الأجسام المضادة ملزم خصوصية لكابا (Vκ) ضوء الإنسان (الغلوبولين المناعي) الأجسام المضادة التي تحتوي على سلسلة: Polysialic حمض (PSA) المرفقة لNCAM كدراسة حالة
Summary
We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (Vκ) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.
Abstract
Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research.
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.
Introduction
الأجسام المضادة للنمط إسوي الغلوبولين المناعي تظهر إمكانات علاجية كبيرة لعلاج الأمراض المختلفة ومنها السرطان واضطرابات الجهاز العصبي المركزي 1-7. وحددت المجموعة Vollmers "العديد من الأجسام المضادة في مرضى السرطان لاستخدامها المحتمل والمؤشرات الحيوية للورم معين أو العلاجات الفعالة التي هي قادرة على قتل الخلايا السرطانية عن طريق حفز مسارات أفكارك 4،8،9. ومن المثير للاهتمام، كل الأجسام المضادة التي تم تحديدها مع الإمكانات العلاجية هي من نمط إسوي الغلوبولين المناعي وتنتمي إلى مجموعة "الأجسام المضادة الطبيعية" (يعتقل).
وبالمثل، حددت مجموعة رودريجيز الماوس والأجسام المضادة البشرية التي تحفز عودة الميالين في آفات الحبل الشوكي عديمة الميلين مزمن في نماذج من التصلب المتعدد (MS). متطابقة إلى الأجسام المضادة مع تأثيرات مضادة للسرطان، عن الأجسام المضادة تشجيع عودة الميالين ويعتقل ومن نمط إسوي الغلوبولين المناعي 1،6،7،10. المستضدات دقيقة لIgMs الأكثر تحديدها لا تزال undetermineد-بما في ذلك تشجيع عودة الميالين الأجسام المضادة البشرية rHIgM22، حاليا في المرحلة الأولى من التجارب السريرية لمرضى التصلب المتعدد 11. وعلى الرغم من الجهود المتكررة من قبل خبراء في مجال الدهن والكربوهيدرات البحوث سواء في الأوساط الأكاديمية وبالشراكة مع الصناعة 11، يحاول التعرف لم تكن مستضد rHIgM22 الناجح. فشل التقنيات القياسية المستخدمة لتحديد المستضدات من الأجسام المضادة للعمل مع الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي يحدد حاجة ماسة لتحسين أساليب محددة لهذه الأجسام المضادة التي على الأرجح الكربوهيدرات الهدف أو الدهون المستضدات.
ويركز هذا المخطوط هو الإنسان الأجسام المضادة التجديدي HIgM12 والإجراءات التجريبية المستخدمة لتحديد المستضد لها. وقد تم تحديد الأجسام المضادة HIgM12 من المرضى الذين يعانون من مرض فالدنشتروم، ويحفز محوار ثمرة في المختبر 12-14 ويستهدف حمض polysialic (PSA) تعلق على العصبية جزيء التصاق الخلية (PSA-NCAM) 15،16. HIgM12 يمتد عمرا في نموذج الفأر من المرض 17 ويحسن نتائج وظيفية في فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفئران تايلر (TMEV) الفئران -infected. على وجه التحديد، HIgM12 يحفز النشاط الحركي الأفقي والرأسي التلقائي في الفئران ويزيد عديمة الميلين مزمنة أعداد قطر الصغيرة والمتوسطة محاور الحبل الشوكي ثمانية أسابيع بعد واحد، وجرعة منخفضة من داخل الصفاق حقن الأجسام المضادة 18.
