Approcci genetici e biochimici per<em> In Vivo</em> e<em> In Vitro</em> La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

1. lievito doppio ibrido lievito Trasformazione Preparare i seguenti supporti e tamponi: Preparare lievito completa (YPD) medium estratto di lievito-peptone-destrosio miscelando 20 g / L peptone, 10 g / L di estratto di lievito, 2% w / v di glucosio (aggiunto dopo autoclavaggio) e 20 g / L di agar (per lastre solo) ; sterilizzare in autoclave e utilizzare fresco il giorno dell'esperimento. Preparare definito medio lievito minimo sintetico (SD) (privo leucina e triptofano per mantenere la pressione selettiva su entrambi i plasmidi esca e destinazione) mescolando 6,7 g / L di Yeast Nitrogen Base, 1,6 g / L di ricaduta integratore privo leucina e triptofano, 2% w / v di glucosio (aggiunto dopo autoclavaggio) e 20 g / L di agar (per piastre solo); sterilizzare in autoclave e utilizzare fresco il giorno dell'esperimento. Preparare 50% w / v PEG (polietilenglicole) 3350; sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 micron e conservare a RT. Preparare 100 mM Tris / 10 mM EDTA (10x TE), regolareil pH a 7,5, sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 micron e conservare a RT. Preparare 1 M acetato di litio (10x LIAC); regolare il pH a 7,5 con CH 3 COOH, sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 micron e conservare a RT. Rilanciare il ceppo Y2H (ad esempio, Y190) strisciando una piccola quantità di stock di glicerolo congelato su un piatto YPD. Incubare a 30 ° C fino a raggiungere colonie di lievito ~ 2 mm di diametro (solitamente 3 – 5 giorni, a seconda del ceppo di lievito). Inoculare 0,5 ml di YPD (in una provetta da 1,5 ml) con un unico grande (2 – 3 mm di diametro) colonia. Vortex energicamente per ~ 2 min per disperdere eventuali grumi. Trasferire sospensione cellulare in un pallone da 500 ml contenente 50 ml YPD medie. Incubare a 30 ° C per 16 – 18 ore con agitazione a 250 rpm per il lievito raggiungere fase stazionaria. Trasferimento 4 – 5 ml della coltura durante la notte in 200 ml di YPD (in una beuta da 1 L) per produrre una densità ottica a 600 nm (OD 600, misuratautilizzando uno spettrofotometro) di 0,2 – 0,3 (200 ml sarà sufficiente per 20 trasformazioni). Incubare a 30 ° C con agitazione a 250 rpm fino cellule sono in fase di mid-log, cioè, OD 600 = 0.5 – 0.6 (solitamente 2 – 3 ore). Harvest lievito mediante centrifugazione (in provette da 50 ml) a 1.500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante, risospendere ogni pellet in 5 ml di H 2 O sterile e piscina insieme. Re-centrifugare a 1500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Risospendere lievito pellet in 1 ml di preparati al momento, sterile 1x LIAC / TE. NOTA: utilizzare le cellule di lievito competenti entro 1 ora di preparazione. Preparare i campioni plasmidi (in provette da 1,5 ml) con l'aggiunta di 200 ng di DNA plasmide per le singole trasformazioni, o 0,5-1 mg di ogni DNA plasmide per co-trasformazioni, e 100 mg di testicoli aringhe DNA vettore (bollita per 20 minuti e raffreddato su ghiaccio al momento dell'uso). NOTA: includere un controllo positivo, ad esempio, il lievito.co-trasformato con pVA3 (codifica per GAL4 DNA-BD fusione con la proteina p53) e pTD1 (codifica per GAL4 AD fusione con SV40 grande antigene T). Aggiungere 100 ml di preparati al momento, sospensione di lievito competente (punto 1.1.8) e 600 ml di soluzione di 1x Liac / PEG (8 ml di brodo PEG 3350, 1 ml di brodo TE, 1 ml di brodo Liac) e vortex per ~ 30 sec. Incubare a 30 ° C per 30 minuti con agitazione a 200 rpm. Aggiungere 80 ml di dimetilsolfossido (10% v / v concentrazione finale) e mescolare bene delicatamente per inversione. scossa di calore per 15 min in un bagno d'acqua a 42 ° C sotto agitazione ogni 2 – 3 min. Raffreddare sospensione cellulare in ghiaccio per 2 minuti e centrifugare a 14000 xg per 15 sec a RT per recuperare lievito. Risospendere il pellet