以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em>インビボ</em>と<em>インビトロ</em>タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

1.酵母ツーハイブリッド 酵母形質転換 次のメディアとバッファを準備します。 が20g / Lペプトン、を10g / L酵母抽出物、の2％w / vのグルコース（オートクレーブ後に添加）および20グラム/ Lの寒天を混合することによって、酵母完全酵母抽出物 – ペプトン – デキストロース（YPD）培地を調製し（プレートのみ） ;オートクレーブで滅菌し、実験の日に新鮮なを使用しています。 酵母窒素ベース、1.6グラム/ロイシンおよびトリプトファンを欠くLドロップアウトサプリメント、2％wの6.7グラム/ Lを混合することにより（SD）培地（餌とターゲットプラスミドの両方で選択圧を維持するためにロイシンおよびトリプトファンを欠く）定義された酵母最小の合成を準備します（のみ板用）（オートクレーブ後に添加）/ vのグルコースとは20g / Lの寒天。オートクレーブで滅菌し、実験の日に新鮮なを使用しています。 PEG（ポリエチレングリコール）3350 w / vの50％を準備します。室温で0.2μmのフィルターとストアを介して滅菌します。 100 mMトリス/ 10mMのEDTA（10×TE）を準備し、調整7.5のpHは、室温で0.2μmのフィルターとストアを介して滅菌します。 1 M酢酸リチウム（10×LiAc形質）を準備。室温で0.2μmのフィルターとストアを介して滅菌、CH 3 COOHで7.5にpHを調整します。 YPDプレート上に凍結グリセロールストックを少量ストリーキングによってY2H株（ 例えば、Y190）をリバイブ。酵母コロニーは直径〜2ミリメートルに達するまで30℃でインキュベートする（通常3から5日間、酵母株に依存）。 コロニー – （直径3mm 2）単一の大規模で（1.5mlチューブ中）YPDの0.5ミリリットルを接種します。任意の塊を分散させる〜2分間激しくボルテックス。 50ミリリットルYPD培地を含む500mlフラスコに細胞懸濁液を転送します。定常期に到達するために酵母を250 rpmで振盪しながら18時間 – 16、30℃でインキュベートします。 転送4 – （1L三角フラスコ中）YPD 200mlに一晩培養物5mlを600nmで（OD 600での光学密度を生成するために、測定されました0.2の分光光度計）を使用して – 0.3（200ミリリットル）は20変換のために十分であろう。 細胞が中期対数期になるまで、250 rpmで振盪しながら30℃でインキュベートし、 すなわち 、OD 600 = 0.5から0.6まで（通常2から3時間）。 室温で5分間、1500×gで（50mlチューブで）遠心分離によって収穫酵母。 、上清を捨て一緒に滅菌H 2 Oおよびプールの5ミリリットルに各ペレットを再懸濁します。 室温で5分間、1500×gで遠心分離-Reおよび上清を捨てます。新たに調製し、滅菌1×LiAc形質/ TE 1ml中に再懸濁酵母ペレット。 注：準備の1時間以内に有能な酵母細胞を使用してください。 単一の変換のためのプラスミドDNAの200 ngのを追加することにより、（1.5 mlチューブで）プラスミドサンプルを準備し、または0.5 – 同時変換の各1μgのプラスミドDNA、および100μgのニシン精巣のキャリアDNAの（20分間煮沸し、上の冷却使用直前に氷）。 注： 例えば 、陽性対照を含め、酵母PVA3（p53タンパク質とGAL4 DNA-BD融合に符号化）とPTD1（SV40ラージT抗原とのGAL4 AD融合に符号化）で同時形質転換。 以下のための新たに調製し、有能な酵母懸濁液（ステップ1.1.8）を100μlおよび1×LiAc形質/ PEG溶液の600μlの（株式の8ミリリットルPEG 3350、株式TEの1ミリリットル、株式LiAc形質の1ミリリットル）、および渦を追加〜30秒。 200 rpmで振盪しながら30℃で30分間インキュベートします。 ジメチルスルホキシド（10％v / vの最終濃度）の80μl加え、穏やかに反転させてよく混ぜます。 3分 – 42℃の水浴中で15分間熱ショックを毎2を混合しました。 