والعصبي جزيء التصاق الخلية (NCAM) هو بروتين سكري من الغلوبولين المناعي (IG) أعرب الفصيلة على سطح الخلايا العصبية، الدبقية، الهيكل العظمي والعضلات، وخلايا القاتل الطبيعي 19-25. والإسوية NCAM الرئيسية الثلاثة يسمى NCAM180، NCAM140، وNCAM120، هي المتغيرات لصق بديلة للنسخة الأولية التي تختلف فقط في المجال الخاص بها حشوية. داخل الجهاز العصبي المركزي، NCAM هو جزيء رئيسي polysialylated (> 95٪) مع طويلة، homopolymers حمض اللعابي سالبة الشحنة. Polysialic لويطلق إدارة البحث الجنائي مع ن> 10 PSA ولكن الهياكل بلازميدة قليلة القسيمات أقصر موجودة والتي هي أيضا ذات الصلة بيولوجيا. البروتينات polysialylated أخرى أعرب في الجهاز العصبي المركزي هي SynCAM1 26، Neuropilin-2 (المفدال-2) 27،28 وحدة فرعية قناة الصوديوم 25 (للمراجعة يرى 29).
الأساليب المذكورة هنا تسمح تحديد المستضد لالمناعية الإنسان والفأر التي تحتوي على كابا (Vκ) سلاسل ضوء (VκI، VκIII أو VκIV سلاسل الضوء عن الأجسام المضادة البشرية وسلاسل ضوء VκI عن الأجسام المضادة الماوس) محددة بغض النظر عن نمط إسوي الأجسام المضادة (على سبيل المثال، مفتش، الغلوبولين المناعي و IgA، الجمعية الإسلامية أو إيج). ويستند هذا القيد على استخدام البروتين L الاغاروز لimmunoprecipitations مع الأجسام المضادة للنمط إسوي الغلوبولين المناعي. ويمكن أن تشمل الاستراتيجيات البديلة يكتينس ملزم المانوز والأجسام المضادة لمكافحة الغلوبولين المناعي الثانوية مرتبطة تساهميا إلى الاغاروز الخرز، والتي قد توسيع تطبيق هذا الأسلوب لمزيد من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي المؤتمر الوطني العراقيluding تلك مع سلاسل ضوء امدا (λ) (انظر المناقشة). نسب سلاسل ضوء المصل الغلوبولين المناعي Vκ مقارنة سلاسل الغلوبولين المناعي λ الخفيفة المستمدة من الأفراد الأصحاء هي 1.5: 1 30.
واستنادا إلى المنهجية الكروماتوغرافي المستخدمة هنا لفصل، وإثراء، ومناعيا الكشف عن بعض الجزيئات 31، يطلب من جميع المضادات ليشمل مجال واحد على الأقل بروتين صغير. حاتمة ملزمة محددة الأجسام المضادة يمكن أن يكون داخل أو خارج نطاق البروتين (على سبيل المثال، في البروتينات السكرية، البروتينات الدهنية). الخطوات البيوكيميائية الأولية المستخدمة لتحديد المستضد محددة لHIgM12، المعنية لتضييق قائمة المرشحين المحتملين، هي أهم الخطوات في هذا الأسلوب. يتم وصف نوع من الخلايا الاستعدادات محددة وخلية الأوصاف القائمة على مورفولوجيا الخلايا الدبقية لكن هذه المنهجية يمكن استقراء لاستيعاب أنواع الخلايا الأخرى داخل أو خارج الجهاز العصبي المركزي.
هناك إلحاحاتحتاج إلى تطوير تقنيات جديدة أو تعديل المعمول بها في عدد متزايد من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي مع الإمكانات العلاجية لاضطرابات الإنسان المختلفة خاصة في تلك الحالات (الأغلبية من المستضدات الغلوبولين المناعي) حيث الأهداف الأجسام المضادة هي هياكل الكربوهيدرات أو الدهون.
Protocol
Representative Results
Discussion
أضداد الغلوبولين المناعي الطبيعي الإنسان جذابة المرشحين لالمناعية، وبينت الإمكانات العلاجية لعلاج الأمراض المختلفة ومنها السرطان واضطرابات الجهاز العصبي المركزي 1-7. مفيد، فإن هذه الأجسام المضادة لا يثير استجابة مناعية في أي جيل من تحييد الأجسام المضادة يقلل كثيرا من الجرعة العلاجية الفعالة وفعالية. الأهم من ذلك، كانت جميع الأجسام المضادة مع الإمكانات العلاجية من نمط إسوي IgM و تنتمي إلى مرجع NAB 3-5،8،9،37،40،42-45. وهناك عقبة رئيسية لتطبيق السريرية المحتملة من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي هي التعرف على مولدات المضادات، والتي هي غير محددة في كثير من الحالات. التقنيات القياسية المستخدمة لالأجسام المضادة مفتش غالبا ما تكون غير قابلة للتطبيق لتحديد المستضد على الغلوبولين المناعي ل.
