קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות
Summary
A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.
Abstract
המחקר של אינטראקציות polymicrobial ברחבי הממלכות טקסונומיות הכוללים פטריות, חיידקים ווירוסים לא נבדקו בעבר ביחס כיצד חברי ויראלי של Microbiome להשפיע אינטראקציות חיידק לאחר מכן עם תאים המארח הנגועים בנגיף אלה. השיתוף למגורים של וירוס עם חיידקים ופטריות קיימים בעיקר על המשטחים הריריים של חלל הפה בדרכי מין. תאים ריריים, במיוחד אלה עם זיהומים נגיפיים סמויים כרוניים או מתמשכים מתמשכים, עשויים להיות השפעה משמעותית על חברי Microbiome בעקבות שינויים במבנה נגיף מספר וסוג קולטנים לידי ביטוי. שינוי בארכיטקטורת קרום תא מארח יביא יכולת שינתה החברים הבאים של הפלורה הנורמלי פתוגנים אופורטוניסטים ליזום את הצעד הראשון ההיווצרות ביופילם, כלומר, הדבקות. מחקר זה מתאר שיטה כדי לכמת ובדיקה ויזואלית של האפקט של HSV על הייזום של biofilהיווצרות מ (דבק) של ס aureus ו- C. אלביקנס.
Introduction
Microbiome האדם כולל אורגניזמים מגוונים מממלכות טקסונומיות מרובות החולקות אזורים גיאוגרפיים בגוף. דבקות משטחי תא היא צעד חיוני ראשון היווצרות ביופילם, המהווה חלק של תהליך הקולוניזציה Microbiome. כלול Microbiome יכול להיות וירוסים שגורמים זיהומים כרוניים ומתמשכים. זיהום התא הכרוני על ידי וירוסים אלה יכול לגרום שינוי זמין קולטן משוער. 1,2 בנוסף, ערך בתא ידי פתוגנים התאיים גם יכול להשפיע נזילות הממברנה מארחת / הידרופוביות אשר בתורו עשוי לשנות מצורפת של חברי Microbiome אחרים, כוללים חיידקים ופטריות . על מנת להבין את האינטראקציה שהוא יכול להתרחש בין פתוגנים רבים אלה ושהשיתוף למקם באותה האזורים הגיאוגרפיים של המארח האנושי, עלינו להיות מסוגל ללמוד את האינטראקציה של פתוגנים המייצגים את הספקטרום של ממלכות טקסונומיות נוכחות פני השטח הריריים.
t "> The Herpesviridae הם משפחה של חיידקים הנמצאים 100% של בני אדם כמו החברות הקבועות Microbiome 3,4. בנוסף הם יכולים גם להיות לשפוך הן בהתמדה בנוכחות והיעדר תסמינים. באופן ספציפי, הרפס סימפלקס וירוס-1 ו הרפס סימפלקס וירוס-2 (HSV-1 ו- HSV-2, בהתאמה) הן חברות קבועות Microbiome ב oronasopharynx ו בדרך המין. אצל אנשי חיסון מוסמך, הן HSV-1 ו- HSV-2 הגורם gingivostomatitis, כמו גם הרפס גניטלי 5-8. באתרים אלה, HSV גורמת זיהום לטנטי המאופיין 9 ויראלי אסימפטומטית מתמשך שפיכה. כניסה של HSV לתוצאות תאי שינויים בביטוי פני nectins, סולפט heparan, רפסודות שומנים ומגשר כניסה ההרפס / נימק גידול הקולטן לגורם (HVEM / TNFr) 10-25. אלה קולטנים מייצגים משותף פוטנציאלי עבור כמה חיידקים ופטריות, למשל S. aureus ו ג אלביקנס, אשר תוך פתוגנים אופורטוניסטיים,גם יכול להיות מאוחסן כחברי Microbiome הרירית של oronasopharynx 26,27. בתוך oronasopharynx ס aureus ו- C. אלביקנס לכבוש שני לאתרים ייחודיים של קולוניזציה. בשנת מארחים עם שיניים טבעיות, רירית הפה משותפת HSV-1 ו- C. אלביקנס, בעוד nares האף הקדמי תפוס על ידי S. aureus 28. עם זאת, למרות במבחנה הממצאים ס aureus דבקה תאי אפיתל פה, 29,30 ס aureus מבודד לעתים רחוקות מן הדגימות אוראליות כאשר רקמות בריאות קיימת 29,30. מעט מאוד ידוע לגבי נישות שיתוף-קולוניזציה בדרכי מין מעבר הממצאים הקליניים שס aureus קשורה דלקת נרתיק אירובי, מאופיין בדלקת איברי מין, פרשות ו dyspareunia, בעוד ג אלביקנס מייצרת רירית נגעים דומים לזה שנצפה בחלל פי 31-35. לכן, למרות אותם חברי microbi האוראלי באברי המיןשת ממלכות טקסונומיות צלבו מעט מאוד ידוע לגבי האינטראקציה שלהם כפי שהוא משפיע יכל ליזום היווצרות ביופילם דרך דבקות אל פני שטח התא המארח 5. פרוטוקול זה יושם באופן יעיל כדי לקבוע את ההשלכות התפקודיות של שיתוף-קולוניזציה / זיהום.Protocol
1. זני HSV וטיפול הערה: רקומביננטי הלא מתפשטת HSV-1 (קוס) gL86 ו HSV-2 (קוס) 333gJ – עם פעילות הכתב בטא galactosidase בשימוש נמסרו על ידי V. Twiari 36,37. השתמש וירוס מרב וחנות אחת ב -80 מעלות צלזיוס ב יחס של 1: 1 ?…
Representative Results
רמת החוסן של נתוני השגה מהמערכת המתוארות בדוח זה מוצגת af איור 2 38. באמצעות השימוש במערכת זו האפנון של אינטראקצית staphylococcal ופטריות עם תאים נגועים בנגיף והשפיע על כל הדבקות של אחרים יכול להיות תחום. סוגים של מחקרים אלה דורשים בדיקה מיקרו?…
Discussion
כרגע אין מידע נגיש יחסי הגומלין המורכבים שבין קבע לחברי חצי קבוע של Microbiome מארח החוצות תחומים טקסונומיות מרובות, כלומר, פרוקריוטים, האיקריוטים ויראלי. לכן פיתחנו רומן במערכת מודל במבחנה ללמוד ייזום ביופילם על ידי ש aureus ו- C. אלביקנס על HSV-1 א…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).
Materials
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50mg/ml | Sigma | 1397 | 50µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1XPBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100X15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150X15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100×13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
Riferimenti
- Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
- Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
- Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
- Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
- Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
- Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
- Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
- Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
- Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
- Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
- Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
- Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
- Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
- Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Hauck, C. R. Cell adhesion receptors – signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
- Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
- Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
- Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
- Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, 461-469 (2006).
- Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
- Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
- . National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
- Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
- Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
- Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
- Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
- Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
- Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
- Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
- Nenoff, P., et al. Mycology – an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
- Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
- Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
- Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, 400-403 (1987).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
- Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
- Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, 569-581 (1997).
- Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
- Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, 389-399 (2005).
- Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
- Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
- Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
- Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
- Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
- Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
- Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
Citazione di questo articolo
Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).