酵母を回収するために室温で15秒間、14,000×gで2分間遠心分離するために氷上で細胞懸濁液を冷却。 （餌とターゲットプラスミドの両方で選択圧を維持するために欠く培地ロイシン及びトリプトファン）選択的成長のための適切な最小限のSD培地プレート上に1×TEとプレートの100μl中に再懸濁細胞ペレット。 30でアップサイドダウンプレートをインキュベート（ – 5日、通常4）コロニーは直径〜2ミリメートルになるまでC°。プレートは2のために4℃で保存することができます – 3週間。長期保存のために-80℃でグリセロールストックとストアを作ります。 注：その餌とターゲットタンパク質が17を免疫ブロット法により酵母で発現していることを確認し、別途酵母で発現した場合（第1.3節で説明したように、β-galアッセイによって）彼らは自律レポーター遺伝子の活性化を持っていないこと。 コロニーリフトフィルターペーパーのβ-Galのアッセイ 以下の緩衝液を準備します。 100mMのNa 2 HPO 4、40mMののNaH 2 PO 4、10mMの塩化カリウム、1mMの硫酸マグネシウムを含むZバッファを準備します。 pHを7.4に調整します。 RTでオートクレーブ処理し、ストアによって滅菌します。 -20℃で暗所でN、N-ジメチルホルムアミド、店舗、N中の20mg / mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシドを溶解させることによってX-Galのバッファを準備します。 Zバッファ/ X-Galの溶液を調製します。バッファを作りますZバッファに0.27％v / vのに0.33 mg / mlとし、βメルカプトエタノールでのX-galを混合して使用する前に。サンプルあたり2.5ミリリットルを使用してください。 セルロース濾紙内部クリーン100ミリメートルプレートと所定の位置に新たに調製したZバッファ/ X-Galの溶液を2.5ミリリットルを追加します。 酵母コロニーがアッセイされると、プレートの表面上に新しいろ紙を置きます。静かにピンセットでプレート上にろ紙をこすると接続するためのコロニーについて〜5分間のままにします。 注：。 すなわち 、並列に陽性コントロールを処理し、酵母PVA3とPTD1で同時形質転換。 （;常に厚い手袋とゴーグルを着用し、液体窒素は注意して取り扱ってください）​​ろ紙を持ち上げ、30秒間液体窒素のプールに（鉗子で）それを沈めます。 〜2分間、室温で凍結したろ紙の解凍をしてみましょう。 100ミリメートルプレート内部で予め浸漬濾紙の上にろ紙（コロニー側を上にして）を配置し、そして30℃でインキュベートします。 定期的に調べます青色のコロニーの外観（毎〜30分）。酵母Y190陽性コントロールプラスミド（PVA3 + PTD1）で同時形質転換は、60分（未発表の観察）内で青色に変わります。 注：弱い餌：標的相互作用は、（偽陽性の結果を与える可能性があり長時間のインキュベーション（> 8時間を避けるため））正の青色信号を生成するために数時間かかることがあります。最良の結果を得るために、新たに同時形質転換コロニー、 すなわちを使用し 、4 30℃で増殖させた- 。直径〜2ミリメートル、5日間。 液体培養β-Galのアッセイ 以下の緩衝液を準備します。 100mMのNa 2 HPO 4、40mMののNaH 2 PO 4、10mMの塩化カリウム、1mMの硫酸マグネシウムを含むZバッファを準備します。 RTでオートクレーブ処理し、ストアによって滅菌、pHを7.4に調整します。 1 MのNa 2 CO 3;室温で保管してください。 Zバッファ/βメルカプトエタノールを準備します。 0.27パーセントのV /にβメルカプトエタノールを添加することにより、使用する前にバッファを作りますZバッファ内のV;サンプルあたり700μLを使用しています。 Zバッファ/ ONPG溶液を調製します。前バッファはZバッファでV / V 0.27パーセントで4 mg / mlとし、βメルカプトエタノールでONPG（o-ニトロフェニルβ-D-ガラク）を混合して使用するようにしてください。サンプルあたり160μLを使用しています。 