naald duwen tegen de agarose of tegen een stuk glas dekglas geplaatst op de agarose. Iets druk de spuit knop om te controleren of de naald open is (groen inhoud naald zal verdrijven). Injecteer de onbevruchte eitjes een voor een door eerst inbrengen van de naald in het ei en iets opzuigen om het ei membraan gevolgd door injectie breken. Injecteer groene injectieoplossing in het midden van het ei tot maximaal 1/3 van de celdiameter. (Dit komt overeen met ongeveer 30 pl per ei diameter van 140 um). Breng de geïnjecteerde onbevruchte eieren vers kweekschaal en incubeer ze bij 15-18 ° C tot bevruchting. Bemesten van de geïnjecteerde eieren met vers geactiveerde sperma als in de test bevruchtingen (stap 6.1.2). eliminatea maximum van het sperma door het overbrengen van de zygoten een nieuwe kweekschaal. Spreid de embryo's en ze niet verstoren tijdens de splitsing stadia (tot aan de 32-cel fase). Cultuur van de embryo's naar de gewenste fase bij een temperatuur tussen 13 en 20 ° C. Verzamelen van de embryo's door wervelen ze in het midden van de plaat en breng deze in gesiliconiseerde 1,5 ml buizen. Fix en vlekken, of bevestig (stappen 7 en 8). Vergelijk deze fenotypen van de controle geïnjecteerde embryo. OPMERKING: Injecteer een tweede, niet-overlappende MO dat hetzelfde transcript richt identieke fenotypen verkrijgen. Red de specifieke MO fenotype (s) met een gewijzigde mRNA dat codeert voor uw eiwit van belang, maar dat wordt door de MOS niet herkend. Injecteren een controle MO die geen fenotype geeft. 7. LacZ kleuring Het verzamelen van de embryo's op een gewenst stadium in gesiliconiseerde 1,5 ml buizen en ze op te lossen in 0,2% glutaaraldehyde in 1 ml ASWH voor 15tot maximum 30 min. Was de 2x 10 minuten met 1 ml 1x PBT. Spoel eenmaal in 500 pl buffer LacZ kleuring. Vervangen door X-gal-substraat aangevuld met 1 ml kleurbuffer (gebruik 10 ul / ml 40 mg / ml X-Gal voorraad). Overdracht van de embryo's in een 12 wells plaat voor een betere waarneming van de kleuring. Incubeer in het donker. Variëren incubatie van 0,5 uur tot een nacht bij 4 ° C, bij kamertemperatuur of bij 37 ° C afhankelijk van de sterkte van de bestuurder LacZ expressie. Was de embryo tot 4 maal in 1 ml 1X PBT buffer om vlekken te verwijderen. Post-oplossing voor 10 min bij kamertemperatuur met 2% paraformaldehyde (PFA) in 1 ml 1x PBT of 0,2% glutaaraldehyde in 1 ml 1x PBT voor interpretatie en visualisatie van de gekleurde embryo. 8. Montage van fluorescent gelabelde Wmbryos Bevestig de embryo's van een gewenste ontwikkelingsstadium gedurende 20 minuten in 2% PFA in 1 ml ASWH. Was de embryo's 2x in 1 ml 1x PBT. Vermijd licht expoure door het houden van de embryo's in donkere omstandigheden. Transfer tot 50 embryo's op één dia. Verwijderen maximaal PBT eerst met een pipet en voorzichtig met een papieren handdoek. Voeg 20-25 ul montage medium. Voeg een dekglaasje door het positioneren in een hoek (van de ene kant eerst) en langzaam laten zakken met een puntig voorwerp (naald, pincet, pipet tip) het vermijden van luchtbellen tot het monster wordt gedekt. Bevestig de dekglaasje aan de randen met behulp van punten van een transparante nagellak. Sluit de hele dekglaasje met nagellak na het drogen. Bewaren in het donker bij -20 ° C.

