小説行動アッセイ個人の味覚応答を調査するために、自由に移動バンブル蜂（<em>セイヨウオオマルハナバチ</em>）
Summary
A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.
Abstract
バフ尾のマルハナバチ蜂のようなジェネラリスト花粉媒介、 セイヨウオオマルハナバチは 、彼らは植物の開花から集める花の蜜に栄養素や毒素の両方が発生しました。ごく少数の研究では、食品中の毒素に向かってミツバチの味覚応答を記載しており、これらの実験は、拘束ミツバチ上の口吻拡張応答を主に使用してきました。ここでは、新しい行動アッセイは栄養素や毒素に、個々の労働者マルハナバチを自由に移動の送り応答を測定するために提示されています。このアッセイは、各熊蜂が摂取溶液の量を測定し、食品中の味物質が摂食行動の微細構造にどのように影響するかを識別します。
ソリューションは、以前に2-4時間飢餓状態にされた個々のマルハナバチにマイクロキャピラリーチューブに提示されています。動作は、デジタルビデオで撮影されます。摂食行動の微細構造を連続的proboの位置を採点することによって分析されますイベントロギングソフトウェアを使用してビデオ録画からSCIS（口器）。吻の位置は、3つの異なる行動のカテゴリによって定義される：（1）吻状部が拡張され、溶液と接触し、（2）吻が拡張されているが、溶液（3）吻状部に接触してヘッドの下に収納されていません。さらに、溶液から離れて後退吻の速度も推定されています。
溶液の容量が消費本アッセイでは、摂食発作の数、送り発作の持続時間と最初の接触後の吻の後退速度がphagostimulatoryまたは試験化合物の抑止活性を評価するために使用されます。
この新しい味アッセイは、研究者が蜜で見つかった化合物は、ミツバチの摂食行動にどのように影響するかを測定するために、また、受粉生物学者、毒物学者や熊蜂の味覚系を研究neuroethologistsに有用であろうことができます。
Introduction
植物花粉媒介の相互作用は複雑です。花粉媒介者は食料として蜜や花粉を得るために花を訪問します。今度は、花粉媒介者は、植物で有性生殖を促進します。この関係は、主に共生ですが、花の蜜や花粉は時々毒素または他の植物化合物1-5を含んでいます これは花粉媒介に害を与えることができます。蜜や花粉におけるこのような化合物の存在のための生態学的な根拠は、すべての設定では明確ではありません。この分野における一つの未解決の問題は、ミツバチなどの花粉媒介が毒素を含む蜜と花を検出し、回避することができる方法です。
熊蜂の種、 セイヨウオオマルハナバチ （リンネ、1758）は、毒素6を含有するもの産蜜を含む多くの植物種の花を訪れジェネラリスト授粉です。マルハナバチで24時間二選択アッセイ7毒素の高濃度を含有するかかるソリューションを回避することが示されています。このアッセイTiedeken ら食物消費を7は 、ミツバチが溶液中苦味化合物を検出することができることを明らかにしました。しかし、このアッセイはまた、この時間間隔8-10にわたって摂食行動に影響を及ぼす可能性があり、このような倦怠感などの後処理食物摂取プロセスから味を区別することができませんでした。
ミツバチは、化合物11-13を検出するために彼らのアンテナ、口器とtarsusの複数形の味覚感覚器を有しています。口先の伸展反射（PER）実験は、ハーネス内の個々の蜂を拘束してから送り反射14-17を生成するためにハチの触角感覚器を刺激することを含みます。ミツバチは、個々のハーネスに拘束した後、化合物18,19を味わうする能力のアッセイとして送り反射を生成するように刺激することができます。その他は、毒素9,20にアンテナや口器の感度を研究するためにPERアッセイを変更しました。しかし、ハチを利用する時の応力にさらされます。これがどのように影響を与える可能性が彼らは、化合物21に応答します。
ここでは、新しいアッセイは9とミツバチ（ ミツバチ ）とマルハナバチに対して毒性10（ マルハナバチをスクロースおよびキニーネ、以前に抑止力であると報告されているアルカロイドにマルハナバチを自由に移動の行動味の応答を評価することが記載されていますマルハナバチ ）7、22。キニーネは、植物の蜜で発見されていないが、このアルカロイドは、多くの場合、ハチ7,9,12,13,22における行動や生理学的研究における嫌悪刺激として使用されています。この方法は、試験溶液との最初の口吻の接触の間に大きな解像度でマルハナバチ」口器をビデオ録画することを含みます。具体的には、摂食応答の微細構造は、連続的に2分間隔で動作を採点することによって検査されます。消費された溶液の量は、給餌期間中に測定されるので、食べる食物の量の微細構造と相関させることができます摂食行動。また吻後退の速度が能動的回避の指標として測定されるので、事前摂食検出。
Protocol
Representative Results
Discussion
