적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em> Coxiella burnetii의</em> siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii의는 인수 공통 인체 감염 Q 열병을 일으키는 독특한 세포 내 병원균이다. 이 질환은 증상이 혈청에서 종종 노출 ^한 후 심내막염 년으로 나타난다 생명을 위협하는 만성 감염 연장 임상 프레 젠 테이션의 광범위한 스펙트럼과 연결됩니다. 인간의 감염은 주로 반추 동물, 특히 젖소, 양, 염소 감염의 주요 저수지와 오염 된 에어로졸의 흡입을 통해 발생합니다. 이러한 동물 Coxiella 감염은 일반적으로 무증상이지만 감염 낙태를 트리거 할 수 있으며, 유체 출산 및 태반 내의 상당한 세균 부하는 ^한 로컬 ^{환경을 오염시킬} 수있다. 공중 보건과 농업 산업 모두 최근 네덜란드 ^2에서 발생한 Q 열병 발생이 관찰되었다에 엄청난 부담 등 오염의 예는 수 있습니다. 2007 년과 사이2010, Q 열병 4,000 통해 인간의 경우는 진단받은이 발발은 염소 농장 ^3의 중요한 오염에 연결되었다. 또한, Coxiella 인해 심각한 이환율과 사망률 ^(4)을 일으킬 수있는 박테리아와 필요한 낮은 전염성 선량의 환경 안정성에 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 분류로, 잠재적 인 생물학적 무기입니다.

Coxiella은 두 단계에 존재하는 천연 소스에서 고립 된 단계 I 생물은 매우 악성이며, 단계 II 생물이 높은 생체 내에서 감쇠된다. 예를 들어, Coxiella burnetii 나인 마일 단계 I 생물의 여러 체외 통로 후, 단계 II 박테리아가 절단 된 리포 폴리 사카 라이드의 결과로 돌이킬 수없는 염색체 삭제를 포함하는 제조 하였다 (LPS) ^5. 이 균주, C. burnetii NMII는 조직 배양 모델 I, 위상 표현형 유사하고 안전한 모드를 제공한다연구진은 실험실 ⁵ Coxiella의 발병 기전을 연구하기위한 리터. 최근 몇 년 동안 몇 가지 혁신이 빠르게 Coxiella 유전학의 분야를 전진했다. 특히, 무균 매체의 개발 (시트르산 시스테인 매체 산성화 – ACCM-2)는 모두 액체 및 고체 배지에 ^6,7 Coxiella의 무 세포 성장을 허용했다. 이것은 유도 유전자 발현 시스템, 셔틀 벡터 및 랜덤 트랜스포존 시스템 ^8-11 포함 Coxiella 가능한 유전 도구 직접 개선 결과. 가장 최근에, 대상 유전자의 불 활성화에 대한 두 가지 방법이 특정 독성 유전자 후보 ^(12)를 조사하기위한 방법을 포장, 개발되었다.

폐포 대 식세포에 의해 내재화 이어 Coxiella는 막 결합 구획 내에 높은 번호에 복제는 액포 (CCV)을 함유 Coxiella- 불린다. CCV는 호스트 세포 내 이입 매매 일이 필요합니다거친 초기와 후기 엔도 좀이 리소좀 유래 세포 기관 ^(13)에 성숙 할 때까지. 이 과정을 통해 상기 CCV 중 하나가 일시적으로 나타나거나 포함 액포와 연관되지만 Rab5, Rab7, CD63 및 LAMP-1 ^13-15에 한정되지 유지 숙주 요인을 취득한다. 숙주 세포 내에서 Coxiella의 복제는 완전한 기능 도트 / ICM 형 IVB 분비 시스템 (T4SS) ^8,16,17에 전적으로 의존한다. 이 분비 시스템 ancestrally 공액 시스템과 관련된 여러 단백질 구조 및 박테리아 단백질을 제공하기 위해 모두 세균과 액포 막에 걸쳐 호스트 세포질 ^18에, 이펙터 불린다. Coxiella T4SS는 기능적으로 레지오넬라 뉴모 필라 ^{(19, 20)의} 잘 특징 유형 IVB 점 / ICM 분비 시스템과 매우 유사합니다. Coxiella이 리소좀 유래 산성에 도달 할 때까지 흥미롭게 T4SS 이후 이펙터 전위의 활성화가 발생하지 않는다세포 기관, 약 8 시간 게시물 감염 ^17,21. 현재까지 130여 점 / ICM 이펙터는 ^{9,17,22-24를} 확인되었습니다. 이 이펙터의 대부분은 가능성이 숙주 세포 내에서 Coxiella의 복제시 중요한 역할을; 단, 약간의 이펙터 기능 ^{25-29 특성화되었다.}