Representative Results

Micro-injectie voor genregulerend netwerk studies Embryo's van ascidian Ciona intestinalis zijn zeer geschikt voor functionele gen of gen regulerende studies op cellijn niveau en cellulaire resolutie. mRNA's, MO's of labels kunnen worden micro-injectie in de onbevruchte eicel of in individuele blastomeren na de bevruchting. MO gemedieerde gen knockdown met behulp van de micro-injectie techniek wordt beschreven in stap 6 MOs specifiek richten op het mRNA van geselecteerde genen en hun vertaling in het eiwit te voorkomen. MO gemedieerde loss-of-function (LOF) van ontwikkelings-genen verandert de uitdrukking van een breed scala van downstream genen, over het algemeen het onthullen van een blik in de embryonale GRN 10. Dergelijke analyses in Ciona op voorwaarde dat de eerste hele embryo regelgeving blauwdruk in een metazoan 11. Figuur 1 geeft een voorbeeld van hoe microinjection werd gebruikt om de stroomopwaartse regulatie van de expressie van de geconserveerde Ci -Myelin transcriptiefactor (Ci -MYT) en gastrulastadium van Ciona embryo bestuderen. Gevolgd door in situ hybridisatie (ISH), endogene expressie (Figuur 1a schematisch in figuur 1a) is waargenomen in de 6-rij neurale plaat voorlopers van met name de hersenen (rijen III / IV, rood) en het ruggenmerg ( ik rij, in het groen). Bovendien werd Ci -MYT stroomopwaarts regulering geanalyseerd MO injectie targeting verschillende factoren die zijn uitgedrukt in of nabij neurale precursors vóór Ci -MYT expressie aanzet (figuur 1b-g). MO knockdown van vroege embryonale factoren, zoals de Forkhead box Aa (Foxá-a) transcriptiefactor en de fibroblast groeifactor 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (Figuur 1b of 1c respectievelijk) elimineert algemeen Ci -MYT uitdrukking. Andere transcriptiefactorenslechts gedeeltelijk invloed Ci -MYT leidend tot MO-gemedieerde downregulatie in een subset van hersenen precursors (blauwe pijlpunten in figuur 1d, f en g). Omgekeerd is Ci -MYT expressie ectopisch geactiveerd na downregulatie van Nodal (figuur 1e, rode pijl koppen), wat suggereert dat Nodal normaal onderdrukt Ci -MYT meningsuiting in deze laterale zenuwkoord voorlopers. Elektroporatie voor efficiënte gen functioneel en enhancer studies Elektroporatie plasmide DNA in Ciona zygoten is een efficiënte methode voor transiënte transgenese en daaropvolgende observatie van fenotypische veranderingen in vivo. In tegenstelling tot micro-injectie van mRNA elektroporatie maakt weefselspecifieke overexpressie, waarin gen coderende gebieden (ORF, open reading frames) worden tot expressie gebracht onder controleweefsel specifieke drivers. Deze vormen gewoonlijk cis gebieden van regelgevende bekende genen (zoals het brachyury versterker voor expressie in notochord voorlopers 8). Omgekeerd elektroporatie is een randvoorwaarde voor de efficiënte analyse van nieuwe regulerende gebieden waar reportergenen (LacZ of groen fluorescent eiwit, GFP) onthullen hun activiteit in vivo. De workflow identificatie- en daaropvolgende elektroporatie gemedieerde analyse van dergelijke nieuwe regulerend gebied (voor Ci -MYT) wordt getoond in figuur 2. Een uitgebreid repertoire van Ciona gemeenschap gegevens, gemakkelijk toegankelijk in ascidian specifieke genoom browsers 12,13, net als de Ascidian Network for In situ Expression en Embryologische Data (ANIJSZAAD) 23, wordt geïnspecteerd op de in silico identificatie van regulerende gebieden (Figuur 2A). Daaropvolgende polymerasekettingreactie (PCR) gebaseerde klonering van deze gebieden in expressievectoren maakt elektroporatie gemedieerde testen in vivo. (Figuur 2B). Het genoom browser screen-shot in figuur 2A toont het stroomopwaartse gebied van het KH transcript model voor Ci -MYT (eerste drie exons, in oranje, en twee introns zijn zichtbaar). Verschillende tracks genoom browser annoteren functionele gegevens genoom voorspeld voor deze regio, zoals chromatine immunoprecipitatie (ChIP) data 14 (hier afgebeeld voor ZicL, Ci -zinc vinger van het cerebellum L), behoud sequentie tussen twee verwante soorten Ciona 15,24 of nucleosoom bezettingsgraad 16,17 (van boven naar beneden in figuur 2A). In het algemeen worden exon-eiwit coderende gebieden zeer geconserveerd (aanpassing track in figuur 2A). Uitbreiding met behoud pieken verschijnen in niet-coderende gebieden stroomopwaarts en in het eerste intron. Twee daarvan wordt voorspeld dat nucleosoom gratis een te zijnolgens een sequentie gebaseerde algoritme 16,17 (rode frames in figuur 2A) suggereert toegankelijkheid van transcriptiefactoren. Inderdaad, chip-on-chip signalen 14 voor Ci -ZicL transcriptiefactorbindingsplaatsen (groene balken in Figuur 2A) zijn verrijkt in deze twee geconserveerde gebieden. Bovenal, door een interface 25 dat zoekt naar potentiële transcriptiefactor bindingsplaatsen, identificeerden we ZIC vestigingen binnen de genoomsequenties gekenmerkt door Ci -ZicL ChIP clusters (oranje pijlen en sequenties met onderstreepte ZIC-kern, Figuur 2A). De