cellulare in 100 ml di 1x TE e piastra su opportune piastre minime medie SD per la crescita selettiva (media manca leucina e triptofano per mantenere la pressione selettiva su entrambi i plasmidi esca e di destinazione). Incubare le piastre up-side-down a 30° C fino colonie sono ~ 2 mm di diametro (solitamente 4 – 5 giorni). Le piastre possono essere conservati a 4 ° C per 2 – 3 settimane; per una conservazione più lunga fare scorte di glicerolo e conservare a -80 ° C. NOTA: Verificare che esca e di destinazione proteine ​​sono espresse nel lievito mediante immunoblotting 17, e che non hanno l'attivazione del gene reporter di autonoma quando espresso separatamente nel lievito (mediante saggio di β-Gal come descritto nella Sezione 1.3). Colony-lift β-Gal filtro di carta Assay Preparare i seguenti tamponi: Preparare Z buffer contenente 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mm NaH 2 PO 4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO 4; regolare il pH a 7,4. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. Preparare buffer di X-Gal sciogliendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside a 20 mg / ml in N, N-dimetilformammide e conservare al buio a -20 ° C. Preparare buffer di Z / soluzione X-Gal. Fare tamponeprima dell'uso mescolando X-Gal a 0,33 mg / ml e β-mercaptoetanolo al 0,27% v / v in tampone Z. Utilizzare 2,5 ml per campione. Aggiungere 2,5 ml di soluzione tampone Z / X-Gal appena preparato in un piatto 100 millimetri pulito e posto all'interno di una carta da filtro di cellulosa. Inserire un nuovo filtro di carta sulla superficie della piastra con le colonie di lievito da dosare. Strofinare delicatamente la carta da filtro sulla piastra con una pinza e lasciar riposare per ~ 5 minuti per le colonie da allegare. NOTA: Elaborare il controllo positivo in parallelo, vale a dire, il lievito co-trasformato con pVA3 e pTD1.. Sollevare la carta da filtro e immergerlo (con una pinza) in una pozza di azoto liquido per 30 sec (azoto liquido deve essere maneggiato con cura; indossare sempre guanti spessi e occhiali). Lasciate che il congelato disgelo carta da filtro a temperatura ambiente per ~ 2 min. Trasferire il filtro (lato colonia up) sulla parte superiore della carta da filtro pre-impregnati all'interno della piastra 100 mm, e incubare a 30 ° C. controllare periodicamente(Ogni ~ 30 min) per la comparsa di colonie blu. Lievito Y190 co-trasformato con i plasmidi di controllo positivo (+ pVA3 pTD1) diventerà blu entro 60 min (osservazioni non pubblicate). NOTA: esca debole: le interazioni di destinazione può richiedere diverse ore per produrre un segnale positivo blu (evitare di incubazione prolungata (> 8 ore) che possono dare risultati falsi positivi). Per ottenere i migliori risultati, utilizzare colonie appena co-trasformati, cioè, cresciuti a 30 ° C per 4 -. 5 giorni, ~ 2 mm di diametro. Coltura liquida β-Gal Assay Preparare i seguenti tamponi: Preparare Z buffer contenente 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mm NaH 2 PO 4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO 4; regolare il pH a 7,4, sterilizzare in autoclave e conservare a RT. 1 M Na 2 CO 3; conservare a temperatura ambiente. Preparare Z tampone / β-mercaptoetanolo. Rendere tampone prima dell'uso aggiungendo β-mercaptoetanolo al 0,27% v /v in tampone Z; utilizzare 700 ml per campione. Preparare buffer di Z / soluzione ONPG. Fare tampone prima dell'uso miscelando ONPG (o-nitrofenil-β-D-galattopiranoside) a 4 mg / ml e β-mercaptoetanolo al 0,27% v / v in tampone Z; utilizzare 160 ml per campione. Utilizzare una singola colonia per inoculare 5 ml di terreno SD minima (privo leucina e triptofano per mantenere la pressione selettiva su entrambi i plasmidi esca e destinazione) e incubare a 30 ° C per 16 – 18 ore con agitazione a 250 rpm. NOTA: Assay cinque colonie separate co-trasformato con gli stessi esca e di destinazione plasmidi. Trasferire abbastanza della