FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales
Summary
formación de imágenes por resonancia Förster transferencia de energía (FRET) es una poderosa herramienta para estudios de biología celular en tiempo real. Aquí se presenta un método para las células de formación de imágenes de FRET en fisiológicos microambientes tridimensional (3D) de hidrogel utilizando microscopía de epifluorescencia convencional. