A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.
دراسة التفاعلات متعدد المكروبات في جميع أنحاء الممالك التصنيفية التي تشمل البكتيريا والفطريات والفيروسات لم تفحص سابقا في ما يتعلق بكيفية أعضاء الفيروسي من microbiome يؤثر على التفاعلات ميكروب لاحقة مع الخلايا المضيفة المصابة بالفيروسات هذه. والعيش المشترك بين الفيروس مع البكتيريا والفطريات موجودة أساسا على الأسطح المخاطية لتجويف الفم والجهاز التناسلي. خلايا الغشاء المخاطي، ولا سيما مع العدوى الفيروسية الكامنة المزمنة أو الدائمة المستمرة، يمكن أن يكون له تأثير كبير على أعضاء microbiome من خلال تغيير الفيروس في عدد ونوع من المستقبلات التي أعرب عنها. أن التعديل في العمارة غشاء الخلية المضيفة يؤدي إلى القدرة غيرت من أعضاء لاحق من النباتات الطبيعية ومسببات الأمراض الانتهازية لبدء الخطوة الأولى في تشكيل بيوفيلم، أي التزام. توضح هذه الدراسة وسيلة لتحديد الكميات والفحص البصري للتأثير HSV على بدء biofilتشكيل م (الالتزام) س الذهبية وجيم البيض.
يتضمن microbiome الإنسان الكائنات الحية المتنوعة من الممالك التصنيفية المتعددة التي تتقاسم مناطق جغرافية في الجسم. التمسك سطوح الخلايا هو خطوة أولى أساسية في تشكيل بيوفيلم، الذي هو جزء من عملية microbiome الاستعمار. وشملت في microbiome يمكن أن تكون الفيروسات التي تسبب الالتهابات المزمنة والمستمرة. عدوى الخلايا المزمن من قبل هذه الفيروسات يمكن أن تسبب تغيير في توفر مستقبلات المفترض 1،2 بالإضافة إلى ذلك، دخول الخلية عن طريق الجراثيم داخل الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على غشاء المضيف سيولة / للا مائية والتي بدورها قد يغير الحجز على أعضاء microbiome الآخرين، بما في ذلك البكتيريا والفطريات . من أجل فهم التفاعلات التي تحدث بين هذه الجراثيم المتعددة التي شاركت في توطين في مناطق جغرافية واحدة للمضيف البشري، يجب أن نكون قادرين على دراسة التفاعل من مسببات الأمراض التي تمثل طائفة من الممالك التصنيفية الحاضرة في سطح الغشاء المخاطي.
ر "> إن فيروسات هربسية هي عائلة من الميكروبات الموجودة في 100٪ من البشر كأعضاء دائمين في microbiome 3،4. وبالإضافة إلى ذلك يمكن أيضا أن تسلط باستمرار سواء في وجود وعدم وجود أعراض وعلى وجه التحديد، فيروس العقبول البسيط-1 وفيروس العقبول البسيط 2 (HSV-1 و HSV-2، على التوالي) أعضاء الدائمين في microbiome في oronasopharynx والجهاز التناسلي. في الأفراد المناعة المختصة، سواء HSV-1 و HSV-2 سبب التهاب اللثة، وكذلك الهربس التناسلي 5-8. في هذه المواقع، HSV يسبب العدوى الكامنة التي تتميز المزمن المستمر بدون أعراض الفيروسية تسليط 9. دخول HSV إلى نتائج الخلايا في إحداث تغييرات في التعبير سطح nectins، كبريتات heparan، الطوافات الدهنية وهربس دخول الوسيط نخر الورم / مستقبلات عامل (HVEM / TNFr) 10-25. هذه المستقبلات يحتمل أن تمثل المشتركة لبعض البكتيريا والفطريات، مثل بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية وجيم البيض، في حين أن الذي مسببات الأمراض الانتهازية،ويمكن أيضا أن يقيم كأعضاء في microbiome المخاطية للoronasopharynx 26،27. ضمن oronasopharynx س. الذهبية وجيم البيض تحتل موقعين متميزين من الاستعمار. في المضيفين مع الأسنان الطبيعية، ويشارك في الغشاء المخاطي للفم من قبل HSV-1 و C. البيض، في حين احتلت فتحتي الأنف الأنف الأمامية التي كتبها س. الذهبية 28. ومع ذلك، على الرغم من في المختبر النتائج أن S. الذهبية تلتزم الخلايا الظهارية الفم، 29،30 س. يتم عزل الذهبية نادرا من العينات عن طريق الفم عندما الأنسجة الطبيعية موجودة 29،30. ولا يعرف سوى القليل بشأن منافذ الجهاز المشارك الاستعمار التناسلية وراء النتائج السريرية التي S. ويرتبط الذهبية مع التهاب المهبل الهوائية، ويتميز بالتهاب الأعضاء التناسلية والتفريغ وعسر الجماع، بينما C. البيض تنتج الآفات المخاطية مماثلة لتلك التي لوحظت في تجويف الفم 31-35. وهكذا، على الرغم من أن هؤلاء الأعضاء من microbi عن طريق الفم والأعضاء التناسليةلى بعد الممالك التصنيفية عبر يعرف المتعلقة تفاعلها قليلا لأنه يؤثر قدرتها على الشروع في تشكيل بيوفيلم من خلال الانضمام إلى سطح الخلية المضيفة 5. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول على نحو فعال لتحديد عواقب وظيفية المشترك الاستعمار / العدوى.حاليا يتوفر على التفاعلات المعقدة بين الأعضاء الدائمين وشبه دائم في microbiome المضيفة التي تعبر متعددة المجالات التصنيفية، أي بدائيات النوى، حقيقيات النوى والفيروسية أية معلومات. لذلك وضعنا رواية في نظام نموذجي المختبر لدراسة بدء بيوفيلم من قبل س…
The authors have nothing to disclose.
This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).
C.albicans | |||
BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
S.aureus | |||
Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
Hela cells | |||
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
Gentamicin 50mg/ml | Sigma | 1397 | 50µg/ml final concentration in the complete DMEM |
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X | Corning | 25-052-CI | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
Other medium and reagents | |||
ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
1XPBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
Staining | |||
Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
Supplies | |||
Petri dish 100X15 | Dot Scientific | 229693 | |
Petri dish 150X15 | Kord Valmark | 2902 | |
96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
Culture tubes 100×13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
Cover slip circles, 12mm | Deckglaser | CB00120RA1 |