يصف هذا البروتوكول تحديد PSA-NCAM كما مستضد لالتجديدي البشري الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي HIgM12 وفعال في النماذج الحيوانيةمرض التصلب العصبي المتعدد وALS 15-18. المنهجية المستخدمة قابلة للتطبيق أساسا لجميع الأجسام المضادة البشرية مع سلاسل Vκ ضوء محددة VκI، VκIII وVκIV والأجسام المضادة الفأر مع سلاسل ضوء VκI، بغض النظر عن نمط إسوي الأجسام المضادة ل.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو استخدام الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي في تطبيقات اللوني التقارب. وبشكل أكثر تحديدا، يطلب من الأجسام المضادة ناجحة للعمل كوكلاء المنسدلة في immunoprecipitations لعزل أو لاثراء مستضد من نسيجيا أو خلية ثقافة لست] معقدة. ويمكن مقارنة الكسور مستضد المخصب immunoprecipitations من الأجسام المضادة isotype السيطرة وتحليلها في وقت لاحق عن الخلافات مطياف الكتلة. واحد شرط أساسي أو الحد من هذه الخطوة هو وجود الأجسام المضادة الصحيح Vκ سلسلة ضوء والمضيف (البشرية والماوس) لتمكين الأجسام المضادة ملزمة لبروتين L الاغاروز. استخدام بروتين ملزمة المنان بد أن الاغاروز (كالي أيضاكتين د المانوز ملزم) بدلا من البروتين L الاغاروز هو بديل محتمل لimmunoprecipitate IgMs بلا قيود محددة ضوء Vκ. ومع ذلك، كما قال ارنولد وآخرون. 35، والأجسام المضادة الغلوبولين المناعي محددة مستضد لا ربط بروتين ملزمة المنان، كما تظهر غليكان الهدف لتصبح غير قابلة للوصول مرة واحدة صر الغلوبولين المناعي للمستضد لها. وبناء على هذه النتائج المنان بروتين ملزمة لا يمكن أن تستخدم مصفوفة ملزمة لimmunoprecipitate الغلوبولين المناعي محملة مستضد الجزيئات 35. قد تكون بدائل محتملة أخرى استخدام محددة الاغاروز الثانوية أضداد الغلوبولين المناعي مفتش 46،47 أو استخدام الخرز المغناطيسي تنشيط سطح 48. الأجسام المضادة الموجهة ضد IgMs يمكن أن يكون crosslinked كيميائيا لالاغاروز A أو G الاغاروز من أجل الحد من مدى الأجسام المضادة مزال مع مستضد من الفائدة. مقارنة سليمة بين أنواع مختلفة من الغلوبولين المناعي مناعي فيما يتعلق المستضدات التي تم تحديدها بنجاح طالصعب بسبب أجريت معظم immunoprecipitations لعزل أو تستنفد IgMs دون مزيد من الفائدة في المستضدات الخاصة بهم. وبالإضافة إلى ذلك، تم immunoprecipitations باستخدام IgMs تستخدم أساسا لتأكيد مستضد واحد يعرف بالفعل أو متوقع مع التعرض الأجسام المضادة لمستضدات النقاء 49. والعيب الجماعات الحكومية الدولية، إلى جانب الاغاروز الموجهة ضد IgMs الإنسان هو العائد المنخفض جدا (10-15٪) من المصل immunoprecipitated جزيئات الغلوبولين المناعي بالمقارنة مع المواد انطلاق 50. في المقابل، تم تطبيق حبات مغناطيسية تنشيط سطح بنجاح إلى الأجسام المضادة من isotypes مختلفة بما في ذلك الغلوبولين المناعي لimmunoprecipitate الألياف المرتبطة سكرابي 48. لا يقتصر هذا الأسلوب لكابا محددة (Vκ) أو امدا (λ) سلاسل أو مجموعة معينة، ويمكن توسيع كبير الطيف من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي المستخدمة في immunoprecipitations.