250 rpmで振盪しながら18時間 – 最小のSD培地の5ミリリットル（餌とターゲットプラスミドの両方で選択圧を維持するために、ロイシンおよびトリプトファンを欠く）を接種し、16、30℃でインキュベートし、単一のコロニーを使用してください。 注：アッセイ5つの別々のコロニー同じ餌と​​ターゲットプラスミドで同時形質転換。 0.3 – OD 600 = 0.2を生成するために、新鮮なSD培地10mlに一晩培養物を十分に転送します。細胞が対数中期（ – 0.6 OD 600 = 0.5）になるまで、250 rpmで振盪しながら30℃でインキュベートします。 RTで2分間、14,000×gで1.5ミリリットルチューブと遠心分離機に酵母培養物の0.5ミリリットルを転送します。 CEを収穫するとき、正確なOD 600を記録LLS。 Zバッファの100μlの中でペレットを再懸濁し、これは、5倍の濃縮係数をもたらします。 そしてその後、37℃の水浴中で3分解凍するために、液体窒素に入れチューブは〜1分間（常に厚手の手袋とゴーグルを着用し、液体窒素の注意を払って処理する必要があります）。細胞がオープン壊れていることを確認するために二回以上、この凍結融解サイクルを繰り返します。 Zバッファー100μlで素管を設定します。 Zバッファ/βメルカプトエタノールおよび/ ONPGサンプルとブランクのチューブにZバッファの160μlの700μlのを追加します。 30℃のインキュベーター中でタイマーと場所を開始します。 黄色が開発するために定期的に確認してください。発色を停止し、分単位での経過時間を記録するために1 MのNa 2 CO 3400μlのを追加します。酵母Y190陽性コントロールプラスミド（PVA3 + PTD1）で同時形質転換は、60分以内に黄色になります.. 注：弱い餌：標的相互作用は、最高の再については正の黄色信号を生成するのに数時間かかる場合がありますsultsは、新たに同時形質転換したコロニーを使用し、すなわち 、4 30℃で増殖させた- 。5日〜直径2mm。 細胞破片をペレット化し、きれいなキュベットに上清を転送するために室温で5分間、14,000×gで遠心分離します。 分光光度計を使用して、（ – 1.0 0.02の間であるべきである値）ブランクと比較したサンプルの420 nmの（420）での吸光度を測定します。 次の式に従って、O-ニトロフェノールおよびセル当たり毎分D-ガラクトースにONPGの1マイクロモルを加水分解する量として定義された1単位で、βガラクトシダーゼ単位を計算します。 =βガラクトシダーゼユニットここで、T：（分）のインキュベーションの経過時間。 CF： すなわちステップ1.4.8から濃縮係数、CF = 5;。 OD 600：細胞を回収しました。 哺乳動物細胞株で2タンパク質発現<st栄>哺乳動物細胞のトランスフェクション次のメディアとバッファを準備します。 4.5g / Lグルコース、10％v / vのウシ胎児血清および2mM L-グルタミンを含むDMEMを混合することにより、増殖培地を準備。 4℃で0.2μmのフィルターとストアを介して滅菌します。 280ミリモルのNaCl、10mMの塩化カリウムを混合して2×Hepes緩衝生理食塩水（2×HBS）の調製1.5ミリモルのNa 2 HPO 4、12mMのグルコース、50mMのHEPES。 、7.05のpHを調整し、-20℃で0.2μmフィルターとストアを介して滅菌します。 -20℃で0.2μmフィルターとストアを介して、2.5MのCaCl 2滅菌を準備します。 60から70パーセントのコンフルエント次の日であるために100ミリメートルペトリ皿中の2×10 6 HEK293細胞-トランスフェクションの1日、シード1の前に。 5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で18時間- 16のための文化。 トランスフェクションの日に、新鮮な増殖培地10mlで古い培地とフィード細胞を除去します。 注意：これらは、細胞死を増加させることができるので、抗生物質は、トランスフェクション時に、培養培地から省略されています。 1.5ミリリットルチューブの内側（滅菌脱イオンH 2 Oで作られた）600μlの総容量（コトランスフェクション、二つのプラスミドの等モル比のために）プラスミドDNAの24μgのを希釈し、2.5 MのCaCl 260μlの。渦が混合します。 