Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Hedef RNA ve Cas9 Yapıları ve Onarım Donör Vektör 1. Hazırlık gRNAs klonlanması Daha önce 25 belirtilen prensip aşağıdaki aşı virüsünün N1L genini hedef alan bir kılavuz-RNA hedef dizisi tasarlayın. ineklerdeki çiçek hastalığı virüs genomu karşı kılavuz-RNA hedef sekans hizalama (bu durumda, aşı virüsü Lister suşu) bir hedef dışı gRNA hedef sekanslarını ekarte etmek için. Sentezlemek ve daha önce 25 açıklandığı gibi bir gRNA klonlama vektörüne gRNA oligos klonlamak. Sanger dizileme 33 ile sonuçlanan vektör içinde her gRNA sırasını onaylayın. Ortaya çıkan gRNA gRNA N2 33 olarak inşa adlandırın. NOT: gRNA hedef site N1L geni içinde ve sol kol ve sağ kol arasındaki bölgede olduğu onarım verici vektör kapakları (Şekil 1). nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) yoksun Cas9 genini klonlamakpST1374 vektör ve PST-Cas9 33 olarak yapı belirleyin. NOT: herhangi bir memeli sentezleme klonlama vektörü Cas9 sentezleme vektörünün kurulması için kullanılabilir. HR onarım donör vektörü İnşaatı Modifikasyon 33 için hedef bölge olarak VV N1L genini kullanın. sol ve sağ kol uzunlukları yaklaşık 500-600 bp her ve hedef bölgeyi komşu olduğundan emin olun. NOT: Sol kol / sağ kol hedef bölge ile 50 bp üst üste kadar olabilir (Bakınız Şekil 1). Daha önce 33, 34 anlatıldığı gibi N1L bölge onarım donör vektör Clone ve pT-N1L olarak onarım donör vektör belirler. NOT: onarım donör vektörü ve hedef bölge için Şekil 1'e bakınız. VV Diğer bölgeler bölgesi (gen) -özel gRNA (ler) ve bölgeye özgü onarım verici vektörü kullanılarak hedef alınabilir. Herhangi bir klonlama vektörü onarım verici vektör yapımı için kullanılır. </Ol> plasmid genişletilmesi Kimyasal olarak, yeterli E. plazmidi Dönüşümü E. coli, üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir. İmalatçı tarafından sağlanan protokole ilişkin bir plazmid ekstraksiyon takımı kullanılarak plazmit saflaştırılır. 2. Tohum Hücreler (Gün 1) Bakım CV-1 37 ° C de% 5 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 'de hücreleri (Maymun böbrek fibroblastları),% 5 CO 2. % 80-90 konfluent Trypsinize CV-1 hücreleri, CV-1 hücreleri ihtiva eden T-175 şişesi hücre kültür ortamı çıkarın. PBS kalan serumu çıkarmak ve aspire steril PBS 5 ml tek tabaka durulayın. hücreleri kapsar ve hücre ayrışması yardımcı olmak için yaklaşık 5 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir 2.5 ml 1 x tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. EklemekHücre kültür ortamı 10 ml yumuşak bir pipet hareketi ile hücrelerin süspansiyonu (adım 2.1). Bir hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak. 6-yuvalı plakalar içinde Hücrelerin Serpilmesi 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, hücre kültür ortamı 2 mL tohum 2 x 10 5 CV-1 hücreleri, transfeksiyondan bir gün önce. Not: tripsin çıkarmak için ek bir santrifüjleme aşaması gerekli değildir. Cas9 Plazmid ve gRNA 3. Plasmid transfeksiyonu (Gün 2) 0.5 ug PST-Cas9 plasmidi ile ve imalatçının talimatlarına göre bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak 0.5 ug gRNA N2 plazmid (adım 2.2.3.1 hazırlandı) Transfect CV-1 hücreleri. Bir kuluçka makinesi içinde 24 saat süreyle inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 CO2), ve daha sonra (adım 