החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em> Burnetii Coxiella</em> במהלך siRNA השתקה
Summary
חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם.
Abstract
Burnetii Coxiella, הגורם הסיבתי של קדחת Q, הוא פתוגן תאיים שנשענת על סוג IV Dot / ICM הפרשת מערכת להקים נישה בשכפול הדנ"א. קבוצה של effectors הם translocated דרך המערכת הזאת לתוך התא המארח כדי לתפעל תהליכים המארח לאפשר את הקמתה של vacuole ליזוזום הנגזרות ייחודי עבור שכפול. השיטה המוצגת כאן כוללת שילוב של שתי טכניקות ומבוססות: להשתקת גנים ספציפית באמצעות siRNA ומדידה של טרנסלוקציה מפעיל באמצעות מצע סריג מבוסס המסתמך על פעילות β-lactamase. במסגרתו קיימים שתי גישות אלה, אנו יכולים להתחיל להבין את התפקיד של גורמים מארחים בתפקוד טרנסלוקציה מפעיל מערכת הפרשת חיידקים. במחקר זה בדקנו את התפקיד של Rab5A ו Rab7A, הוא רגולטורים חשובים של מסלול סחר endocytic. אנו מראים כי השתקת ביטוי גם בתוצאות חלבון לירידה מפעיל translocatioיעילות n. ניתן שיטות אלה לשנות בקלות לבחון פתוגנים תאיים תאיים אחרים כי גם לנצל מערכות הפרשה. בדרך זו, תמונה גלובלית של גורמי מארח מעורבים טרנסלוקציה מפעיל חיידק עשויה להתגלות.
Introduction
Burnetii Coxiella הוא פתוגן תאי ייחודי שגורם קדחת Q הידבקות בני אדם zoonotic. מחלה זו קשורה עם קשת רחבה של מצגות קליניות המשתרעות seroconversion אסימפטומטית לזיהום כרוני מסכנות החיים שבאו לידי לעתים קרובות ככל שנים אנדוקרדיטיס לאחר חשיפת 1. הדבקת בני אדם מתרחשת בעיקר באמצעות השאיפה של אירוסולים מזוהמים מעלי גירת המאגר העיקרי לזיהום, בפרט, פרות חולבות, כבשים ועזים. למרות זיהום Coxiella אצל בעלי חיים אלה הוא בדרך כלל תת-קליני, הזיהום עלול לגרום להפלה ואת עומס החיידקים ניכר בתוך נוזל שלית הלידה יכול לזהם בסביבה המקומית 1. דוגמה של זיהום כגון עומס עצום יכול להיות משני בריאות הציבור ועל ענף החקלאות נצפתה לאחרונה פרוץ קדחת Q שאירעו בהולנד 2. בין 2007 ו2010 למעלה מ -4,000 מקרים של בני אדם קדחת Q אובחנו פרוץ זה היה קשור זיהום משמעותי של חוות עיזים 3. בנוסף, Coxiella הוא נשק ביולוגי פוטנציאלי, כפי שסווג על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן, הודות ליציבות הסביבה של חיידקי מנת זיהומיות נמוכה צורך לגרום לתחלואה חמורה ולתמותה 4.
Coxiella קיים בשני שלבים: שלב א 'אורגניזמים, מבודדים ממקורות טבעיים, הם ארסיים מאוד Phase II אורגניזמים הם נחלשו מאוד in vivo. לדוגמא, לאחר קטעי מספר במבחנה של Coxiella burnetii תשע המייל Phase I אורגניזמים, שני חיידקי השלב הופקו המכילות מחיקה כרומוזומליות בלתי הפיכה ותוצאת lipopolysaccharide הקטום (LPS) 5. זן זה, ג burnetii NMII, הוא phenotypically דומה Phase I במודלים בתרבית רקמה ומספק במצב בטוחl לחוקרים ללמוד בפתוגנזה Coxiella במעבדות 5. בשנים האחרונות כמה פריצות דרך במהירות קידמו בתחום הגנטיקה Coxiella. בעיקר, התפתחות המדיה axenic (acidified בינוני ציסטאין ציטראט – ACCM-2) אפשר את הגידול ללא תאים של Coxiella בשני הנוזליים על תקשורת מוצקה 6,7. זה הביא לשיפור ישיר של כלים גנטיים זמינים Coxiella כולל מערכת ביטוי גנים מושרה, וקטורי הסעות ומערכות transposon אקראיים 8-11. לאחרונה, שתי שיטות איון גן ממוקד גם פותחו, לסלול את הדרך לבחינת מועמדים גנים ארסיות ספציפית 12.