خطوة هامة أخرى في البروتوكول هو قدرة الأجسام المضادة لتكون بمثابة ديتecting الأجسام المضادة (الأجسام المضادة الأولية) في البقع الغربية أو منصات فحص أخرى. يجب أن الأجسام المضادة ناجحة تستهدف المستضد مع تقارب عالية بما فيه الكفاية للسماح للمستضد ملزمة في وجود المنظفات غير الأيونية أو ربما الأيونية. الأجسام المضادة تقارب عالية شائعة بين الأجسام المضادة-maturated تقارب، ولكن أقل شيوعا بين الأجسام المضادة للنمط إسوي الغلوبولين المناعي، الذي هو واحد من الأسباب التي تجعل هناك نسبيا قليل المتاحة تجاريا الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي كما كشف عن وكلاء في إعدادات البيوكيميائية. عالية تقارب ملزم من الأجسام المضادة هو شرط لimmunoprecipitations المستضدات الجزيئية والنشاف الغربية. خفض تركيزات المنظفات أو الغياب الكامل للمنظفات في المخازن الملكية الفكرية ومخازن تحلل يسمح مستضد استهداف الأجسام المضادة تقارب منخفضة عبر نطاق فاب لها. في المقابل، قدرة الأجسام المضادة لاستهداف البروتين L الاغاروز عبر جزء التيسير لها لا يتأثر إلى حد كبير بين الضوابط نمط إسوي على مجموعة من تركيزات مختلفة المنظفاتtrations. ومع ذلك، وانخفاض تركيز المنظفات في المخزن تحلل وعازلة IP يمنع اضطراب غشاء الخلية وعزل جزيئات محددة. وبالمثل، فإن انخفاض تركيز المنظفات في مخازن وصمة عار غسل الغربية (على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني-T) يسمح مستضد ملزم من الأجسام المضادة تقارب منخفض، ولكن في نفس الوقت يزيد ملزم غير محددة وبالتالي فهو ليس خيارا.
وجود الأساسية بروتين المستضد هو شرط آخر لهذا الأسلوب. البروتينات مع التعديلات posttranslational (على سبيل المثال، البروتينات السكرية، البروتينات الدهنية) وبروتينات معدلة، ولكن ليس الدهون وحيدة أو الكربوهيدرات، وكشف في البقع الغربية. وليس من الممكن أن immunoprecipitate الدهون (على سبيل المثال، الإسفنجية) من الأنسجة أو الخلايا لست] في وجود أو عدم وجود المنظفات. الخصائص الفيزيائية والكيميائية المنظفات والدهون هي مشابهة جدا للسماح التفاعلات الدهون الأجسام المضادة انتقائية، بينما في نفس الوقت المنظفات ضرورية لتعطيلالأغشية من أجل السماح العزلة انتقائية من جزيئات محددة. لمعرفة أفضل لنا، immunoprecipitations تتألف فقط من الكربوهيدرات، في ظل عدم وجود جوهر البروتين، لم يتم ذكر سابقا. يصبح هذا أهمية خاصة لأن الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي كثيرا ما يستهدف الكربوهيدرات والسكرية، التي لا ترتبط بالضرورة إلى وحدة البروتين. مطلوبة الطريقتين أخرى لتحديد الفصل والمناعية من الدهون والكربوهيدرات في حالة عدم وجود نواة البروتين. على سبيل المثال، طبقة رقيقة اللوني (TLC) من الدهون الخلوية مع الكشف عن الأجسام المضادة لاحق على لوحة TLC (المناعية TLC) يمكن تنفيذها 51،52.
