Bruk av Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) for å undersøke Effector Trans Effektivitet av<em> Coxiella burnetii</em> Under siRNA lyddemping

Coxiella burnetii er en unik intracellulær patogen som forårsaker zoonotiske menneske-smitte Q-feber. Denne sykdommen er assosiert med et vidt spektrum av kliniske presentasjoner som strekker seg fra asymptomatisk serokonversjon til livstruende kronisk infeksjon som ofte manifesterer seg som endokarditt år etter eksponering ^1. Humant infeksjon skjer først og fremst ved inhalering av aerosoler forurenset med drøvtyggere den store reservoar for infeksjon, spesielt melkekyr, sauer og geiter. Selv Coxiella infeksjon i disse dyrene er vanligvis subklinisk, kan infeksjonen utløse abort og betydelig bakteriemengden i birthing væske og morkaken kan forurense nærmiljøet ^en. Et eksempel på den enorme byrden slik forurensning kan ha på både folkehelsen og landbruket ble nylig observert i Q-feber utbrudd som skjedde i Nederland ^to. Mellom 2007 og2010 ble over 4000 menneskelige tilfeller av Q-feber diagnostisert og dette utbruddet var knyttet til betydelig forurensning av geit gårder ^3. I tillegg er Coxiella en potensiell biologisk våpen, som klassifisert av US Centers for Disease Control and Prevention, på grunn av de miljømessige stabiliteten av bakterier og lav smittedose er nødvendig for å forårsake alvorlig sykdom og død ^fire.

Coxiella finnes i to faser: Fase I organismer, isolert fra naturlige kilder, er svært virulente og fase II organismer er sterkt svekket in vivo. For eksempel, etter flere in vitro passasjer av Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismer, ble Fase II bakterier produsert som inneholder en irreversibel kromosom sletting resulterer i forkortet lipopolysakkarid (LPS) ^5. Denne belastningen, C. burnetii NMII, er fenotypisk lik fase I i vevskultur modeller og gir et sikrere modusl for forskere å studere Coxiella patogenesen i laboratorier ^5. I de senere årene har flere gjennombrudd har raskt avanserte innen Coxiella genetikk. Mest spesielt utviklingen av axenic media (surgjort sitrat cystein medium – ACCM-2) har tillatt den cellefrie vekst av Coxiella både i flytende og på faste medier ^6,7. Dette resulterte i direkte forbedringer av genetiske verktøy tilgjengelig for Coxiella inkludert en induserbar genuttrykksystem transporttjenester vektorer og tilfeldige transposon systemer ^8-11. Nå nylig, har to metoder for målrettet genet inaktive også blitt utviklet, banet vei for å undersøke spesifikke virulens gen kandidater ^12.

Etter internalisering av alveolære makrofager, Coxiella replikerer til høye tall innenfor et membranbundet rommet kalt Coxiella- inneholder vakuole (CCV). CCV krever verts endocytic menneskehandel thgrove tidlige og sene endosomer før den modnes inn i en lysosome-avledet organ ^13. Gjennom hele denne prosessen, kjøper CCV vertsfaktorer som enten vises forbigående eller forbli knyttet til vakuole, inkludert, men ikke begrenset til, Rab5, Rab7, CD63 og ^LAMP-13 til 15 januar. Replikering av Coxiella innenfor vertsceller er helt avhengig av et fullt funksjonelt Dot / Icm Type IVB Sekresjon System (T4SS) ^8,16,17. Dette sekret system er et multi-proteinstruktur slektsmessig relatert til konjugering systemer og strekker seg over både bakterielle og vacuolar membraner for å levere bakterielle proteiner, betegnet effektorer, i verten cytoplasma ^18. Den Coxiella T4SS er funksjonelt svært lik den godt karakterisert Type IVB Dot / Icm Sekresjon System of Legionella pneumophila ^19,20. Interessant, aktivering av T4SS og påfølgende effektor trans ikke skje før Coxiella når den sure lysosomet-avlededeorganelle, ca 8 timer etter infeksjon ^17,21. Hittil har over 130 Dot / ICM effektorer blitt identifisert ^9,17,22-24. Mange av disse effektorer sannsynlig spiller viktige roller under replikering av Coxiella innenfor vertsceller; men har bare noen få effektorer blitt funksjonelt preget ^25-29.

I denne studien benytter vi en fluorescens-basert assay translokasjon som er avhengig av spalting av CCF2-AM FRET substrat (heretter referert til som BLAM substrat) via β-laktamase-aktivitet i vertscellen cytoplasma (figur 1). Genet av interesse fusjonert til TEM-1 β-laktamase (BLAM) på en reporter plasmid som gir konstitutiv ekspresjon. Den BLAM substratet er sammensatt av to fluoroforer (kumarin og fluorescein) som danner et FRET par. Eksitasjon av kumarin resulterer i FRET av fluorescein og grønne fluorescensemisjonen i fravær av effektoren translokasjon; Hvis imidlertid BlaM-effektor-fusjonsprotein blir translokert inn i verts cytoplasma, den resulterende β-laktamase-aktivitet spalter β-laktam-ring av BLAM substratet, separering av FRET paret fremstilling blå fluorescens-emisjon etter eksitasjon. Denne trans analysen har blitt godt dokumentert som en tilnærming for å identifisere effektor proteiner fra en rekke forskjellige intracellulære og ekstracellulære bakterier, inklusive C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogen E. coli, Salmonella og Brucella ^17,30-35.

For å finne ut hvilken rolle spesifikke vertsfaktorer på Coxiella effektor trans vi benytter en veletablert metode for genet Slå kjent som RNA-interferens, særlig små interfererende RNA (siRNA). Opprinnelig identifisert i Caenorhabditis elegans, er RNA interferens en konservert endogen cellulær prosess som brukes for medfødt defense mot virus, så vel som genregulering ^36,37. Etter binding av sekvens-spesifikk siRNA, degradering av mRNA skjer gjennom RISC (RNA-induced Slå kompleks) som resulterer i spesifikke genet Slå eller knockdown ^38. I denne studien ble siRNA brukes til å målrette to verts proteiner, Rab5A og Rab7A, som er viktige regulatorer av endocytoseveien. Virkningen av stanse Rab5A og Rab7A på effektor trans ble konstatert ved hjelp av C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 ble valgt som det var tidligere vist seg å være translocated av Dot / Icm sekresjon system av Coxiella ^17.

Utnytte både siRNA genet Slå og fluorescencebased trans analysen beskrevet her, er vi i ferd med å etablere en rolle for vertsfaktorer i trans av effektor proteiner ved Coxiella. Denne tilnærmingen kan brukes på et stort utvalg av både intracellulære og ekstracellulære bakterier som innehar lignende secretion-systemer som er ansvarlig for translokasjon av effektor proteiner.