A Novel Verhaltenstest Gustatory Antworten einzelner, frei beweglichen Bumble Bees zur Untersuchung (<em> Bombus terrestris</em>)
Summary
A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.
Abstract
Generalist Bestäuber wie die buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, stoßen beide Nährstoffe und Giftstoffe in der Blumennektar sie von blühenden Pflanzen zu sammeln. Nur wenige Studien haben die geschmackliche Reaktionen der Bienen zu Toxine in Lebensmitteln beschrieben, und diese Versuche haben in erster Linie die Rüssel Verlängerung Antwort auf verhaltene Honigbienen verwendet. Hier wird ein neuer Verhaltenstest wird zur Messung der Fütterung Antworten von frei bewegenden, einzelne Arbeiter Hummeln auf Nährstoffe und Giftstoffe vorgestellt. Dieser Test misst die Menge der Lösung von jedem bumble bee aufgenommen und zeigt auf, wie tastants in der Nahrung die Mikrostruktur des Fressverhalten beeinflussen.
Die Lösungen werden in einem Mikrokapillarröhre auf einzelne Hummel dargestellt, die für 2-4 Stunden vorher ausgehungert wurden. Das Verhalten wird auf digitalen Video aufgenommen. Die Feinstruktur des Fütterungsverhaltens wird durch kontinuierliches Einkerben der Position des probo analysiertscis (Mundwerkzeuge) von Videoaufzeichnungen Ereignisprotokollierung Software. Die Position des Rüssels von drei verschiedenen Verhaltenskategorien definiert ist: (1) Rüssel ausgefahren und in Kontakt mit der Lösung, (2) Rüssel verlängert, aber nicht in Kontakt mit der Lösung und (3) Rüssel unter dem Kopf verstaut. Weiterhin wird die Geschwindigkeit der Rüssel aus der Lösung Zurückziehen entfernt wird ebenfalls geschätzt.
In dem vorliegenden Test der Lösung das Volumen die Anzahl der Fütterung Anfälle wird die Dauer der Fütterungs Anfälle und die Geschwindigkeit des Rüssels Retraktion nach dem ersten Kontakt verbraucht wird, verwendet, um die phagostimulatory oder die abschreckende Wirkung der getesteten Verbindungen zu bewerten.
Dieser neue Geschmackstest wird den Forschern ermöglichen, zu messen, wie Verbindungen in Nektar das Fressverhalten der Bienen beeinflussen gefunden und wird auch auf die Bestäubung Biologen, Toxikologen und Neuroethologen nützlich sein, die Hummel Geschmack System zu studieren.
Introduction
Plant-Bestäuber-Wechselwirkungen sind komplex. Bestäuber besuchen Blüten Nektar und Pollen als Nahrung zu erhalten; wiederum Bestäuber erleichtern sexuelle Fortpflanzung bei Pflanzen. Während diese Beziehung meist mutualistic ist, Blütennektar und Pollen manchmal Giftstoffe enthalten oder andere Pflanzenstoffe 1-5 die Bestäuber schädigen können. Die ökologische Gründe für das Vorhandensein solcher Verbindungen in Nektar und Pollen ist in allen Einstellungen nicht klar. Eine noch offene Frage in diesem Bereich ist, wie Bestäubern wie Bienen erkennen und vermeiden Blumen mit Nektar enthält Giftstoffe.
Die Hummelarten, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), ist ein Generalist Bestäuber, die die Blüten vieler Pflanzenarten , darunter diejenigen , die Herstellung Nektar besucht enthält Giftstoffe 6. Hummeln wurden in einer 24 – Stunden – zwei-Wahl – Test 7 aufwendige Lösungen , die hohe Konzentrationen von Giftstoffen zu vermeiden gezeigt. Dieser Testder Verzehr von Lebensmitteln von Tiedeken et al. 7 gezeigt , dass Bienen Bitterstoffe in Lösungen erkennen kann. Jedoch war dieser Assay nicht in der Lage Geschmack von post-Ingestiv Prozessen zu unterscheiden , wie Unwohlsein , das auch Fressverhalten über diesem Zeitintervall 8-10 beeinflussen könnten.
