Интрацеребровентрикулярное и внутрисосудистой инъекции вирусных частиц и флуоресцентных микрогранул в неонатальном мозга
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
В исследовании на патогенезе вирусного энцефалита, метод инфекции имеет решающее значение. Первый из двух основных инфекционных путей в мозге является гематогенный путь, который включает в себя заражение эндотелиальных клеток и перицитов головного мозга. Во-вторых, интрацеребровентрикулярное (ICV) маршрут. После того, как в центральной нервной системе (ЦНС), вирусы могут распространяться на субарахноидальное пространство, мозговые оболочки и сосудистом сплетении через спинномозговую жидкость. В экспериментальных моделях, самые ранние этапы ЦНС вирусного распространения не хорошо охарактеризованы, и остается неясным, являются ли изначально заражены только определенные клетки. Здесь мы проанализировали распределение цитомегаловирус (ЦМВ) частиц во время острой фазы инфекции, называется первичной виремии после ICV или внутрисосудистого (IV) инъекции в неонатальном мозге мыши. В модели инъекции ICV, 5 мкл мышиного цитомегаловируса (MCMV) или флуоресцентные микросферы вводили в боковой желудочек в midpoiнт между ухом и глазом с помощью 10-мкл шприца с иглой 27 G. В модели инъекции IV, использовали 1 мл шприц с иглой 35 G. Трансиллюминаторе был использован для визуализации поверхностной височной (лица) вены у новорожденных мышей. Мы проникнуты 50 мкл MCMV или флуоресцентных микрогранул в поверхностной височной вены. Мозги были собраны в различные моменты времени после инъекции. MCMV геномы были обнаружены на месте с использованием метода гибридизации в. Флуоресцентные микросферы или зеленый флуоресцентный белок, экспрессирующие рекомбинантные частицы MCMV наблюдались методом флуоресцентной микроскопии. Эти методы могут быть применены ко многим другим патогенам для исследования патогенеза энцефалита.
Introduction
При изучении вирусный энцефалит, начальное распределение вирусных частиц очень важно понять патогенез заболевания и выявить вирусные мишени в головном мозге. Большинство вирусов в размере от 20 до 300 нм, хотя Pandoravirus более чем 700 нм в размере 1. Распределение вирусных частиц в острой фазе инфекции может зависеть от размера частиц, распределение клеточных рецепторов или аффинности клеточных рецепторов на наличие вирусов. В моделях на животных, интрацеребровентрикулярное (ICV), внутрибрюшинного, прямой плацентарных, и внутривенно (IV), инфекций, были использованы для изучения патогенеза вирусного энцефалита. ICV-инокуляции вируса часто используется для установления центральной нервной системы (ЦНС), инфекции у мышей. Исследования с использованием этой методики сообщают широко распространенную инфекцию, в частности клеток в перивентрикулярных зонах и в областях мозга, в непосредственном контакте с цереброспинальной жидкости (CSF), similaг к воздействию вирусных ventriculoencephalitis. Небольшой размер аденоассоциированного вируса (AAV) частиц (20 – 25 нм в диаметре) , облегчает их распространение по всему мозгу в ICV инфекций 2-4. Внутрибрюшинные 5, прямой плацентарные 6, и IV инъекции 7 представляют собой кроветворения системное введение. Проникновение вирусных частиц через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) позволяет им достичь паренхимы головного мозга новорожденных, представляющий диффузные микроглии узелки 8,9.
Цитомегаловирус (ЦМВ) является распространенным вирусом, который принадлежит к семейства вирусов герпеса. В Соединенных Штатах, 50% – 80% людей имели ЦМВ-инфекции по возрасту 40. ЦМВ инфекции редко бывают вредны, но могут вызывать заболевания у пациентов с ослабленным иммунитетом и плода. Из всех поставок, 0,2% – 2% родились с ЦМВ 10, в результате чего тяжелые симптомы , такие как микроцефалия, перивентрикулярном кальцификации, гипоплазии мозжечка, MICRофтальмия и атрофия зрительного нерва 11,12. Кроме того, умственная отсталость, нейросенсорная потеря слуха, дефекты зрения, захват и эпилепсия встречаются примерно у 10% не фатально ЦМВ-инфицированных младенцев 13,14. дисфункция ЦНС является наиболее распространенным характерным симптомом ЦМВ врожденных аномалий. Больше детей навсегда остаются инвалидами каждый год врожденной ЦМВ , чем синдром Дауна, фетальный алкогольный синдром, или расщелины позвоночника 15. Есть нет прививки против ЦМВ доступны в настоящее время, призывая к необходимости безопасной и эффективной вакцины. Изучение взаимодействия частиц CMV с их рецепторами в ранней фазе инфекции важно понять эффект вакцинации.
Ventriculoencephalitis и диффузные микроглии узелки являются двумя основными патологическими характеристиками ЦМВ энцефалит 16. Это было неясно, каким образом частицы CMV (150 – 300 нм) распространяется через мозг в острой фазе инфекции Aе, как распределение клеточных рецепторов и их сродства к вирусам способствуют вирусного распространения. Kawasaki и др. Оценивали ICV и IV инфекции с точки зрения распределения частиц и их рецепторов (β1 интегрина) в самой ранней стадии инфекции. Мы обнаружили , что распространение частиц CMV и экспрессию & beta ; 1 – интегрином хорошо коррелируют в ранней фазе инфекции в обоих ICV и IV инфекции 8. ICV инфекция является моделью ventriculoencephalitis и IV инфекция представляет собой модель диффузного микроглии узелков. Изучение динамики вирусных или флуоресцентных частиц бы дать полезную информацию о влиянии размера частиц, вирусных взаимодействий с клеточными рецепторами, и механизм проникновения ГЭБ в головном мозге. Следующий протокол может быть использован для исследования любой вирусной инфекции и вирусного вектора в ЦНС.
Protocol
Representative Results
Discussion
В моделях животных, ICV, внутрибрюшинного, прямой плацентарного и IV инфекций были использованы для изучения патогенеза вирусного энцефалита. Мы сосредоточили свое внимание на модели ICV и IV инъекций у новорожденных мышей для простоты процедур и в пользу непосредственного впрыска частиц …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
Riferimenti
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