وقد وصفت أضداد PSA أخرى في الدراسات والنتائج السابقة مقارنة مع HIgM12 وكذلك متاح تجاريا مكافحة PSA الغلوبولين المناعي (استنساخ 2-2B). الأجسام المضادة الأكثر استخداما في مجال دعم البرامج والإدارة هو الأجسام المضادة مفتش (استنساخ 735) متوفرة كما monoc الماوسlonal أو بولكلونل الأرنب الأجسام المضادة 53. هذه الأجسام المضادة لمكافحة PSA مفتش بالكشف عن دعم البرامج والإدارة على SynCAM وNCAM على أنواع الخلايا الجهاز العصبي المركزي المختلفة بما في ذلك الخلايا دبيقي 41. وعلى النقيض من الأجسام المضادة لمكافحة PSA مفتش، والأجسام المضادة الغلوبولين المناعي الإنسان HIgM12، HIgM42 ومكافحة PSA الماوس الغلوبولين المناعي (استنساخ 2-2B) غير قادرين على استهداف دعم البرامج والإدارة على SynCAM (ولكن على NCAM) في مختلف مراحل ما بعد الولادة الجنينية وأوائل في الفئران ، في حين SynCAM غير polysialylated هو كشفها بسهولة (15). الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي المستخدمة هي أيضا ليست قادرة على كشف PSA على الخلايا الدبقية (الشكلان 3 + 4). وثمة تفسير محتمل لاختلافات يتم ملاحظتها بين isotypes الأجسام المضادة قد يكون انخفاض مستويات PSA-SynCAM بالمقارنة مع مستويات PSA-NCAM جنبا إلى جنب مع تقارب يحتمل أن تكون أقل ملزمة من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي بالمقارنة مع مكافحة PSA مفتش. لاختبار هذه الفرضية، أجرينا immunoprecipitations في الحيوانات NCAM KO في المرحلة الجنينية E17 مع كميات هائلة من SynCAM الحاضر وتستخدم HIgM12 ك "وكيل المنسدلة" <سوب> 15. في E17 WT littermate الضوابط HIgM12 immunoprecipitated PSA-NCAM إلى حد أن أظهر شدة مماثلة من "انزلوا" PSA-NCAM مقارنة IgMs سلسلة الثقيلة والكشف عنها بواسطة كثافة في طخة غربية اللاحقة باستخدام المضادات مزال. وتشير هذه النتيجة على الأقل تقارب كاف من HIgM12 لدعم البرامج والإدارة هدفها. وعلى النقيض من WT littermate يسيطر لم HIgM12 لم يكشف PSA تعلق على SynCAM في الحيوانات NCAM KO. وقد تم الحصول على نتائج متطابقة في immunoprecipitations باستخدام البشرية مكافحة PSA الغلوبولين المناعي HIgM42. لم يتمكنوا من استهداف دعم البرامج والإدارة على SynCAM في البقع الغربية من WT وNCAM KO الحيوانات في مراحل النمو الجنيني وبعد الولادة HIgM12 وHIgM42، فضلا عن الماوس لمكافحة PSA الغلوبولين المناعي (استنساخ 2-2B). ونظرا لكمية قليلة من HIgM12 المطلوبة (0.1 ميكروغرام / مل) للكشف على وجه التحديد دعم البرامج والإدارة تعلق على NCAM في البقع الغربية باستخدام كميات صغيرة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي (0.1 ميكروغرام الجهاز العصبي المركزي الأنسجة لكل بئر) 15 يبدو من غير المحتمل أن الانتماءات المنخفضة وحدهامسؤولة عن انعدام تام للكشف PSA-SynCAM التي كتبها HIgM12 في ثلاث طرق مختلفة.
نخلص إلى أن هناك اختلافات كبيرة بين الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي-PSA المضادة والتي نشرت في كثير من الأحيان الأجسام المضادة لمكافحة PSA مفتش (استنساخ 735). وليس من الواضح لماذا لم تستخدم المتاحة تجاريا أضداد الغلوبولين المناعي PSA أكثر في كثير من الأحيان في الماضي لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها مع antiPSA مفتش الأضداد 735. وهذا هو اهتمام بوجه خاص لHIgM12 وقد ثبت بالفعل فعالية في نماذج مرضية مختلفة. في حين أن غيرها الأجسام المضادة-PSA الغلوبولين المناعي قد يكون لها آثار علاجية مماثلة يبقى من غير الواضح ما إذا كانت الأجسام المضادة لمكافحة PSA مفتش (استنساخ 735) له نتائج علاجية مماثلة في نماذج من مرض التصلب العصبي المتعدد والمرض.