Bienen besitzen Geschmacks- sensilla auf ihren Antennen, Mundwerkzeuge und tarsi Verbindungen nachzuweisen 13.11. Der Rüssel – Streckreflex (PER) Experimente beinhalten Zurückhalten einzelner Bienen in einem Gurtzeug und dann der Biene antennal sensilla stimulieren die Fütterung 14-17 Reflex zu erzeugen. Bienen können in einzelnen Geschirre zurückgehalten werden und dann stimuliert die Verfütterung Reflex als Test ihrer Fähigkeit , Verbindungen zu schmecken 18,19 zu erzeugen. Andere haben die pro Assay modifiziert 9,20 die Empfindlichkeit der Antennen oder Mundwerkzeuge , um Giftstoffe zu untersuchen. Allerdings werden die Bienen auf Stress ausgesetzt während nutzbar zu machen. Dies könnte Einfluss darauf, wiesie reagieren 21 auf Verbindungen.
Hier wird ein neuer Test wird beschrieben , um die Verhaltensgeschmacksreaktion von frei beweglichen Hummeln zu Saccharose und Chinin zu beurteilen, ein Alkaloid , das bereits berichtet wurde als Abschreckungsmittel 9 und giftig 10 bis Honigbienen (Apis mellifera) und Hummeln (Bombus terrestris) 7, 22. Obwohl Chinin nicht in Pflanzennektar gefunden worden ist , wird das Alkaloid oft als aversiven Reiz in verhaltensmäßigen und physiologischen Studien in Bienen verwendet 7,9,12,13,22. Das Verfahren beinhaltet das Video der Hummeln "Mundwerkzeuge in großer Auflösung während der anfänglichen Rüssel Kontakt mit den Testlösungen aufnehmen. Insbesondere wird die Feinstruktur des Zuführungs Reaktion kontinuierlich geprüft Verhalten über einen 2 min Intervall erziehlt. Das Volumen der Lösung verbraucht wird, während der Fütterungsperiode gemessen und so die Menge der aufgenommenen Nahrung kann mit der Mikrostruktur von korreliert werdendas Fressverhalten. Auch die Geschwindigkeit des Rüssels Retraktion gemessen wird, als ein Indikator eines aktiven Vermeidungs und daher vorge Ingestiv Detektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit diesem neuartigen Verhaltenstest wird Chinin Fütterung der buff-tailed bumble bee abzuschrecken gezeigt. Die reduzierte Rüssel Kontaktzeit und Fütterung Kampf Frequenz mit Wasser oder Zuckerlösung mit Chinin geschnürt wird hier als Ablehnung interpretiert weiter zu initiieren auf nicht-nahrhaften oder potentiell toxischen Lösungen zuzuführen. Wenn Chinin bis 1 M Saccharose-Lösung hinzugefügt wird, Hummeln reduzieren nicht nur das Volumen der Lösung, die sie verbrauchen, auch sie die Rüssel schneller zurückziehen, so dass die Kontaktzeit zwischen den Mundwerkzeuge und der Lösung reduziert ein Toxin enthält. Zusammen legen diese Ergebnisse nahe , dass Chinin durch die geschmackliche Rezeptorzellen auf den Mundwerkzeuge der Hummel wahrgenommen wird, wie bereits zuvor 9 bei der Honigbiene identifiziert. Chinin ist ein Toxin für Insekten , die Malaise-ähnliches Verhalten bei der Honigbiene 10 und Zuschlag in der Malaria – Mücke (Anopheles gambiae) 23 induziert. Dieser Test könnte auch auf die Bezeichnung Bezeichnung der führenIon einiger abschreckend und potentiell toxischen Substanzen, die von den Geschmacksrezeptorzellen auf den Mundwerkzeuge in den Hummeln wahrgenommen werden.
Es ist entscheidend für die Mikrokapillare Rohr mit einem ausreichenden Volumen der Testlösung gefüllt werden während der gesamten Testphase dauern. Es wird empfohlen, mindestens etwa drei Viertel des Mikrokapillarröhre (zB 70-80 ul) gefüllt ist. Allerdings sollte darauf nicht vollständig auf das Mikrokapillarröhre füllen werden ergriffen, um die Gefahr von Verschütten während des Prozesses des Abtastens und Anbringen des Mikrokapillarröhre der experimentellen Vorrichtung zu reduzieren. Vorsicht ist auch geboten, wenn die 500 mM Saccharose Tröpfchen auf die Hummel präsentiert, so dass der Experimentator vermeidet das Tröpfchen in das Halterohr undicht.