2.1 tarif edilmiştir), taze hücre kültür ortamında 2 mL orta yerine. CV-1 hücreleri, ve Servis Verici V 4. Enfeksiyonector Transfeksiyon HR (Gün 3) 2 x 10 5 pfu / ml'lik bir konsantrasyona kadar DMEM hücre kültür ortamı ile omurgası VVL15 virüsü seyreltilir. Cas9 ve gRNA plasmidlerin 24 saat post-transfeksiyon, transfekte edilmiş CV-1 hücrelerinde, her kuyuya seyreltilmiş virüs, 100 uL ilave edin. 2 saat sonra, virüs enfeksiyonu, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak HR VVL15 enfekte hücrelere 1.0 ug Servisi verici vektör transfekte. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör transfekte edilmiş hücrelerin yerleştirin. 5. Hasat Rekombinant virüs (Gün 4) Adım 4.2 HR mekik donör vektörü ile transfeksiyondan 24 saat sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak nakledilen CV-1 hücreleri ayırmak. kriyotüpe içine hücre süspansiyonu toplayın ve gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de saklayın. NOT: derhal dezenfektan ile herhangi bir hücre kültür ortamı Dökülen siliniz ve daha sonra% 70 Ethan ile tekrar silinol. Modifiye VV 6. saflaştırılması (Birinci Tur) 1. günde, her yuva içinde 3 x 10 5 CV-1 hücreleri ile 15 6 oyuklu plakalar tohum. 2. günde, 3 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosu içinde aşama 5.1 dondurulmuş hücre süspansiyonu çözülme ve hücre artıkları çıkarmadan hücre lizatının elde edilmesi için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde cryovials girdap. CV-1 hücreleri, bir 6-yuvalı plaka Enfeksiyon için, DMEM 3 mL hücre lizatının 1 uL seyreltilmiş ve daha önce ortam üzerine, 6 oyuklu plakanın her bir seyreltilmiş hücre lizatı 0.5 mL eklemek mevcut. Adım 6.1 hazırlanan 6-kuyucuğu bulaştırmak. Not: Hücre kalıntılarının çıkarılması gerekli değildir. Enfeksiyon iki gün sonra (yani, günde 4), plak konumunu çizerek bir işaretleyici kalem kullanarak plaka altında plaklar 10X objektif lens kullanarak bir floresan mikroskop altında RFP-pozitif plaklar tanımlamak ve etiket. NOT: Daha <strong> temsilci RFP-pozitif plak Şekil 3. altı farklı RFP pozitif plaklar almak için 200 uL serumsuz DMEM hücre kültür ortamı içeren altı etiketli cryovials hazırlayın. etiketli plaka (lar) (adım 6.3) ile iyice hücre kültür ortamı aspire. Bir P200 pipet 200 uL ucu takın 30 uL seviyesini ayarlamak ve bir cryovial gelen ~ 10 mcL hücre kültür ortamı alır. orta bırakmadan pipet itme düğmesini basılı tutun ve bir etiketli plak alan kazımak için ucu kullanın. müstakil hücreleri yukarı kaldırın ve serum serbest DMEM 190 uL içeren cryovial içine aktarmak için pipet itme düğmesini bırakın. (Son adımından) çizik hücreleri ile şişeden başka bir 10 uL orta alın ve mümkün olduğunca çok sayıda çizik hücreleri toplamak için aynı RFP-pozitif plak üç kez toplayıp işlemi tekrarlayın. Aynı şişenin içine tüm hücreleri aktarın ve -80 ° C'de şişe saklayın. <br /> NOT: arınma ikinci tur derhal yapılır Alternatif olarak, 10 dakika süreyle kuru buz cryovials dondurmak. Modifiye VV 7. saflaştırılması (İkinci Tur) Her birine Tohum 3 x 10 5 CV-1 hücreler, altı 6 oyuklu plakalar ve Kültür 24 saat boyunca hücre. 3 dakika için 37 ° C su banyosunda (aşama 6.3.3 arasında) dondurulmuş cryovials çözülme daha sonra hücre lizatı elde etmek için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde cryovials girdap. 