وباختصار، استخدمت الأساليب المذكورة هنا في المقام الأول لتحديد المستضد من HIgM12 الأجسام المضادة البشرية التجدد لدعم التجارب السريرية المحتملة لمرض التصلب العصبي المتعدد وربما غيرها من الأمراض العصبية. تحديد نملةigens عن الأجسام المضادة مع النشاط البيولوجي هو الخطوة بأنها ضرورية لفهم آلية عملها. يصبح هذا أهمية خاصة في سياق العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي يجري اختبارها حاليا للسلامة وفعالية في التجارب على الانسان. في حين أن عدد الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي اختبارها سريريا حتى الآن هو صغير، التطورات الحديثة في تكنولوجيا هجين جنبا إلى جنب مع عدد متزايد من الدراسات تسليط الضوء على الإمكانات العلاجية لهذه الفئة الأجسام المضادة 1-10،37،40،42-45 تحث تطوير جديدة أو أساليب تعديل تنطبق على تحديد غير البروتينية مستضدات الغلوبولين المناعي.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM092993، R01 NS048357 وR21 NS073684)، المؤسسة الوطنية للعلوم (جائزة التوظيف)، وجائزة مينيسوتا الشراكة للتكنولوجيا الحيوية وعلم الجينوم الطبية، وجمعية التصلب المتعدد الوطنية (CA1060A) ، ومركز مايو كلينيك للعلوم السريرية وبالحركة (CCATS). الكتاب يعترف بدعم من المؤسسات أبلباوم، هيلتون، بيترسون وسانفورد والقمر ومارلين صندوق لمدير حديقة والأسرة McNeilus.
Materials
| DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | HIGH GLUCOSE, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/mL, 100 ml |
| N-2 Supplement (100X) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
| B-27 Supplement (50X) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
| STERILE WATER FOR IRRIGATION | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1000 ml, 12/CA |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
| bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, =9,000 BAEE units/mg protein, |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, =2,000 Kunitz units/mg protein |
| Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 ug, lyophilized, >95%, 16.2 kDa |
| Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 ug, lypphilized, >97%, E.coli-derived, 12.5 kDa |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
| Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
| Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
| Phosphate-buffered Solution 1X (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
| Falcon 60mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
| Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
| 6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
| 75cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
| Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
| Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
| Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
| XT sample buffer (Western blot) | Biorad | #1610791 | 10 ml, 4 x premixed protein sample buffer |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
| Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3500 U/mg |
| 25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 25mm |
| HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1M |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1X (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
| Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
| L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |
Riferimenti
- Asakura, K., Miller, D. J., Pease, L. R. Targeting of IgMkappa antibodies to oligodendrocytes promotes CNS remyelination. J Neurosci. 18 (19), 7700-7708 (1998).
- Bieber, A. J., Warrington, A., Asakura, K. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia. 37 (3), 241-249 (2002).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. J Autoimmun. 29 (4), 295-302 (2007).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. N Biotechnol. 25 (5), 294-298 (2009).
- Vollmers, P. H., Brandlein, S. Natural monoclonal antibodies and cancer. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 3 (2), 84-87 (2008).
- Warrington, A. E., Asakura, K., Bieber, A. J. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (12), 6820-6825 (2000).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Ciric, B. A recombinant human IgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res. 85 (5), 967-976 (2007).
- Brandlein, S., Pohle, T., Ruoff, N. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans. Cancer Res. 63 (22), 7995-8005 (2003).
- Pohle, T., Brandlein, S., Ruoff, N. Lipoptosis: tumor-specific cell death by antibody-induced intracellular lipid accumulation. Cancer Res. 64 (11), 3900-3906 (2004).
- Miller, D. J., Sanborn, K. S., Katzmann, J. A. Monoclonal autoantibodies promote central nervous system repair in an animal model of multiple sclerosis. J Neuro. 14 (10), 6230-6238 (1994).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Van Keulen, V. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (5), 461-473 (2004).
- Xu, X., Warrington, A. E., Wright, B. R. A human IgM signals axon outgrowth: coupling lipid raft to microtubules. J Neurochem. 119 (1), 100-112 (2011).