binding van Ci -ZicL transcriptiefactor in geconserveerde en voorspelbaar nucleosoom gratis regulerende gebieden van Ci -MYT is in overeenstemming met de neerwaartse regulatie van Ci -MYT expressie waargenomen in MO-injectie gemedieerde knockdown experimenten richten ZicL (figuur 1d). na afschrikkenmijnbouw potentiële cis van regelgevende regio's in silico voor Ci -MYT expressie, worden deze PCR vermeerderd uit Ciona genoom DNA en ingebracht door recombinatie kloneren in LacZ reporter plasmiden 19. De constructen worden vervolgens geëlektroporeerd in bevruchte eieren Ciona (figuur 2B) en geanalyseerd op activiteit met LacZ kleuring (figuur 3). Figuur 3 laat zien dat een dergelijke in silico benadering was het mogelijk om twee afzonderlijke cis van regelgevende sequenties die Ci -MYT mRNA expressie domeinen (vergelijk figuur 1a) recapituleren identificeren. In het algemeen, transient transgene embryo's geëlektroporeerd met plasmide DNA-show mozaïek expressie in alleen die cellen die het DNA hebben opgenomen. Mosaic LacZ expressie wordt dus aangedreven door pmyt-R3 en kan worden gevonden in alle voorlopers die ook te uiten Ci </em> -MYT MRNA ie neurale plaat voorlopers van de laatste rij I en de voorste rijen III / IV in gastrula en vroege stadia neurula (Figuur 3a, b, paars en rood pijlpunten respectievelijk). In tegenstelling pmyt-R5 is alleen actief in de posterieure (rij I) neurale plaat precursoren en beginnen bij de latere neurula stadium (figuur 3c, rode pijl koppen). De twee regio's dus coderen voor twee aparte ruimtelijke en temporele aspecten van Ci-myt genregulatie. Interessant is dat beide regulerende gebieden ook vlekken bijkomende precursors niet gezien in het ISH, met name in de voorste en laterale neurale plaat en in de spieren (figuur 3a, b, roze, wit, geel en pijlpunten, respectievelijk). Ruimere uitdrukking kunnen wijzen op elementen die niet zijn opgenomen in de geïsoleerde regulerende fragmenten repressieve (zoals Nodal dat laterale neurale lot onderdrukt, zie Figuur 1e) of lage expressie niveaus gedetecteerd met accumulerenLacZ enzymatische signaal. Naast enhancer studies, elektroporatie in Ciona maakt ook de functionele analyse van Ciona coderende genen hun overexpressie. Een grote verzameling van Ciona full length ORF's is beschikbaar voor de gemeenschap, en werd bovendien geannoteerd voor menselijke orthologen, met inbegrip van ziekte-geassocieerde genen 18. Individuele genen of groepen genen van deze recombinatie klonering uitwisselbaar totaal ORF cDNA (figuur 2B) worden gemakkelijk omgezet in bestemming vectoren die geschikte stuurprogramma worden uitgedrukt in embryo. Resulterende expressie klonen kan verder worden samen geëlektroporeerd met cis van regelgevende reporter constructen om hun vermeende rol in de enhancer activering te testen. Figuur 2B illustreert de isolatie van volledige ORF-klonen voor de transcriptiefactoren Ci -ZicL en CI-GATAa en hun recombination in aangepaste bestemming vectoren die translationele labels 19 (bijvoorbeeld groen fluorescerend Venus- of virale hemagglutinine (HA) -tag) en een weefsel specifieke driver kunnen bevatten, zoals een vriend van Gata regulerend gebied (pfog driver) voor de vroege pan-ectodermale expressie 15 gebruikt in de onderhavige studie. Het effect van Ci -ZicL overexpressie in ectodermale en neuroectodermale weefsels werd geanalyseerd door co-elektroporatie van pmyt-R3> LacZ en pmyt-R5> LacZ reporters (figuur 3b ', b' en c ', c' ', respectievelijk). Onze elektroporatie analyses suggereren dat Ci -ZicL Ci -MYT expressie kan activeren via pmyt-R3 en R5-pmyt enhancergebieden zowel reporter constructen vertoonden LacZ ectopische expressie in ectodermale gebieden (groene pijlpunten in figuur 3b ', b' en c &# 39;, c ''). Zoals getoond in figuur 3d, elektroporatie plasmide DNA in honderden Ciona eieren maakt statistisch relevante kwantificering van expressie veranderingen geïllustreerd voor ectopische pmyt-R3> LacZ expressie na concentratieafhankelijke, pan-ectodermale Ci -ZicL expressie. Elektroporatie in vivo subcellulaire lokalisatie Figuur 4 toont de subcellulaire lokalisatie van gemerkte transcriptiefactoren bij expressie bij elektroporatie in ectodermale blastomeren gebruik aangepast expressieconstructen (schematisch in figuur 2B). Door C-terminaal tagging transcriptiefactoren (zoals Ci -GATAa) met een Venus tag (figuur 4b) of een HA-label (Figuur 4c) en overexpressie ze in ectodermale weefsels (pfog) Kunnen we zien dat in vivo, "Ci -GATAa wordt meestal gelokaliseerd kernen, zoals verwacht voor een transcriptiefactor, terwijl Venus expressie alomtegenwoordig, het cytoplasma. Soortgelijke experimenten worden uitgevoerd om de dynamiek van subcellulaire lokalisatie in de tijd te bestuderen, afzonderlijke of combinaties van transcriptiefactoren, eventueel onthullen de co-localisatie met verschillende labels. Figuur 1:. Het beoordelen van Ci -MYT regelgeving door micro-injectie in Ciona eieren Ci -MYT mRNA expressie in WT en