본 연구에서 우리는 숙주 세포의 세포질 내 β-lactamase의 활성을 통해 (이하 BLAM 기판이라 함) CCF2-AM FRET 기판 (도 1)의 절단에 의존하는 형광 기반 전위 분석을 이용한다. 관심의 유전자는 구성 적 발현을 제공하는 리포터 플라스미드에 β-lactamase를 (연기하는거야)-1 TEM 융합된다. BLAM 기판을 FRET 쌍을 형성하는 두 개의 형광 발색단 (쿠마린 및 플루오 레세 인)로 구성되어있다. 플루 오레 신 및 이펙터 전위의 부재하에 녹색 형광 발광의 FRET의 쿠마린의 여기 결과; 그러나, 만약 즐M 이펙터 융합 단백질은 호스트 세포질로 전좌하고, 얻어진 β-lactamase의 활성을 절단 여진 다음 청색 형광 방출을 생산 FRET 쌍을 분리 BLA​​M 기판의 β 락탐 고리. 이 전위 분석이 잘 C. 등 다양한 세포 내 및 세포 외 박테리아의 범위에서 이펙터 단백질을 식별하는 방식으로 입증되었다 burnetii, L. 뉴모 필라, L. longbeachae, 클라미디아 트라코마 티스, 장내 유해 E. 대장균, 살모넬라 균 및 브루셀라 ^17,30-35.

Coxiella 이펙터 전위 특정 숙주 인자의 역할을 결정하기 위해 우리는 특히 작은 간섭 RNA의 (siRNA의), RNA 간섭으로 알려진 유전자 침묵을위한 확립 된 방법을 이용한다. 원래 예쁜 꼬마 선충에서 발견, RNA 간섭은 타고난 defe에 사용되는 보존 내생 세포 과정바이러스에 대한 NSE뿐만 아니라 유전자 조절 ^{(36, 37).} 서열 – 특이 적 siRNA를 바인딩 한 후 mRNA를 분해 특정 유전자 침묵 또는 최저 ³⁸ 결과 (RNA 유도 침묵 복합체) RISC 통해 발생한다. 이 연구에서의 siRNA가 세포 내 이입 경로의 중요한 레귤레이터 두 호스트 단백질 Rab5A 및 Rab7A를 대상으로 하였다. 이펙터 전위에 Rab5A 및 Rab7A 입을의 영향 C.을 사용하여 확인 하였다 burnetii pBlaM-CBU0077. 것은 이미 Coxiella ¹⁷ 도트 / ICM 분비 시스템 전좌 것으로 나타났다 CBU0077로 선택 하였다.

siRNA의 유전자 사일런 여기 기재된 fluorescencebased 전위 분석 양쪽을 이용하여 우리는 Coxiella 이펙터 단백질의 전위에 숙주 인자의 역할을 설정하기 시작한다. 이 방법은 유사한 secretio 소유 모두 세포 내 및 세포 외 박테리아의 넓은 범위에 적용될 수있다이펙터 단백질의 전위에 대한 책임 N 시스템.