בעקבות הפנמה על ידי מקרופאגים מכתשיים, Coxiella משכפל למספרים גבוהים בתוך תא קרום נכנס כינת Coxiella- המכיל vacuole (CCV). CCV דורש סחר endocytic מארח הendosomes המוקדם והמאוחר הגס עד שהוא מבשיל לכדי אברון נגזר ליזוזום 13. לאורך כל התהליך הזה, CCV רוכש גורמים מארחים כי גם מופיעים זמני או להישאר הקשורים vacuole, לרבות, אך לא רק, Rab5, Rab7, CD63 ו LAMP-1 13-15. שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים תלוי לחלוטין מערכת הפרשה Dot מתפקדת במלואה / ICM סוג IVB (T4SS) 8,16,17. מערכת ההפרשה זהו מבנה רב-חלבון הקשורים אבותיהם של מערכות נטייה והוא משתרע הוא ממברנות חיידקי vacuolar לספק חלבונים חיידקיים, כינת effectors, לתוך הציטופלסמה המארח 18. Coxiella T4SS מבחינה פונקציונלית מאוד דומה היטב את המערכת מאופיינת סוג IVB Dot / הפרשת ICM של הלגיונלה pneumophila 19,20. מעניין לציין, כי הפעלת טרנסלוקציה מפעיל T4SS ולאחר אינה מתרחשת עד Coxiella מגיע ליזוזום הנגזרות חומציאברון, כ 8 שעות לאחר הפגיעה 17,21. נכון להיום, מעל 130 effectors Dot / ICM זוהה 9,17,22-24. רבי effectors אלה לשחק תפקידים חשובים סבירים בעת שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים; עם זאת, effectors רק כמה מתאפיינים תפקודי 25-29.
במחקר זה אנו מנצלים assay טרנסלוקציה הקרינה מבוססי המסתמכת על המחשוף של המצע CCF2-AM סריג (להלן המכונה המצע כלאם) באמצעות פעילות β-lactamase בתוך הציטופלסמה התא המארח (איור 1). הגן של עניין הוא התמזג TEM-1 β-lactamase (בום) על פלסמיד כתב המספק ביטוי מכונן. מצע כלאם מורכב משני fluorophores (coumarin ו והעמסה) יוצרות זוג סריג. עירור של תוצאות coumarin ב סריג של וההעמסה ו פליטת קרינה ירוקה בהעדר טרנסלוקציה מפעיל; עם זאת, אם בלהM-מפעיל חלבון היתוך הוא translocated לתוך הציטופלסמה המארחת, כתוצאת β-lactamase פעילות וחותכת את טבעת β-לקטם של מצע כלאם, הפרדת זוג הסריג לייצר פליטת קרינה כחולה הבאות עירור. Assay טרנסלוקציה זה הוכח גם כגישה לזהות חלבונים מפעיל מתוך מגוון רחב של חיידקים תאיים תאיים שונים, כולל ג burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, trachomatis כלמידיה, וחיידק E. coli, סלמונלה Brucella 17,30-35.