Morfolino (MO) geïnjecteerde embryo's. (A) WT expressiepatroon van Ci -MYT in de neurale plaat. (A) Schematische weergave van gebrandschilderd precursoren in de neurale plaat (NP). Rij I / II: posterior neurale lot; rij III / IV: anterior neurale lot; rij V / VI: palp lot. ( <stron.. g> b – g) Ci -MYT expressie na micro-injectie van diverse MO's voor het neerhalen aangegeven genen die deelnemen aan het begin van de Ciona GRN (foto's aangepast van Imai et al, 2006) 11 Ci -MYT, Ci -myelin transcriptiefactor; WT, wild-type; blauw pijlpunten: verlies van Ci -MYT signaal; rode pijlpunten: buitenbaarmoederlijke Ci -MYT signaal. Schaal bar = 100 micrometer verwijst naar alle foto's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: workflow in silico zoek versterkergebieden en recombinatie klonering voor transiënte transgenese door elektroporatie in Ciona embryo (A) Een momentopname van de ANIJSZAAD 23 ASCI.Dian genoom browser identificeert stroomopwaarts regulerende sequenties van Ci – MYT. Red frames markeren twee potentiële cis van regelgevende regio's, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) en pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041), die voor analyse werden geselecteerd door elektroporatie. Namen van de tracks: ZicL probes: Chip-on-Chip gegevens 14; KH2012 Afschriften: doorschijnende zakpijp transcript modellen; Alignment Score Cs / Ci LastZ: behoud sequentie tussen Ciona savignyi (Cs) / doorschijnende zakpijp (Ci) 15,24; . Segal 2006 voorspelde nucleosoom bezetting versie 1: kuiken opgeleid computationele algoritme door Segal et al, 2006 16 toegepast op Ci zoals in Khoueiry et al, 2010 17 Green bars.. Ci -ZicL ChIP pieken 14; oranje pijlen: voorspelde ZIC locaties; GCTG: kern ZIC bindingsplaats. (B) Regeling voor het genereren van overexpressie constructies uit een Cieeen full length ORF cDNA bibliotheek, gerecombineerd in bestemming vectoren die weefsel-specifieke drivers (pfog) en eiwit-tags vervolgens co-geëlektroporeerd met reporter constructen (zoals pmyt-R3> LacZ of pmyt-R5> LacZ) voor in vivo uitlezing Ci. – MYT, Ci -myelin transcriptiefactor; Ci -ZicL, Ci -Zinc vinger van het cerebellum L transcriptiefactor;. pfog, regulerende gebied van Ci -vriend van GATA klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: geëlektroporeerd Ciona embryo's laten zien Ci -ZicL induceerbare tijdruimtelijke cis -regeling van Ci -MYT LacZ gekleurd embryo's in het mid-gastrul.a (Mg) / late-gastrulastadium (Lg) of vroeg neurula (EN) stadium worden getoond die zijn co-geëlektroporeerd met ofwel pmyt-R3> LacZ of pmyt-R5> LacZ en een controle-construct (pfog> mCherry) of pfog> ZicL. De pfog bestuurder 19 bemiddelt buitenbaarmoederlijke (pan-dierlijke) ZicL expressie in ectoderm en neuroectoderm en veroorzaakt buitenbaarmoederlijke LacZ vlek in deze cellen. (A) pmyt-R3 LacZ activiteit in mg / GRA stadium embryo's (kleine pijlpunten, linker paneel) of in een overeenkomstig gekleurd schematische gebieden (blauwe cirkels, rechter paneel); plantaardige view (vg). Rij I / II: posterior neurale lot; Rij III / IV: anterior neurale lot; Rij V / VI: palp lot. (B) R3 pmyt-activiteit bij eN fasen van weefsels in. (B) buitenbaarmoederlijke pmyt-R3 activiteit op Ci -ZicL co-elektroporatie wordt aangegeven door groene pijlen. (B '') Dezelfde embryo's als in b ', georiënteerd dier pole up (een). ( <strong> c) pmyt-R5 LacZ activiteit bij eN stadia (c ') buitenbaarmoederlijke pmyt-R5 activiteit op Ci -ZicL co-elektroporatie wordt aangegeven door groene pijlen. (C '') Dezelfde embryo's als in c ', maar georiënteerd dier pole up (een). (D) Kwantificering van representatieve experimenten Ci -ZicL over-activerende pmyt-R3 bij lage concentraties. Een biologische repeat is vertegenwoordigd Ci -MYT, Ci -myelin transcriptiefactor;. Ci -ZicL, Ci -Zinc vinger van het cerebellum L transcriptiefactor; Ci -FOG, Ci -vriend van GATA; WT, wild-type; Mg, mid-gastrulastadium; LG, late-gastrulastadium; EN, vroeg neurula; een, dier uitzicht; vg, plantaardige bekijken; NLS LacZ, nucleair lokalisatiesignaal voor LacZ. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4:. Differential subcellulaire lokalisatie van eiwitten bij elektroporatie lokalisatie van Venus-tagged of Hemagglutinin- (HA) gemerkte eiwitten tot overexpressie gebracht in ectodermale cellen met behulp van de pfog driver 19. (A – c) DIC beelden. (A ', b') Overeenkomstige fluorescentiebeelden. (C) het fluorescentie Overeenkomstige bij immuun histologische labeling met TRITC. Schaal bar = 100 micrometer verwijst naar alle afbeeldingen. DIC, Differentieel Interferentie Contrast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Er zijn twee belangrijke technieken om transgene embryo Ciona genereren: micro-injectie van RNA of DNA en elektroporatie van DNA. Deze technieken voor gen verstoring in Ciona embryo's werden eerst gebruikt in de jaren 1990 en 7,8 voortaan achtereenvolgens verbeterd en nu gebruikt in Ciona (en andere genera ascidian) 20 wereldwijd.

