一种简单有效的方法构建突变牛痘病毒载体

1.目标RNA和Cas9构造和维修供体载体的制备 gRNAs的克隆针对设计痘苗病毒按照先前25所列的原则N1L基因的引导-RNA靶序列。对准对牛痘病毒基因组中的导向RNA靶序列（在此情况下，痘苗病毒的利斯特株），以排除任何脱靶gRNA靶序列。 合成和克隆gRNA寡成gRNA克隆载体如前面所述25。确认每个单独gRNA在所得载体用Sanger测序33的序列。命名产生gRNA建设作为gRNA N2 33。 注：gRNA目标站点是N1L基因内，并且是在左臂和右臂之间的区域中，该修供体载体盖（ 见图1）。 克隆Cas9基因的核定位信号（NLS）缺少进pST1374矢量并指定构建物PST-Cas9 33。 注意：任何哺乳动物表达克隆载体可用于Cas9表达载体的构建。 人力资源修复捐助载体的构建使用VV的N1L基因作为目标区域进行修改33。确保左右臂的长度各自是约500-600碱基对，和侧翼目标区域。 注：左手臂/右手臂最多可以有与目标区域50个基点重叠（ 见图1）。 克隆N1L区域修复供体载体如先前33,34描述和指定维修供体载体为PT-N1L。 注：请参阅图1的修为供体载体和它的目标区域。维维的其它区域可使用区域（基因）特异性gRNA（S）和特定区域的修复供体载体进行定位。任何克隆载体可用于修复供体载体的构建。 </OL> 质粒的拓展变换质粒入化学感受态根据制造商的说明大肠杆菌 。纯化使用质粒提取试剂盒指的是由制造商提供的协议的质粒。 2.种子细胞（1天） 保持CV-1细胞（猴肾成纤维细胞）在Dulbecco氏改良Eagle氏培养基（DMEM），补充有5％胎牛血清（FBS），100U / mL青霉素和100微克/毫升链霉素，在37℃用5％的CO 2。 Trypsinize CV-1细胞是80-90％汇合除去从含有CV-1细胞在T-175烧瓶中的细胞培养基。冲洗用5mL无菌PBS的单层，以除去残留的血清和吸出PBS中。加2.5毫升1×胰蛋白酶-EDTA溶液，以覆盖细胞，并放置在烧瓶中37℃培养箱中约23分钟，以帮助细胞剥离。 加10毫升细胞培养基（参见步骤2.1），以暂停通过温和移液动作的细胞。算使用血球细胞数。 种子细胞在6孔板种子2×10 5个 CV-1细胞在2ml细胞培养基的成6孔板的每个孔中的转染的前一天。 注意：一个附加的离心步骤以除去胰蛋白酶是不需要的。 3. Cas9质粒和gRNA质粒转染（2日） 转染CV-1细胞用0.5微克PST-Cas9质粒和使用根据制造商的说明转染试剂0.5微克gRNA N 2质粒（在步骤2.2.3.1制备）。 孵育24小时的细胞在培养箱（37℃，5％的CO 2），然后替换用2毫升的新鲜细胞培养基（在步骤2.1中所述）的介质。 4.感染CV-1细胞及穿梭供体的V埃克特转染HR（3日） 稀骨干VVL15病毒用DMEM细胞培养基以2×10 5 PFU / mL的浓度。 Cas9和gRNA质粒的24小时后转染，添加100微升稀释的病毒进入转染CV-1细胞的每个孔中。 2小时后的病毒感染，转染1.0μg的穿梭供体载体成使用根据制造商的说明转染试剂VVL15感染细胞的人力资源。放置转染的细胞在37℃培养箱，5％CO 2下24小时。 5.收获重组病毒（4日） 在步骤4.2的HR穿梭供体载体转染的24小时后，分离使用细胞刮转染CV-1细胞。收集细胞悬液到一个离心管，并在-80℃以供将来使用存储。 注：立即擦去消毒剂任何细胞培养液溢出，然后用70％乙再次擦拭醇。 6.纯化改性VV（第一轮） 在第1天，接种15 6孔板用3×10 5个 CV-1细胞在每孔中。 第2天，解冻来自步骤5.1的水浴中的冷冻的细胞悬浮液，在37℃，3分钟，并大力旋涡振荡冷冻管30秒，以获得细胞裂解物不去除细胞碎片。 感染CV-1细胞中的一个6孔板的，稀释细胞裂解物的1微升用3mL的DMEM，并添加0.5毫升稀释的细胞裂解物进6孔板的每个孔中，对媒体顶部已经当下。