cultura durante la notte in 10 ml di terreno fresco SD per produrre una OD 600 = 0.2 – 0.3. Incubare a 30 ° C con agitazione a 250 rpm fino a quando le cellule sono in fase di mid-log (OD 600 = 0,5 – 0,6). Trasferire 0,5 ml di coltura di lievito in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 14000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Registrare l'esatto diametro esterno 600 quando la raccolta del CELLS. Risospendere il pellet in 100ul di tampone Z; questo si tradurrà in un fattore di concentrazione 5 volte. Luogo tubo in azoto liquido per ~ 1 min (azoto liquido deve essere maneggiato con cura; indossare sempre guanti spessi e occhiali) e poi in un bagno d'acqua a 37 ° per 3 minuti per scongelare. Ripetere questo ciclo di congelamento-scongelamento due volte di più per garantire le cellule sono rotte aperte. Impostare un tubo vuoto con 100 ml di buffer di Z. Aggiungere 700 microlitri di tampone Z / β-mercaptoetanolo e 160 microlitri di tampone Z / ONPG al campione e tubi vuoti; avviare il timer e posto in un incubatore a 30 °. Controllare periodicamente per il colore giallo per lo sviluppo. Aggiungere 400 ml di 1 M Na 2 CO 3 per fermare lo sviluppo del colore e registrare il tempo trascorso in minuti. Lievito Y190 co-trasformato con i plasmidi di controllo positivo (+ pVA3 pTD1) diventerà giallo entro 60 min .. NOTA: Debole esca: interazioni di destinazione può richiedere diverse ore per produrre un segnale giallo positivo per meglio risultati, utilizzare colonie appena co-trasformato, cioè, cresciuto a 30 ° C per 4 -. i 5 giorni, ~ 2 mm di diametro. Centrifugare a 14.000 xg per 5 min a temperatura ambiente per far sedimentare detriti cellulari e trasferire il surnatante nella cuvetta pulita. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare l'assorbanza a 420 nm (A 420) dei campioni relativi ai vuote (valori dovrebbe essere compresa tra 0,02 – 1.0). Calcolare unità β-galattosidasi, con 1 unità definita come la quantità che idrolizza 1 micromole di ONPG di o-nitrofenolo e D-galattosio per min per cella, secondo la seguente formula: = unità β-galattosidasi Dove: t: tempo trascorso di incubazione (in minuti); . CF: il fattore di concentrazione dal punto 1.4.8, vale a dire, cf = 5; OD 600: quando sono state raccolte le cellule. 2. l'espressione della proteina in una linea cellulare di mammifero <strong> Mammalian Trasfezione cellulare Preparare i seguenti supporti e tamponi: Preparare mezzo di crescita mescolando DMEM con 4,5 g / L di glucosio, 10% v / v di siero bovino fetale e 2 mM L-glutammina; sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 micron e conservare a 4 ° C. Preparare salina 2x Hepes-buffered (2x HBS) mescolando 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mm Na 2 HPO 4, 12 mm di glucosio, 50 mm Hepes; regolare il pH a 7,05, sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 micron e conservare a -20 ° C. Preparare 2,5 M CaCl 2. Sterilizzare attraverso un filtro 0,2 micron e conservare a -20 ° C. Un giorno prima della transfezione, sementi 1 – 2 x 10 6 cellule HEK293 in un piatto 100 millimetri Petri per essere 60-70% confluenti il giorno seguente. Cultura per 16 – 18 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. Il giorno della trasfezione, rimuovere le vecchie cellule medie e mangimi con 10 ml di terreno di coltura fresco. NOTA: Gli antibiotici vengono omessi dal terreno di coltura durante la transfezione perché possono aumentare la morte delle cellule. Diluire 24 mg di DNA plasmidico (per co-trasfezioni, un rapporto molare uguale dei due plasmidi) e 60 ml di 2,5 M CaCl 2 in 600 microlitri volume totale (fornito con sterili H 2 O deionizzata) all'interno di una provetta da 1,5 ml; vortex per miscelare. NOTA:. Per la massima efficienza di trasfezione, DNA plasmidico dovrebbe essere della massima purezza, cioè, avere un rapporto Abs 260 / Abs 280 = ~ 1.8. Aggiungere la soluzione goccia plasmide DNA / calcio saggio in una provetta da 50 ml contenente 600 ml di 2x HBS mentre costantemente e vigorosamente miscelazione con vortex. Incubare per 20 minuti a RT per permettere la formazione di calcio complessi di fosfato / plasmide DNA. Dopo 20 min di incubazione, brevemente vortice e aggiungere goccia soluzione saggia sulle celle a coprire l'intera superficie del piatto 100 millimetri Petri. