Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
viral ensefalit patogenezinde çalışmada, enfeksiyon yöntemi önemlidir. beyne iki enfeksiyon güzergah birinci endotel hücreleri ve beynin perisitlerin tarafından enfekte kan yoluyla yoldur. İkinci intraserebroventriküler (ICV) yoldur. Bir kez merkezi sinir sistemi (MSS) dahilinde, virüsler beyin omurilik sıvısı yoluyla subaraknoid, meninkslerin ve koroid pleksus yayılabilir. deneysel modellerde, MSS viral dağıtım erken aşamaları iyi karakterize değildir ve sadece belirli hücreler başlangıçta enfekte olup olmadığı bilinmemektedir. Burada, enfeksiyonun akut fazında sitomegalovirüs (CMV) parçacıkların dağılımını analiz ettik, yenidoğan fare beyninin içine ICV veya damar içi (IV) enjeksiyonu takiben, birincil viremi olarak adlandırılan. ICV püskürtme modelinde, fare CMV (MCMV) ya da flüoresan mikro-5 ul midpoi yanal ventrikül içine enjekte edilmiştirnt 27 G iğne ile 10 ul şırınga kullanarak kulak ve göz arasındaki. IV enjeksiyonu modelinde, 35 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanıldı. Bir transillüminator yenidoğan fare yüzeysel zamansal (yüz) damar görselleştirmek için kullanıldı. Biz yüzeysel temporal ven içine MCMV veya floresan mikro-50 ul aşılamıştır. Brain farklı zaman noktalarında Enjeksiyondan sonra toplandı. MCMV genomları in situ hibridizasyon yönteminde kullanılarak tespit edildi. Rekombinant MCMV parçacıkları ifade Floresan mikro-veya yeşil floresan proteini flüoresans mikroskopisi ile tespit edilmiştir. Bu teknikler, ensefalit patogenezini araştırmak için diğer patojenlere uygulanabilir.
Introduction
Viral ensefalit okuyan zaman viral parçacıkların ilk dağıtım hastalık patogenezi anlamak ve beyinde viral hedefleri tespit etmek çok önemlidir. Pandoravirus büyüklüğü 1 fazla 700 nm, ancak çok virüs, 20 ila 300 nm arasında boyutu değişir. akut dönemdeki viral partiküllerin dağılım parçacıklarının büyüklüğü, hücresel reseptörlere dağılımı ya da virüs hücresel reseptörlerin afinite ile bağlı olabilir. Hayvan modellerinde, intraserebroventriküler (ICV), intraperitonal, doğrudan plasental ve damar içi (IV) enfeksiyonları, viral ensefalit hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılmıştır olarak. virüs ICV aşılama genellikle farelerde, merkezi sinir sistemi (CNS) enfeksiyonları kurmak için kullanılır. Bu teknik kullanılarak yapılan çalışmalar, özellikle periventriküler bölgelerinde hücre ve beyin omurilik sıvısı (CSF), Simila ile doğrudan temas halinde beyin bölgelerinde yaygın bir enfeksiyon raporViral ventriculoencephalitis etkilerine R. Adeno-ilişkili virüs (AAV) parçacıklar, küçük boyutlu (20 – çapı 25 nm) ICV enfeksiyonlar 2-4 beyin boyunca yayılmasını kolaylaştırır. İntraperitoneal 5, direkt plasental 6, ve IV enjeksiyonlar 7 hematojenik sistemik yönetimini temsil etmektedir. Kan-beyin bariyerinin (KBB) viral parçacıkların penetrasyon onları yaygın mikroglial nodüller 8,9 temsil yenidoğan beyin parankimi ulaşmasını sağlar.
Sitomegalovirüs (CMV), herpes virüsü ailesine ait ortak bir virüstür. Amerika Birleşik Devletleri'nde,% 50 – insanların% 80 40. CMV enfeksiyonları nadiren zararlı ama immün sistemi baskılanmış hastalarda ve fetuslarda hastalıklara neden olabilir yaş CMV enfeksiyonu vardı. Tüm doğumların% 0.2 -% 2 gibi mikrosefali, periventriküler kalsifikasyon, serebellar hipoplazi, MICR gibi şiddetli semptomlar sonuçlanan CMV 10 ile doğarlaroftalmi ve optik sinir atrofisi 11,12. Ayrıca, mental retardasyon, işitme kaybı, görme kusurları, nöbet ve epilepsi olmayan ölümcül CMV ile enfekte bebeklerin 13,14 yaklaşık% 10'unda görülür. MSS disfonksiyonu CMV konjenital anomali en sık görülen karakteristik belirtidir. Daha çocuk kalıcı olarak Down sendromu, fetal alkol sendromu veya spina bifida 15 tarafından daha doğuştan CMV tarafından her yıl devre dışıdır. güvenli ve etkili bir aşı ihtiyacı için çağrıda, şu anda CMV ye karşı hiçbir aşı mevcut. enfeksiyonun erken fazında reseptörleriyle CMV parçacıkların etkileşimi incelemek aşılamanın etkisini anlamak önemlidir.
Ventriculoencephalitis ve yaygın mikroglial nodüller CMV iki ana patolojik özellikleri 16 ensefalit vardır. (- 300 nm 150) enfeksiyonu a akut fazında beynin yoluyla yayılan CMV parçacıkları nasıl belirsiz olmuşturnd nasıl hücresel reseptörlerin dağılımı ve virüsler için kendi afinite viral yayılmasına katkıda bulunur. Kawasaki vd. ICV ve parçacıklar ve enfeksiyon en erken aşamasında reseptörleri (β1 integrin) dağılımı açısından IV enfeksiyonları değerlendirilmiştir. CMV parçacıkları ve β1 integrin ekspresyonu yayılması de ICV, IV enfeksiyonlar 8 hem de enfeksiyon en erken aşamasında ilişkili olduğunu bulmuşlardır. ICV enfeksiyonu ventriculoencephalitis bir modeldir ve IV enfeksiyonu yaygın mikroglial nodüllerin bir modeldir. Viral veya floresan parçacıkların dinamiği incelenmesi parçacık boyutu, hücresel reseptörlere viral etkileşimleri ve beyinde BBB penetrasyon mekanizması etkisi hakkında yararlı bilgi verir. Aşağıdaki protokol CNS'de bir viral enfeksiyon ve viral vektör araştırmak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hayvan modellerinde, ICV, intraperitoneal, doğrudan plasental ve IV enfeksiyonları, viral ensefalit hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılmıştır. Biz prosedürlerin basitlik ve hedef bölgeye partiküllerin direkt enjeksiyon yararına yenidoğan farelerin ICV ve IV enjeksiyon modelleri üzerinde duruldu. Karın içi enfeksiyon kolay bir yöntem olmasına rağmen, viral partiküller dolaylı süreç 5,24 üzerinden sistematik yayıldı. Doğrudan plasental enfeksiyon embriyonik sistemik enfeksiyon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
Riferimenti
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