- Xu, X., Wittenberg, N. J., Jordan, L. R. A patterned recombinant human IgM guides neurite outgrowth of CNS neurons. Sci Rep. 3, 2267 (2013).
- Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J., Ng, S. Polysialic acid as an antigen for monoclonal antibody HIgM12 to treat multiple sclerosis and other neurodegenerative disorders. J Neurochem. 134 (5), 865-878 (2015).
- Watzlawik, J. O., Painter, M. M., Wootla, B. A human anti-polysialic acid antibody as a potential treatment to improve function in multiple sclerosis patients. J Nat Sci. 1 (8), (2015).
- Xu, X., Denic, A., Jordan, L. R. A natural human IgM that binds to gangliosides is therapeutic in murine models of amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 8 (8), 831-842 (2015).
- Denic, A., Macura, S. I., Warrington, A. E. A single dose of neuron-binding human monoclonal antibody improves spontaneous activity in a murine model of demyelination. PLoS One. 6 (10), e26001 (2011).
- Lanier, L. L., Chang, C., Azuma, M. Molecular and functional analysis of human natural killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CD56). J Immunol. 146 (12), 4421-4426 (1991).
- Moore, S. E., Thompson, J., Kirkness, V. Skeletal muscle neural cell adhesion molecule (N-CAM): changes in protein and mRNA species during myogenesis of muscle cell lines. J Cell Biol. 105 (3), 1377-1386 (1987).
- Pollerberg, E. G., Sadoul, R., Goridis, C. Selective expression of the 180-kD component of the neural cell adhesion molecule N-CAM during development. J Cell Biol. 101 (5 Pt 1), 1921-1929 (1985).
- Seilheimer, B., Persohn, E., Schachner, M. Neural cell adhesion molecule expression is regulated by Schwann cell-neuron interactions in culture. J Cell Biol. 108 (5), 1909-1915 (1989).
- Trotter, J., Bitter-Suermann, D., Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysialylated embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural cell adhesion molecule by cultured oligodendrocytes and myelin. J Neuro Res. 22 (4), 369-383 (1989).
- Yazaki, T., Asou, H., Arimoto, K. Decrease of NCAM expression and astrocyte-neurone interaction in long-term cultured astrocytes. Neuroreport. 6 (8), 1085-1088 (1995).
- Zuber, C., Lackie, P. M., Catterall, W. A. Polysialic acid is associated with sodium channels and the neural cell adhesion molecule N-CAM in adult rat brain. J Biol Chem. 267 (14), 9965-9971 (1992).
- Galuska, S. P., Rollenhagen, M., Kaup, M. Synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1 is a target for polysialylation in postnatal mouse brain. Proc Natl Acad Sci. 107 (22), 10250-10255 (2010).
- Curreli, S., Arany, Z., Gerardy-Schahn, R. Polysialylated neuropilin-2 is expressed on the surface of human dendritic cells and modulates dendritic cell-T lymphocyte interactions. J Biol Chem. 282 (42), 30346-30356 (2007).
- Rollenhagen, M., Buettner, F. F., Reismann, M. Polysialic acid on neuropilin-2 is exclusively synthesized by the polysialyltransferase ST8SiaIV and attached to mucin-type o-glycans located between the b2 and c domain. J Biol Chem. 288 (32), 22880-22892 (2013).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94 (2), 461-518 (2014).
- Abe, M., Goto, T., Kosaka, M. Differences in kappa to lambda (kappa:lambda) ratios of serum and urinary free light chains. Clin Exp Immunol. 111 (2), 457-462 (1998).
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. High-quality immunofluorescence of cultured cells. Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).
- Cremer, H., Lange, R., Christoph, A. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Plattner, F. Distinct roles of different neural cell adhesion molecule (NCAM) isoforms in synaptic maturation revealed by analysis of NCAM 180 kDa isoform-deficient mice. J Neurosci. 24 (8), 1852-1864 (2004).
- Tomasiewicz, H., Ono, K., Yee, D. Genetic deletion of a neural cell adhesion molecule variant (N-CAM-180) produces distinct defects in the central nervous system. Neuron. 11 (6), 1163-1174 (1993).