Das 4-mm-Loch an der Spitze des Halterohrs ist groß genug für einen Erwachsenen Arbeiter bumble bee auf natürliche Weise ihre Rüssel in Richtung der Testlösung erweitern. Es ist jedoch möglich, dassHummeln können die Lösung mit ihren Antennen schmecken, bevor sie ihre Rüssel erstrecken. Dies könnte die Wahrscheinlichkeit von Rüssel Erweiterung beeinflussen als PER durch die Stimulierung ihre Antennen mit einer Zuckerlösung 15 in Hummeln hervorgerufen werden könnte. In der Tat die Antennen von Hautflügler wie die Legimmen (Trissolcus brochymenae) 24 oder der Honigbiene 13 sind mit Geschmack sensilla ausgestattet, so dass sie Zucker und Giftstoffe wie Chinin zu schmecken. Folglich anfängliche antennal Kontakte mit Lösungen sehr abschreckend Verbindungen wie Chinin enthält, könnte auch die Motivation einer Hummel reduzieren, um ihre Rüssel verlängern und damit den experimentellen Erfolgsrate beeinflussen. Obwohl antennal Kontakt mit der Testlösung nicht kontrolliert werden kann, in der vorliegenden Studie haben wir keine wesentlichen Auswirkungen von antennal Kontakt auf Rüssel Erweiterung in Richtung der Testlösung zu finden. In diesem Test einrichten, sofort die Mikrokapillarröhre nach dem Pre-Testphase wenn die Hummeln 'Antennen noch innerhalb der Halterohr sind, können die Möglichkeit zu reduzieren für die Hummeln die Testlösung mit ihren Antennen zu schmecken.
Die Hauptbeschränkung dieses Assays entsteht, wenn der Rüssel Retraktion von der Testlösung nach der ersten Rüssel Kontakt Verfolgen der Bewegungsverfolgungs Video-Software. Das Videomaterial zeigt nur 2D-Bewegung des Rüssels, so kann die gegebene Ausgabe der Geschwindigkeitsmessung unter oder über abgeschätzt werden. Jedoch mit einigen Modifikationen, könnte dieser Aspekt des Assays verbessert werden.
mit verschiedenen Verbindungen, einschließlich natürlich vorkommenden pflanzlichen Sekundärmetaboliten Dieser Test kann verwendet werden, um natürliche Fütterung Antworten zu Lösungen beobachten. Die Beobachtung der direkten Verfütterung Antworten mit diesem Test gibt detaillierte Informationen darüber, wie Hummeln diese Verbindungen erkennen. Dies ist von Vorteil gegenüber bestehenden 'go-no go' Methoden wie PER 18,19 </sup> Und über zwei Wahl – Assays 7 , da diese Methode bei einer diskreten Fütterung Kampf mehrere Verhaltensreaktion Maßnahmen einschließlich Nahrungsmittelverbrauch produziert.
mehrere Messparameter ermöglicht gleichzeitig eine bessere Beurteilung der Schmackhaftigkeit einer Verbindung. Zum Beispiel in unserem Test, Hummeln vermeiden Wasser verbrauchen oder die Saccharose-Lösung mit Chinin geschnürt. Zurückziehen des Rüssels könnte durch eine Änderung in den Reaktionen der Zuckerrezeptorzellen 12,13 verursacht werden. Unser Test zeigt, dass Hummeln die Rüssel schneller zurückziehen, nachdem die Saccharose und Chinin-Lösung als Wasser allein in Kontakt steht; Dies könnte , dass Chinin schlagen eine Reihe von Neuronen zusätzlich zur Hemmung der Zuckersensorneuronen 9,12,13,25 beeinflusst.
Unser Assay erlaubt die Analyse der zeitlichen Muster der Verhaltensreaktionen während des Fütterns. Ein ähnliches Protokoll, bei dem die Verbrauchszeit und die Anzahl der Zeiträume gemessen hat albereit worden , um die Fütterung Reaktion von Drosophila zu nahrhaften und nicht nahrhaften Zucker 26 zu bewerten , umgesetzt. Wir gehen davon aus, dass die Bienen eine zuverlässigere Reaktion auf Fraßstimulantien in unserem Test als in anderen Verfahren wie PER aufweisen, weil die Bienen 21 frei bewegen kann in dem Halterohr sind. Diese Technik wird eine umfassende Analyse der Geschmacksschwellen erlauben für Nährstoffe und Giftstoffe, die Mechanismen zu beleuchten, der in Hummeln Fütterung und möglicherweise auch andere Bienenarten.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Leverhulme Trust Zuschuss (RPG-2012-708) und einem BBSRC Zuschuss (BB / M00709X / 1) zu GAW finanziert.
Materials
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
Riferimenti
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