感染所有在步骤6.1中制备的6孔板中。 注：不需要的细胞碎片的去除。 感染后两天（ 即第4天），发现RFP阳性斑块使用10X物镜在荧光显微镜下，并贴上标签斑块用记号笔由盘旋斑块位置板下方。 注：请参阅<st荣>图3为代表的RFP阳性牌匾。 制备含有200微升无血清的DMEM细胞培养基中拾起六个不同的RFP阳性噬斑6标记的冷冻管。吸从井用标记斑块（S）（步骤6.3）的细胞培养基。附加200微升尖端P200的吸管，将音量设置为30μL，并采取〜从一个冷冻管10微升的细胞培养基。 握住吸管按钮而不释放介质，并使用前端划伤一种标记斑块的面积。松开吸管按钮抬起脱落的细胞，并将其转移到含有无血清DMEM 190微升冷冻管。 乘坐从与划伤细胞（从最后一步）小瓶另外10μL中，重复拿起相同的RFP阳性斑块三次，以收集尽可能多的划伤细胞尽可能的过程。传输所有细胞进入同一小瓶中，将小瓶储存于-80℃。 <br />注意：可替换地，如果立即执行第二轮纯化的冷冻在干冰上的冷冻管10分钟。 7.纯化改性VV（第二轮） 种子3×10 5个 CV-1细胞到每个孔六6孔板并培养所述细胞24小时。 解冻在37℃水浴冷冻冷冻管（从步骤6.3.3）3分钟，然后涡冷冻管剧烈30秒，以获得细胞裂解物。 添加混合细胞裂解物的0.5微升至6孔板的一个孔中。感染每个斑块一个6孔板中。用5％的CO 2 2天（第二轮噬斑纯化）孵育VV感染6孔板在37℃。然后重复第6.3节。 注：六点多RFP阳性斑块可以捡到;两个或更多个6孔板可用于各斑块纯化。 8.斑块普瑞更多轮fication 进行进一步的三到五轮纯化的以下步骤7中所述，直到从一个阳性噬菌斑形成的所有的噬菌斑表现为RFP阳性显微镜下相同的协议。 注意：然后，这个斑块被认为是纯粹的。 一旦斑块是纯粹的（ 图4，表达RFP所有被感染的细胞），如6.3节所述收获了积极的牌匾进入混和，存于-80℃。验证以下步骤9和10中描述的协议的斑块。 9.展开纯化的斑块（S） 种子3×10 5个 CV-1细胞到病毒感染前的6孔板一天每孔中。 解冻从8.2冷冻冷冻管在37℃水浴中3分钟以获得细胞裂解物。添加所有溶胞产物（不除去细胞碎片）到CV-1细胞的6孔平板的一个孔中（在步骤9.1接种）。孵育感染CV-1细胞在37℃，5％CO 2的最多3天。 展开所有纯化的斑（至少三个噬斑）。 注：感染时间从1-3天，取决于病毒的裂解物的量而变化。 收获使用细胞刮刀VV感染的细胞时，50％以上的细胞显示在显微镜下观察细胞病变效应（细胞被四舍五入，容易脱落和RFP阳性）。用细胞培养基到15毫升管收集脱离的细胞一起。 离心以300g沉淀细胞3分钟。去除上清，并保持细胞沉淀在-80℃直至进一步使用或立即使用细胞沉淀为步骤10。 10.突变VV的利用PCR改性的验证提取用DNA提取试剂盒根据制造商的协议，在步骤9.3.1制备的细胞沉淀VV的DNA。洗脱用的双蒸水200微升的DNA。 注意：使用粒料的体积的一半以提取的DNA，并保持其余为病毒产生，如果克隆被验证为含有正确修饰/插入。 所述N1L基因的缺失和RFP基因的插入N1L区域的验证。 扩增跨越N1L基因（L025），并使用设计针对N1L基因的引物的L026基因的DNA片段。使用放大RFP特异性引物RFP基因。扩增使用特定A52R-引物通过PCR跨越A52R一个对照DNA片段。 注：请参阅材料清单对特异性引物。 使用PCR主混合试剂盒进行PCR。设置25使用DNA模板的2微升PCR反应100μL，变性在94℃，PCR反应进行2分钟，然后运行下列步骤的PCR 30个循环：在94℃使DNA变性15秒，然后退火引物的DNA模板在52℃15秒延伸72℃30秒的PCR反应。 解决使用1％琼脂糖凝胶33的PCR产物。捕获使用UV胶文档的凝胶图像。如果N1L PCR是阴性和A52R和RFP的PCR是阳性，那么斑块中正确的N1L区域进行修改。