Kritische stappen in het protocol

Succesvol transgenese in Ciona gameten die gemakkelijk kunnen worden verzameld uit volwassen dieren afhankelijk van een aantal kritische factoren. De kwaliteit van gameten is afhankelijk van het paaiseizoen (in het algemeen van mei tot december in het Noord-Atlantische Oceaan, veranderen met de temperatuur van het water en zuurstof), over de kwaliteit van het zeewater in de aquaria (op de juiste zoutgehalte, volwassenen gezond blijven voor 2-4 weken) en tenslotte op correcte afhandeling van gameten bij extractie uit volwassenen, zoals hieronder beschreven voor de verschillende stappen in deprotocol.

Tijdens de voorbereiding stappen, incubatie Pasteur pipetten met leidingwater voorkomt embryo's kleven en zeewater pre-incubatie van-agarose beklede petrischaaltjes zullen giftige stoffen vrijkomen uit de agarose te verwijderen. In het algemeen kan gerechten worden bereid 2 weken vóór gebruik bewaard bij 4 ° C om bacteriële groei te voorkomen en vers gespoeld vóór gebruik. Op een dag oud, kleine gerechten lijken best voor injecties.

Efficiëntie en de lengte van dechorionation is een cruciale stap in het protocol zoals langdurige behandeling van de eieren / embryo's zal schaden ontwikkeling. Zorgvuldige voorbereiding (zonder schudden) en correcte opslag (bij 4 ° C gedurende maximaal een week) behoud van de kwaliteit van de dechorionation oplossing. Proteasen de oplossing verliezen efficiëntie als hetzij gemengd te heftig in voorbereiding of in de tijd, met name wanneer bewaard bij kamertemperatuur gedurende meer uren / dag. We hebben deze cruciale stap voor het gebruik van verse dechorionation oplossing gunstig geoptimaliseerdbereid uit bevroren fracties van 20x voorraadoplossing.

Correcte afhandeling van fragiele dechorionated eitjes / embryo's is van essentieel belang en het scheren of steekpartij van embryo terwijl pipetteren schadelijk zal zijn. Wanneer pipetteren, embryo's worden gehandhaafd zoveel mogelijk in suspensie (door voorzichtig "blazen" vloeistof te werveling gevolgd door gladde maar snel pipetteren), terwijl de glazen pipet in verticale plaats van horizontaal. Deze zorg is van toepassing op alle pipetteerstappen voor het wassen, resuspensie en overdracht van eieren / embryo in en uit buizen, cuvetten of platen, voor en na fixatie. Na fixatie, moet speciale zorg worden genomen om afzonderlijke pipetteerapparaten voor levend versus vaste embryo's enige toxiciteit van resten van fixatieven te voorkomen.