この小説の行動アッセイでは、キニーネはバフ尾のマルハナバチ蜂の供給を阻止することが示されています。水と減少テングの接触時間と給電試合周波数やキニーネが混入ショ糖溶液は、非栄養または潜在的に有毒なソリューションの更なる送りを開始する拒否としてここに解釈されます。キニーネは、それらが消費する溶液の体積を減少させる1 Mショ糖溶液、マルハナバチないだけに追加されると、それらはまた、このように口器と毒素を含む溶液との接触時間を減少させる、高速吻状部を後退させます。一緒に、これらの結果は、すでに以前にミツバチ9で識別されるキニーネが、熊蜂の口器に味覚受容体細胞によって認識されることを示唆しています。キニーネは、マラリア蚊（ ハマダラカ ）23でミツバチ10とノックダウンに倦怠感のような挙動を誘発する昆虫のための毒素です。このアッセイはよくidentificatにつながる可能性マルハナバチで口器に味覚受容体細胞によって認識されているいくつかの抑止力と潜在的に有毒な化合物のイオン。
微小管は試験段階を通じて持続する試験溶液の十分量で充填されることが重要です。マイクロキャピラリーチューブ（ 例えば 70〜80マイクロリットル）の少なくとも周りの四分の三が満たされることをお勧めします。しかし、ケアは完全スキャンの処理中に流出のリスクを軽減するために、マイクロキャピラリーチューブを記入し、実験装置にマイクロキャピラリーチューブを装着しないように注意しなければなりません。実験者は、保持管に液滴を漏れることを回避するように、マルハナバチへの500mMショ糖液滴を提示するときのケアにも注意が必要です。
保持管の先端の4ミリメートルの穴は自然に試験溶液に向かってその口吻を拡張するために大人ワーカーマルハナバチ蜂のための十分な大きさです。しかし、可能性がありますマルハナバチは、彼らのproboscisesを拡張する前に、それらのアンテナで溶液を味わうことができます。 PERは、糖液15とのアンテナを刺激することにより、マルハナバチにおいて誘発することができたので、これは口吻拡張の確率に影響を与える可能性があります。実際には寄生蜂（Trissolcus brochymenae）24やミツバチ13のようなハチの触角は、彼らはキニーネのような糖や毒素を味わうすることができ、味の感覚器が装備されています。その結果、キニーネのような高度な抑止力の化合物を含む溶液との最初の触角の連絡先は、その口吻を拡張するために熊蜂のモチベーションを低下させるため、実験的な成功率に影響を与える可能性があります。試験溶液と触角の接触を制御することはできませんが、本研究では、我々は試験溶液に向けて口吻の延長上に触角接触の任意の有意な効果を見つけることができませんでした。このアッセイでは、すぐ前のテスト段階ワット後にマイクロキャピラリーチューブを設定しますマルハナバチ」のアンテナは、保持チューブ内に残っている鶏は自分のアンテナをもつ試験溶液を味わうマルハナバチの機会を減らすことができます。
モーショントラッキングのビデオソフトウェアを使用して、第1の口先の接触後の試験溶液から離れて口吻の後退を追跡するとき、このアッセイの主な制限が生じます。ビデオ映像は吻の2次元の動きを表示するので、速度計測の与えられた出力は、下または過大評価することができます。しかし、いくつかの変更を加えて、アッセイのこの側面を向上させることができました。
このアッセイは、天然の植物二次代謝産物を含む種々の化合物を含有する溶液に向けて自然摂食応答を観察するために使用することができます。このアッセイと直接送り応答を観察することマルハナバチは、これらの化合物を検出する方法に関する詳細な情報を提供します。これはPER 18,19のような既存の「行かない-noが行く」の方法よりも有利で す</sup>この方法は、離散送り試合中の食物消費を含むいくつかの行動の対応策を生成するので、7 2択アッセイオーバー。
同時にいくつかのパラメータを測定することは、化合物の嗜好性をよりよく評価することができます。我々のアッセイの例では、マルハナバチは、水またはキニーネが混入ショ糖ソリューションを消費しません。テングの後退は、糖受容体細胞12,13の応答の変化によって発生する可能性があります。私たちのアッセイは、マルハナバチが水単独よりもショ糖を加えたキニーネのソリューションを接触させた後に速く口吻を撤回することを示しています。これは、キニーネがニューロン9,12,13,25を感知砂糖を阻害することに加えて、ニューロンの別個のセットに影響を与えることを示唆している可能性があります。
私たちのアッセイは、給紙時の行動応答の時間的パターンの分析を可能にします。消費時間と発作の数が測定された同様のプロトコルは、アルがあります準備は栄養と非栄養糖26にショウジョウバエの摂食応答を評価するために実施されて。私たちは、ミツバチが保持管21に自由に動くことができるので、ミツバチは、PERなどの他の方法に比べて我々のアッセイにおける摂食刺激に、より信頼性の高い応答を示すであろうと予測しています。この技術は、栄養素やマルハナバチ、潜在的に他の蜂種を送り込むのメカニズムを照明する毒素のための味覚閾値の徹底的な分析を可能にします。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、リーバーヒューム信託の助成金（RPG-2012から708）とGAWにBBSRCの助成金（BB / M00709X / 1）によって賄われていました。
Materials
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
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