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO <sub> 2. Dopo ~ 6 ore cambiare il mezzo di crescita e mettere di nuovo in incubatrice. Raccogliere le cellule 24 ore dopo la trasfezione per centrifugazione a 1.000 xg per 3 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. pellet cellulari possono essere conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso. NOTA: Espressione di solito picchi 24-72 ore dopo la trasfezione. cellulare omogeneizzazione Preparare i seguenti tamponi: Preparare tampone di omogeneizzazione Co-IP mescolando 150 mM NaCl, 20 mM Tris; regolare il pH a 7,4 e conservare a 4 ° C. Preparare reticolazione buffer di omogeneizzazione mescolando 5 mM Hepes, 0,3 M saccarosio; regolare il pH a 7,4 e conservare a 4 ° C (filtro prima dell'uso per rimuovere eventuali particelle). Supplemento con inibitori della proteasi prima dell'uso. Aggiungere 250 ml di perline di vetro (425 – 600 micron) all'interno di un tubo da 1,5 ml e lavare con 500 ml di buffer di omogeneizzazione. perle di vetro a pellet da una breve centrifugazioneimpulso (1.000 xg per 5 sec) e rimuovere il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio una volta di più. pellet Risospendere cellulare (dal punto 2.1.8) in 500 ml di buffer di omogeneizzazione ghiacciata e trasferire la sospensione cellulare nel tubo di vetro perle contenenti. Omogeneizzare le cellule in ghiaccio per 20 passaggi attraverso un ago sottile (23 G, 0,6 x 30 mm) attaccato ad una siringa da 1 ml. Con il tappo della provetta chiusa, forare attraverso di essa con l'ago e disperdere sospensione cellulare con forza attraverso le perline di vetro. Centrifugare a 1500 xg per 10 min a 4 ° C per rimuovere nuclei e le cellule intatte e scartare il pellet. Salvare il surnatante che rappresenta la frazione post-nucleare e procedere direttamente al co-IP o cross-linking a seconda dei casi. 3. in vitro metodi biochimici Co-immunoprecipitazione Preparare i seguenti tamponi: Preparare tampone di omogeneizzazione Co-IP come descritto in sessione 2.2.1.1. Preparare tampone IP mescolando 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.5% (w / v) CHAPS, 2 mM ditiotreitolo (opzionale; ditiotreitolo può essere incluso per ridurre aggregati proteici che possono formarsi a causa di ossidazione con aria); regolare il pH a 7,4 e conservare a 4 ° C. Preparare 2% w / v Chaps in buffer di omogeneizzazione co-IP; Conservare a 4 ° C. Preparare tampone proteico loading miscelando 60 mM Tris, 2% w / v SDS, 10% v / v di glicerolo, 5 mM EDTA, 0,01% w / v blu di bromofenolo, 2% v / v β-mercaptoetanolo (opzionale); regolare il pH a 6,8 e conservare a RT. Omogeneizzare le cellule da un confluenti mm piatto 100 Petri (~ 8 x 10 6 cellule HEK293 se, contato con l'uso di un emocitometro) come descritto nella sezione 2.2. Solubilizzare la frazione subcellulare post nucleare con 0,5% CHAPS (utilizzando il magazzino 2%) e incubazione per ≥2 ore a 4 ° C con costante miscelazione. Centrifugare a 20.000 xg per 10 minuti a 4 ° C per far sedimentare il Materi insolubileAl e scartare il pellet. Salvare il surnatante definito lisato cellulare. NOTA: L'inclusione di un detergente e la rimozione del materiale insolubile è assolutamente necessario minimizzare legame non specifico. . Detergenti intermedi, ad esempio, CHAPS o Triton X-100, ad una concentrazione dello 0,2 – 1%, sono i più comunemente usati. Preparare due distinte provette da 1,5 ml e aggiungere ~ 20 microlitri (seconda IgG capacità di legame) di 6 mg / ml Protein-A o proteina G-agarosio (o sefarosio) perline. Lavare con 200 ml di