Micro-injectie is vrij lastig in Ciona eitjes / embryo's als gevolg van hun kleine omvang en de veerkracht van de vitelline membraan en kritisch afhankelijk van een geoptimaliseerde tip grootte van dede injectienaald, een perfecte hoek van de injectie (naald beweging in één lijn, langs de radius ei) en een fijn afgestemde, handmatig breken van de vitelline membraan (door afzuigen voorafgaand aan de aspiratie voor injectie). Dit laatste is alleen mogelijk indien luchtbellen volledig worden uit de injectie buis die olie bevat voor het effenen van de zuig / injectiedruk. Bovendien zal de kleinste stukken stof en vuil ei de naald verstoppen, en worden gemakkelijk vermeden door een schone werkomgeving en wasstappen eieren vóór de overdracht op de injectie schotel. Na injectie, zal de overdracht van de eieren op verse gerechten toxische effecten van dode embryo's van de injectie procedure overleefd voorkomen.

Probleemoplossen

Eventuele problemen in de procedure kan worden aangepakt door de volgende oplossingen. Lage bemesting tarieven kunnen voortvloeien uit onvoldoende sperma activering, lage netheid ei of grote bevruchting volumes. gebruik freshly gepoold en minder verdund sperma. Controleer of het sperma beweging bij activering. Was de eieren ASWH voor de bevruchting zoals beschreven in stap 4.2. Verminder het watervolume en het aantal eieren per schaal bevruchting / putje verminderen. Verlies embryo tijdens de bereidingsstappen kan worden voorkomen door toevoeging van een druppel dechorionation oplossing efficiënter centrifuge door het undechorionated eitjes / embryo. Dechorionation tijd moet worden geoptimaliseerd als gedeeltelijk dechorionated eieren zullen niet sediment en langdurig dechorionation is giftig, waardoor de embryo's te ontploffen.

Asynchronous ontwikkeling kunnen voortvloeien uit de resterende sperma die vrijkomen tijdens dissectie. Houd het ei partijen gescheiden van verschillende dieren tot ongecontroleerde kruisbestuiving te voorkomen. Abnormale ontwikkeling kan verschillende oorzaken hebben. Aan het begin en aan het einde van het seizoen, na het houden van de embryo van verschillende individuen afgescheiden, de beste batches kunnen worden gekozen. Vermijd verstoren de embryo's voor de10 min dat de bevruchting te volgen om te voorkomen dat bemoeien met hun ooplasmic segregatie. Zorg ervoor dat de embryo's niet beginnen te delen terwijl ze overgedragen pipetteren scheidt de zus blastomeren en resulteert in een gedeeltelijke embryo's. Gebruik minder sperma voor dechorionated eieren polyspermy voorkomen. Gebruik vers bereide maar gespoeld agarose gerechten. Zorg ervoor dat het pipetteren apparaat fixatief gratis. Houd controle embryo's die niet werden dechorionated en niet geëlektroporeerd te detecteren bij welke stap de ontwikkeling werd verstoord. Vul het embryo met antibiotica als vervuiling en ontleding vindt.

Als de injectie apparaat heeft 'verstopt' de injectienaald opening kan worden gecontroleerd door het verdrijven van een aantal van haar lood content. Verstopping materiaal kan uitgeschakeld worden weggevaagd door voorzichtig de naald te slepen door de agarose. Luchtbellen in de injectie slangen en / of de naald moet worden verwijderd. Vervang de naald voor een betere controle van het volume injectie als het needle tip kan breken of verstoppen langs injectie. Spoel de eieren en leg ze in een schone injectie gerecht indien zich vuil in de schotel. Centrifugeer de injectieoplossing voor het vullen verse naalden om eventuele kleine deeltjes of kristallen neerslaan. Ook nuttig is het beoefenen van de injectie alleen met vitale kleurstof. Controleer de injectietechniek door bemesting geïnjecteerd en niet-geïnjecteerde eieren. Ten slotte, overleg met een ervaren collega kan nuttig zijn om injectietechniek te verbeteren.

Om te controleren voor off-target effecten een tweede niet-overlappende MO en redding met een gewijzigde mRNA die niet door de MOS wordt herkend kan getrouw uitsluiten dat niet-specifieke fenotypische effecten in Ciona.