כדי לקבוע את התפקיד של גורמי מארח ספציפיים על טרנסלוקציה מפעיל Coxiella אנו מנצלים שיטה מבוססת היטב עבור להשתקת גנים המכונית התערבות RNA, ב RNA התערבות הקטן במיוחד (siRNA). במקור מזוהה elegans Caenorhabditis, התערבות RNA היא תהליך הסלולר אנדוגני משומר המשמש defe המולדNSE מפני וירוסים כמו גם ויסות הגנים 36,37. לאחר עקדת siRNA רצף ספציפי, השפלה של mRNA מתרחשת דרך RISC (מורכב השתקה המושרה RNA) וכתוצאה מכך להשתקת גנים ספציפיים או 38 מציאה. במחקר זה, siRNA שמש למקד שני חלבונים מארחים, Rab5A ו Rab7A, אשר הם רגולטורים חשובים של מסלול endocytic. ההשפעה של השתקת Rab5A ו Rab7A על טרנסלוקציה מפעיל הוברר באמצעות ג burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 נבחרה כפי שהוא הוצג בעבר להיות translocated ידי מערכת הפרשת Dot / ICM Coxiella של 17.
ניצול הוא להשתקת גני siRNA ואת assay טרנסלוקציה fluorescencebased המתואר כאן, אנחנו מתחילים להקים לחיקוי עבור גורמי המארח טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים ידי Coxiella. גישה זו ניתן ליישם במגוון רחב של שניהם חיידקים תאיים תאיים שיש להם secretio דומהמערכות n אחראיות טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכות הפרשה, ואת החלבונים מפעילים חיידק תחבורת מערכות אלה לתוך הציטופלסמה של תאי מארחים, הם מרכיב חשוב ארסיות שרב חיידקים פתוגניים לנצל להקים זיהום בתוך נישות בשכפול הדנ"א ייחודיות. ההתמקדות של קבוצות מחקר רבות כבר לחקור את יחסי הגומלין בין effectors חיידקי חלבונים מ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.
Materials
| Reagents | |||
| Citric acid | Sigma | C0759 | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218 | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Calbiochem | 442611 | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Fisher | S93248 | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852 | ACCM-2 medium component |
| Bacto-neopeptone | BD | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | Fisher | BP1424 | ACCM-2 medium component |
| Methyl beta cyclodextrin | Sigma | C4555 | ACCM-2 medium component |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 medium component |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | For bacterial culture |
| ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | Non-targeting control |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | Causes cell death; measure of transfection efficiency |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5X siRNA buffer | Dharmacon | B-002000-UB-100 | Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer |
| DharmaFECT-1 Transfection Reagent | Dharmacon | T-2001-01 | For transfection |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | Reduced-serum medium used for transfection |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | For cell culture and infection |
| Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Can use alternate equivalent product |
| DMSO | Sigma | D8418 | For storage of Coxiella strain |
| PBS | For cell culture | ||
| 0.05% Trypsin + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | For cell culture |
| dH2O | For dilution of samples and standards for qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | Can use alternate equivalent product to extract gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO) |
| Sodium hydroxide | Merck | 106469 | Probenicid solution component |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | 71505 | Probenicid solution component |
| di-Sodium hydrogen orthophosphate | Merck | 106586 | Probenicid solution component |
| Probenicid | Sigma | P8761 | Probenicid solution component |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. |
| 4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS | Sigma | P6148 | Fixing solution for HeLa 229 cells |
| 25cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430639 | For growth of bacterial strain |
| 96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 3603 | |
| 75cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430641 | For growth of HeLa 229 cells |
| 175cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 431080 | For growth of HeLa 229 cells |
| Haemocytometer | For quantification of HeLa 229 cells | ||
| Tear-A-Way 96 Well PCR plates | 4titude | 4ti-0750/TA | For qPCR reaction |
| 8-Lid chain, flat | Sarstedt | 65.989.002 | For qPCR reaction |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bench top microfuge | |||
| Bench top vortex | |||
| Orbital mixer | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | For pelleting bacterial culture |
| Nanodrop | For gDNA quantification | ||
| Mx3005P QPCR machine | Aligent Technologies | 401456 | For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture |
| ClarioSTAR microplate reader | BMG LabTech | For measurement of fluorescence |
Riferimenti
- Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
- Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
- van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
- Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
- Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
- Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
- Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
- Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
- Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
- Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
- Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
- Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
- Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
- Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
- Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella’burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
- Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
- Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
- Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
- Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
- Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
- Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
- Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
- de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
- Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
- Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
- Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
- Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
- Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
- McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
- Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
- Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
- Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
- Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).