buffer di IP. NOTA: Scegliere la resina Ig-binding appropriata a seconda delle specie animali utilizzati per sollevare l'anticorpo immunoprecipitating. Proteina-G si lega una più ampia gamma di sottotipi Ig rispetto alla proteina-A. Recuperare perline per centrifugazione a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Ripetere il lavaggio ancora una volta con tampone IP, quindi risospendere le sfere in 200 ml di tampone IP. Aggiungere 1 mg (5 ng / mL) di anticorpo immunoprecipitating o non-immuni IgG (adservire come controllo negativo) nei due distinti Protein-A / G contenenti tubi. Incubare per ≥2 ore a 4 ° C con costante miscelazione. NOTA: elaborare sempre un controllo negativo con l'uso di IgG non immune sollevata nella stessa specie animali come l'anticorpo immunoprecipitating. Recuperare perline per centrifugazione a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C e scartare con cura il surnatante pipettando. Trasferire 200 ml di lisato cellulare (dal punto 3.1.3) in ciascuna delle due tubi con l'anticorpo e proteina-A / G perline. Incubare per ≥2 ore a 4 ° C con costante miscelazione per eseguire la rilegatura antigene-anticorpo. Recuperare perline e lavare con 200 ml di buffer di IP; incubare per 10 minuti a 4 ° C con miscelazione. Recuperare perline e lavare due volte di più (evitare molteplici lavaggi che ridurranno sia la specifica e vincolante non specifico). Eliminare attentamente il surnatante pipettando. Aggiungere 30 ml di tampone proteico di carico per eluire immunoprecipitproteine ​​associate. Centrifugare a 1500 xg per 2 minuti a 4 ° C, scartare le perline e salvare il surnatante contenente il campione co-IP eluita. Per verificare successo proteina X precipitazione, caricare una piccola quantità (1/10, 3 ml) del campione co-IP su un gel SDS-PAGE per essere analizzati mediante immunoblotting 17 con anticorpi specifici per la proteina X. Include un'aliquota del lisato cellulare per verificare l'espressione della proteina X nel campione. Per verificare la presenza di proteine ​​co-precipitata Y, caricare il resto (9/10 th, 27 mL) del campione co-IP su un gel SDS-PAGE separata da analizzare mediante immunoblotting 17 con anticorpo specifico per la proteina Y. Include una aliquota del lisato cellulare per verificare la proteina espressione Y nel campione. Reticolazione chimica Preparare i seguenti tamponi: Reticolazione buffer di omogeneizzazione come descritto nella sezione 2.2.1.1. Preparare 5x ptampone rotein-loading mescolando 300 mM Tris, 10% w / v SDS, 50% v / v di glicerolo, 25 mM EDTA, 0,05% w / v blu di bromofenolo, 10% v / v β-mercaptoetanolo (opzionale); regolare il pH a 6,8 e conservare a temperatura ambiente; calda a 50 ° C prima dell'uso. Omogeneizzare le cellule da un confluenti mm piatto 100 Petri (~ 8 x 10 6 cellule HEK293 se, contato con l'uso di un emocitometro) come descritto nella sezione 2.2. NOTA: Saccarosio (a 0,3M) viene usato per creare un buffer iso-osmotica. Salt, ad esempio, a 120 – 150 mM NaCl o KCl possono essere usati al posto, a seconda del complesso proteico oligomerica di interesse. Centrifugare la frazione subcellulare post-nucleare a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare aggregati proteici e salvare il surnatante. Prendere otto aliquote di 20 ml ciascuno (tipicamente ~ 20 mg di proteina) in distinte 0,5 ml tubi. Aggiungere 0,0025% v / v glutaraldeide a tutti i campioni e avviare il timer. Ciascuno degli otto campioni reagiscono con glutaraldehyde a RT per: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min. NOTA: glutaraldeide ha due gruppi aldeide che reagiscono con le ammine libere. Evitare l'uso di tamponi pH o altre sostanze con gruppi amminici primari perché sarà placare la reazione glutaraldeide. Smettere di reazione glutaraldeide all'ora specificata con il 2% v / v idrazina e aggiungere 5 ml di 5x tampone proteico di carico per denaturare le proteine. Procedere alla SDS-PAGE e immunoblotting 17.