Micro-injectie: betekenis en beperkingen

Microinjectie in Ciona werd gebruikt om de eerste blauwdruk voor een hele embryo genregulerend netwerk (GRN) genereren een chordate 11. Ondanks dergelijke remarkable prestatie, micro-injectie in Ciona embryo heeft beperkingen, door de relatief kleine omvang (0,14 mm diameter) van Ciona eieren. Vergeleken met die van andere ongewervelde soorten waar vreemd DNA / mRNA wordt geïntroduceerd door micro-injecties, Ciona eieren relatief moeilijk te hanteren en het percentage geïnjecteerde Ciona embryo per experiment blijft laag (gemiddeld 30 tot 50 embryo's per experiment), belemmeren kwantitatieve analyses. Niettemin om storende maternale factoren Ciona, micro-injectie van MO is de voorkeurswerkwijze ook hun betrokkenheid bij zygote begin van de ontwikkeling van de 16 tot 32 cellen stadia 15 bestuderen. Bovendien is het mogelijk echter veel moeilijker om de blastomeren microinject tot de 16-32 cellig stadium. Tenslotte microinjectie blijft de meest efficiënte techniek voor het genereren van transgene embryo's (van mRNA of DNA injectie) anders dan Ciona ascidian soorten, die volledig optimaliszed elektroporatie protocollen niet bestaan.

Elektroporatie: betekenis en beperkingen

De lage cijfers en andere beperkingen van micro-injectie overwinnen meeste Ciona gemeenschap elektroporatie plasmide DNA gebruikt omdat het werd ontwikkeld en gepubliceerd als geoptimaliseerd en gestandaardiseerd protocol Zeller et al. In 2004 9. Inderdaad duizenden transgene Ciona embryo kunnen worden gegenereerd binnen een uur tot 500 embryo tegelijkertijd geëlektroporeerd in een cuvette met een enkele 50 V puls van 16 msec. De aanpak van het genereren van grote aantallen van transgene embryo's is nog steeds uniek onder chordate model organismen. Dit heeft geleid tot Ciona snel erkend als een krachtige modelsysteem voor het uitvoeren van in vivo analyses van potentiële cis regio van regelgevende en cellulaire / subcellulaire lokalisatie, zoals hier toegelicht.

Hoewel electroporatiop in Ciona zygoten is fundamenteel het onderzoeksveld chordate GRN revolutie, de techniek gezichten toch een aantal beperkingen. Eerst worden plasmiden transient geïntroduceerd in Ciona embryo en zijn waarschijnlijk overgeërfd als extrachromosomaal arrays, waardoor de stabiliteit van plasmide-DNA geëlektroporeerd speculatief. Bovendien is het erg moeilijk, misschien zelfs onmogelijk, om de kopieën van plasmiden geëlektroporeerd die hoger per zygote wordt genomen beheersen, hetgeen leidt tot fenotypische schommelingen. Een verder probleem dat het moeilijk te interpreteren resultaten elektroporatie maakt is een fenomeen dat we mosaïcisme noemen. Geëlektroporeerd plasmide-DNA kan worden opgenomen op verschillende posities van de een-cellig stadium embryo; die bepaalt welke en hoeveel kwart van de zygote plasmide zal ontvangen te worden overgenomen door de afstammeling blastomeren. Dergelijke variaties duidelijk maken van de interpretatie van de kwantitatieve effecten moeilijker. Echter, de meeste problemen die komen met electroporatie variabiliteit worden opgelost door een geschikte hoeveelheid biologische monsters, het tellen en statistieken van LacZ (of GFP) positieve cellen, die gemakkelijk verkrijgbaar is in één batch.

Veelzijdigheid en potentie van elektroporatie gentechnologie

Elektroporatie zorgt uiteindelijk voor mid-throughput screening van potentiële cis regio van regelgevende en kwantitatieve analyse van genfunctie eenmaal gekloneerd in expressieplasmiden of reporter. Door de compacte Ciona genoom, identificeren en kloneren van potentiële regulerende gebieden is vrij eenvoudig 3. Een strategie voor het gebruik van de rijkdom van de gemeenschap data wordt gedemonstreerd in figuur 2A. Klonen van reporter en gen-coderende plasmiden wordt verder vergemakkelijkt door het genereren van Ciona aangepast, GATEWAY compatibel vector suites 19 en een compatibele full length ORF bibliotheek 18. Beide instrumenten zijn beschikbaar voor de gemeenschap eneen doelmatig, restrictie-enzym-vrij recombinatie regelgevende's en coderende gebieden, zoals weergegeven in figuur 2B.