注：最高のトランスフェクション効率のために、プラスミドDNAは、最高純度のものでなければならない、 すなわち 、ABS 260 / ABS 280比=〜1.8を持っています。 常に激しくボルテックスで混合しながら2倍HBSの600μLを含む50 mlチューブに滴下し、プラスミドDNA /カルシウム溶液を追加します。リン酸カルシウム/プラスミドDNA複合体の形成を可能にするために室温で20分間インキュベートします。 20分間インキュベートした後、簡単にボルテックスし、溶液を100mmペトリ皿の全表面積を覆うように細胞に滴下し加えます。 5％CO 2中37℃で細胞をインキュベート<sUB> 2。 〜6時間後に戻ってインキュベーター内で増殖培地と場所を変更します。 室温で3分間千×gの遠心分離により細胞を24時間トランスフェクション後に収穫し、上清を捨てます。必要になるまで細胞ペレットを-80℃で保存することができます。 注： – 72時間後、トランスフェクション発現は通常24をピーク。 細胞均質化 以下の緩衝液を準備します。 150mMのNaCl、20 mMトリスを混合することにより、共同IPの均質化緩衝液を準備します。 pHを7.4に調整し、4℃で保存します。 5mMのヘペス、0.3 Mショ糖を混合することにより架橋均質化緩衝液を準備します。 pHを7.4に調整し、（任意の粒子を除去するために使用前にフィルター）、4℃で保存します。使用前にプロテアーゼ阻害剤を補足します。 1.5ミリリットルチューブの内側 – （600ミクロン425）と均質化緩衝液500μlで洗浄したガラスビーズ250μlのを追加します。短時間の遠心分離によってペレットガラスビーズパルス（5秒間千XG）、上清を除去します。もう一度この洗浄ステップを繰り返します。 氷冷均質化緩衝液500μl中（ステップ2.1.8から）再懸濁細胞ペレットとガラスビーズを含有するチューブに細胞懸濁液を転送します。 1ミリリットル注射器に取り付けられた細い針を介して、20継代（23 G、0.6×30ミリメートル）で氷上で細胞をホモジナイズします。チューブキャップを針で貫通それを介して、閉じたガラスビーズを介して激しく細胞懸濁液を分散させると。 4℃で10分間、1500×gで遠心分離し、核および破壊されていない細胞を除去し、ペレットを廃棄します。ポスト核分画を表す上清を保存し、共同-IPにまたはのような適切な架橋直接進みます。 3. インビトロ生化学的方法 免疫共沈降 以下の緩衝液を準備します。 秒で説明したように共同のIP均質化緩衝液を準備しますection 2.2.1.1。 20mMのトリス、150mMのNaCl、0.5％を混合することにより、IP緩衝液を調製（w / v）のCHAPS、2mMのジチオスレイトール（任意;ジチオスレイトールは、空気酸化に形成されている可能性があり、タンパク質凝集を減少させるために含めることができます）。 pHを7.4に調整し、4℃で保存します。 共同IPの均質化緩衝液中のV CHAPS / wの2％を準備。 4℃で保存します。 0.01％ワット/ブロモフェノールブルーV、2％（v / v）のβメルカプトエタノール（オプション）SDS、10％（v / v）のグリセロール、5mMのEDTA、w / vの60 mMトリス、2％を混合することにより、タンパク質ローディングバッファーを準備します。 pHを6.8に調整し、室温で保存します。 2.2節で説明したようにコンフルエント100ミリメートルペトリ皿（血球計数器を使用して数え〜8×10 6細胞HEK293場合、）から細胞をホモジナイズします。 絶えず混合しながら4℃で≥2時間、0.5％（2％ストックを使用して）CHAPSおよびインキュベーションとポスト核サブ細胞画分を可溶化します。不溶性materiをペレット化するために4℃で10分間20,000×gで遠心分離アルとは、ペレットを捨てます。上清と呼ばれる細胞溶解物を保存します。 注：洗浄剤と不溶性物質の除去を含めることは、非特異的結合を最小にするために絶対に必要です。中間体洗浄剤は、 例えば 、CHAPSまたはトリトンX-100は、0.2の濃度で、 – 1％、最も一般的に使用されます。 6 mg / mlでプロテインAまたはプロテインGアガロース（またはセファロース）ビーズの（IgG結合容量に応じて）二つの別々の1.5ミリリットルのチューブを準備し、〜20μlを添加します。 