- Arnold, J. N., Wormald, M. R., Suter, D. M. Human serum IgM glycosylation: identification of glycoforms that can bind to mannan-binding lectin. J Biol Chem. 280 (32), 29080-29087 (2005).
- Bjorck, L., Protein, L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains. J Immunol. 140 (4), 1194-1197 (1988).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Hensel, F. Differential expression of apoptosis receptors on diffuse and intestinal type stomach carcinoma. Cancer. 79 (3), 433-440 (1997).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Stummeyer, K., Dickmanns, A., Muhlenhoff, M. Crystal structure of the polysialic acid-degrading endosialidase of bacteriophage K1F. Nat. Struct. Mol. Biol. 12 (1), 90-96 (2005).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Ribbert, H. Apoptosis of stomach carcinoma cells induced by a human monoclonal antibody. Cancer. 76 (4), 550-558 (1995).
- Werneburg, S., Muhlenhoff, M., Stangel, M. Polysialic acid on SynCAM 1 in NG2 cells and on neuropilin-2 in microglia is confined to intracellular pools that are rapidly depleted upon stimulation. Glia. 63 (7), 1240-1255 (2015).
- Brandlein, S., Rauschert, N., Rasche, L. The human IgM antibody SAM-6 induces tumor-specific apoptosis with oxidized low-density lipoprotein. Mol Cancer Ther. 6 (1), 326-333 (2007).
- Vollmers, H. P., Hensel, F., Hermann, R. Tumor-specific apoptosis induced by the human monoclonal antibody SC-1: a new therapeutical approach for stomach cancer. Oncol Rep. 5 (1), 35-40 (1998).
- Vollmers, H. P., O’Connor, R., Muller, J. SC-1, a functional human monoclonal antibody against autologous stomach carcinoma cells. Cancer Res. 49 (9), 2471-2476 (1989).
- Vollmers, H. P., Zimmermann, U., Krenn, V. Adjuvant therapy for gastric adenocarcinoma with the apoptosis-inducing human monoclonal antibody SC-1: first clinical and histopathological results. Oncol Rep. 5 (3), 549-552 (1998).
- Nakano, K., Yasuda, K., Shibuya, H. ANNALS EXPRESS: Transient human anti-mouse antibody generated with immune enhancement in a carbohydrate antigen 19-9 immunoassay after surgical resection of recurrent cancer. Ann Clin Biochem. , (2016).
- Pettingill, P., Kramer, H. B., Coebergh, J. A. Antibodies to GABAA receptor alpha1 and gamma2 subunits: clinical and serologic characterization. Neurology. 84 (12), 1233-1241 (2015).
- Morel, N., Simon, S., Frobert, Y. Selective and efficient immunoprecipitation of the disease-associated form of the prion protein can be mediated by nonspecific interactions between monoclonal antibodies and scrapie-associated fibrils. J Biol Chem. 279 (29), 30143-30149 (2004).
- Lobo, P. I., Schlegal, K. H., Vengal, J. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies inhibit T-cell activation and chemotaxis. J Clin Immunol. 30, S31-S36 (2010).
- Lobo, P. I., Schlegel, K. H., Spencer, C. E. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies (IgM-ALA) inhibit T cell activation and chemotaxis. J Immunol. 180 (3), 1780-1791 (2008).
- Wikstrand, C. J., Fredman, P., Svennerholm, L. Detection of glioma-associated gangliosides GM2, GD2, GD3, 3′-isoLM1 3′,6′-isoLD1 in central nervous system tumors in vitro and in vivo using epitope-defined monoclonal antibodies. Prog Brain Res. 101, 213-223 (1994).
- Hamilton, W. B., Helling, F., Lloyd, K. O. Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by quantitative immune thin-layer chromatography. Int J Cancer. 53 (4), 566-573 (1993).
- Galuska, S. P., Oltmann-Norden, I., Geyer, H. Polysialic acid profiles of mice expressing variant allelic combinations of the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV. J Biol Chem. 281 (42), 31605-31615 (2006).