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna karma hücre lizatının 0.5 uL ekleyin. Her bir plak, bir 6-yuvalı plaka Infect. 2 gün boyunca% 5 CO2 (ikinci devre plak saflaştırma) ile 37 ° C'de VV enfekte 6 oyuklu inkübe edin. Sonra bölüm 6.3 tekrarlayın. NOT: Daha fazla altı RFP-pozitif plaklar alınabilir; İki ya da daha fazla 6-oyuklu plakalar, her plak saflaştırılması için de kullanılabilir. Plak Puri 8. Ek turlarSınıflamasına bir pozitif plak oluşan tüm plaklar mikroskop altında RFP-pozitif gibi görünen kadar 7. adımda açıklanan aynı protokolü takip arınma daha üç beş tur sürdürmektedir. Not: Daha sonra bu plak saf olarak kabul edilir. Plak saf kez bölümde 6.3 anlatıldığı gibi (Şekil 4, RFP ifade tüm enfekte hücreler), -80 ° C'de cryovial ve mağaza içine pozitif plak hasat. Aşama 9 ve 10'da tarif edilen protokol izlenerek plak edin. 9. genişletin Saf Plak (ler) Virüs enfeksiyonu önce 6 plaka bir gün her oyuğuna Tohum 3 x 10 5 CV-1 hücreleri. Hücre lizatı elde etmek için 3 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde 8.2 dondurulmuş cryovial çözülme. CV-1 hücreleri, 6 gözlü bir plakanın bir kuyuya (hücre kalıntıları çıkarmadan) Tüm lisatı, ekleme (adım 9.1 tohumlanmış). 5 ile 37 ° C 'de enfekte edilmiş CV-1 hücreleri, inkübeEn fazla 3 gün süreyle% CO 2. Tüm saflaştırılmış plaklar (en az üç plaklar) genişletin. NOT: Bu enfeksiyon uzun lizat virüsün miktarına bağlı olarak 1-3 gün arasında değişir. % 50'den fazla hücreler mikroskop altında incelendi sitopatik etki gösterirken bir hücre kazıyıcı kullanarak VV-enfekte hücreleri hasat (hücreler kolayca sökülüp ve RFP pozitif yuvarlanır). 15 ml tüp içine hücre kültürü ortamı ile ayrılan hücreler toplanır. 3 dakika boyunca 300 g'de santrifüj hücreleri Pelet. Süpernatantı ve daha sonra kullanmak kadar -80 ° C hücre pelletini tutmak veya adım 10 hemen hücre pelet kullanın. PCR kullanarak Mutant VV Modifikasyonu 10. Doğrulama Üreticinin protokolü takip edilerek, bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak aşama 9.3.1'de hazırlanan hücre topağından VV DNA ekstrakte edin. iki kez damıtılmış su, 200 uL DNA yıkayın. NOT: DNA ayıklamak ve klon doğru modifikasyon / ilavesini içeren olarak doğrulandı ise viral üretim için geri kalanı tutmak için pelet hacminin yarısını kullanın. N1L geninin silme ve N1L bölgeye RFP geninin sokulması doğrulanması. N1L gen (L025) ile N1L gen karşı tasarlanan primerler kullanılarak L026 geni kapsayan, bir DNA fragmanını çoğaltmak. RFP-spesifik primerler kullanılarak RFP genini çoğaltmak. A52R-spesifik primerler kullanılarak PCR ile A52R kapsayan bir kontrol DNA fragmanını çoğaltmak. NOT: spesifik primerler için Malzeme Listesine bakınız. PCR master miks kiti kullanılarak PCR gerçekleştirin. en fazla 25 uL DNA şablonu 2 uL kullanılarak PCR reaksiyonunun yer alan 2 dakika süre ile 94 ° C 'de, PCR reaksiyonu denatüre ve aşağıdaki adımları PCR 30 döngü çalıştırmak: 15 saniye süreyle 94 ° C' de DNA'yı denatüre ardından tav 15 saniye için 52 ° C 'de, DNA şablonları primerler 30 s için 72 ° C'de PCR reaksiyonunu uzanır. Bir% 1 agaroz jeli 33 kullanarak PCR ürünleri giderin. UV jel doc kullanılarak jel görüntü yakalamak. N1L PCR negatif ve A52R ve RFP PCR pozitif iseniz, o plak doğru N1L bölgesinde değiştirilir.