De laatste jaren werd elektroporatie succes aangepast om weefsel doelgen manipulatie van plasmiden die genen bewerkingsgereedschappen zoals CRISPR / Cas9 onderdelen onder controle van weefselspecifieke expressie drivers 21,22 realiseren. Een dergelijke aanpak zal snel vooruit ons begrip van de dynamiek van GRNs en de potentieel geconserveerd signalering mechanismen, waaronder transcriptie die betrokken zijn bij de vorming van tissue factor codes en de stapsgewijze verlaten van pluripotentie. Bovendien zal weefselspecifieke verlies- of gain-of-function benaderingen (door CRISPR / Cas9 of overexpressie) via elektroporatie wat belangrijk is voor Ciona orthologen van mens-geassocieerde genen te bestuderen. Inderdaad, catalogi voor Ciona orthologen van de ziekte bij de mens genen en hun volle lengte ORF coderende klonen zijn direct available analyse in Ciona 1 8. Als gevolg van de gehele genoom duplicaties in gewervelde dieren, de meeste menselijke genen bezitten functioneel redundant paralogen dat analyses compliceren van gen-functie 1. Ciona dat een eenvoudiger systeem met de typische chordate weefsel regeling in larven moeten de fundamentele rol van zulke belangrijke, vaak functioneel geconserveerd genen bloot te leggen.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).

Materials

Lab with constant temp. (~ 18°C)  For embryo work
Ciona intestinalis adults UPMC – Station Biologique,
Roscoff, France		 For collecting gametes
NaCl Roth 3957.1 For ASWH
KCl Roth 6781.1 For ASWH
CaCl2x2H2O Roth A119.1 For ASWH
MgCl2x6H2O Roth 2189.1 For ASWH
MgS04x7H2O Roth P027.2 For ASWH
NaHCO3 Roth 6885.1 For ASWH
Hepes  Roth HN78.3 For ASWH
Sodium thioglycolate  Sigma MZ-6 For Dechorionation
Pronase  Sigma T0632-100G For Dechorionation
D-Mannitol  Sigma Aldrich M9546-250G For electroporation
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) Macherey-Nagel 740410.100 For electroporation or microinjection
Agarose any supplier For coating embryo culture dishes
Plastic petri dishes VWR 612-2079 Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH
Small scissors any supplier For dissecting gametes
NaOH  Roth 6771.1 For activating dechorionation solution
Tris  Roth 5429.3 1M pH9.5, for sperm activation
Pasteur pipettes  VWR 612-1701 Treated by immersion in tap water for at least 12h
Hand centrifuge Hettich Zentrifugen 1011 Use glass centrifuge tubes
1.5ml Eppendorf tubes Sigma T3406-250EA
2ml Eppendorf tubes Sigma T3531-200EA
Square electroporator Bio Rad Gene Pulser Xcell
Electroporation cuvettes 4 mm Eurogentec CE-0004-50
Coverslips Sto Premium PR248212600
Glass slides VWR ECN 613-1551
Glutaraldehyde Sigma G6257-10ML For fixation in LacZ staining
Paraformaldehyde Sigma  P6148-500G For fixation of fluorescent samples
Vectashield Vector H-1000 For mounting of fluorescent samples
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) Roth 2315.2 LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide)
K5Fe(CN)6 Merck 4984 For LacZ staining buffer
K3Fe(CN)6 Merck 4973 For LacZ staining buffer
Na22HPO4 Roth 4984.2 For PBT
KH2PO4 Roth 3904.2 For PBT
Tween  Sigma SLBJ5103V For PBT
Mineral Oil Sigma M8410 Embryo culture tested
Green Vital Dye Fast Green Sigma  F7251 for microinjection; 10µg/µl
Micropipette Puller (Flaming/Brown) Sutter Instruments Model P-97 For pulling injection needles
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 Harvard Apparatus Ltd. UK 30-0038 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection
Micromanipulator Narishige MWS-2 Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection
Injection holder Narishige 1M-H1 For holding injection needles, entire system filled with mineral oil
All Glass Syringe Walter Graf & Co GmbH & Co. KG  No. 95199.10427A4 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure 
Morpholinos  GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA Injection at 0.25-0.5mM
Capped mRNA Ambion mMessage mMashine kit Injection at 0.05-0.5µg/µl 
Plasmid DNA Injection at 20 ng/µl
Recombination cloning kit Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen 11789-013
Recombination cloning kit Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen 11791-019
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).
  2. Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).
  3. Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).
  4. Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).
  5. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
  6. Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).
  7. Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux’s Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).
  8. Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124 (3), 589-602 (1997).
  9. Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).
  10. Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).
  11. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).
  12. Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).
  13. Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. , (2015).
  14. Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).
  15. Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).
  16. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
  17. Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).
  18. Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).
  19. Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2 (9), e916 (2007).
  20. Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).
  21. Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).
  22. Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).

Tags

Ciona IntestinalisEmbryo MicroinjectionEmbryo ElectroporationGene RegulationChordate DevelopmentMolecular GeneticsStem Cell ResearchDrug DiscoveryDechorionationZygoteSperm Activation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image