IP緩衝液200μlで洗浄します。 注：免疫沈降抗体を上昇させるために使用される動物種に応じて適切なのIg結合樹脂を選択してください。プロテインGは、プロテインAと比較したIgサブタイプのより広い範囲をバインドします。 4℃で2分間、1500×gで遠心分離することによってビーズを回復。 IP緩衝液で1回以上繰り返して洗浄し、IP緩衝液200μlでビーズを再懸濁します。 （に免疫沈降抗体または非免疫IgGの1μgの（5 ngの/μl）を追加します。二つの別々のプロテインA / G含むチューブのようなネガティブコントロール）を提供しています。一定に混合しながら4℃で≥2時間インキュベートします。 注：必ず、免疫沈降抗体と同じ動物種で提起された非免疫IgGを用いたネガティブコントロールを処理します。 4℃で2分間、1500×gで遠心分離することによってビーズを回収し、注意深くピペッティングにより上清を捨てます。 抗体とプロテインA / Gビーズと2本のチューブのそれぞれに（ステップ3.1.3から）細胞溶解物の200μlのを転送します。抗原 – 抗体結合を可能にするために、一定に混合しながら4℃で≥2時間インキュベートします。 ビーズを回収し、IP緩衝液200μlで洗浄します。混合しながら4℃で10分間インキュベートします。ビーズを回復し、（特異的および非特異的結合の両方を削減する複数回の洗浄を避ける）を2回以上を洗います。ピペットで注意深く上清を捨てます。 immunoprecipitを溶出するタンパク質ローディング緩衝液30μlを追加atedタンパク質。 4°Cで2分間1500×gで遠心分離し、ビーズを破棄し、溶出した共同IPサンプルを含む上清を保存します。 成功したタンパク質X沈殿を確認するには、一定分量を含めるタンパク質Xの特異的な抗体と17をイムノブロッティングによって分析されるSDS-PAGEゲル上での共同のIP少量のサンプル（1/10、3μl）を読み込みます細胞溶解物は、試料中のタンパク質Xの発現を確認します。 独立したSDS-PAGEゲル上で共同IPサンプルの残り（9/10 番目 、27μl）をロードし、共沈タンパク質Yの存在をテストするには、タンパク質、Yに特異的な抗体と17をイムノブロッティングにより分析しますあなたの試料中のタンパク質Yの発現を確認するために、細胞溶解物のアリコートを含めます。 化学架橋 以下の緩衝液を準備します。 セクション2.2.1.1で説明したように均質化緩衝液を架橋します。 5倍Pを準備SDS、50％（v / v）のグリセロール、0.05％重量/容量ブロモフェノールブルー、10％（v / v）のβメルカプトエタノール（オプション）25mMのEDTA、w / vの、10％を300 mMトリスを混合することによりroteinローディング緩衝液; pHを6.8に調整し、室温で保存します。使用前に50℃で暖かいです。 2.2節で説明したようにコンフルエント100ミリメートルペトリ皿（血球計数器を使用して数え〜8×10 6細胞HEK293場合、）から細胞をホモジナイズします。 注：スクロースは（0.3Mで）等浸透バッファを作成するために使用されます。塩は、 例えば 120 – 150mMのNaClまたはKClを関心のオリゴマータンパク質複合体に依存して、代わりに使用することができます。 タンパク質凝集体をペレット化し、上清を保存するために、4℃で10分間20,000×gでポスト核サブ細胞画分を遠心。別々の0.5ミリリットルチューブに（典型的にはタンパク質の〜20μgの）20μlの各の8アリコートを取ります。 0.0025パーセント（v / v）のグルタルアルデヒドは、すべてのサンプルに追加し、タイマーを開始します。 8個のサンプルのそれぞれがglutaraldと反応してみましょうRTでehyde：0、2、5、10、15、20、30、60分。 注：グルタルアルデヒドは遊離アミンと反応する2アルデヒド基を有します。彼らはグルタルアルデヒドの反応を停止するので、第一級アミノ基とpH緩衝液または他の物質を使用しないでください。 2％（v / v）のヒドラジンと、指定した時刻にグルタルアルデヒドの反応を停止し、タンパク質を変性するために5倍のタンパク質ローディングバッファーの5μlを添加します。 SDS-PAGEおよびイムノ17に進んでください。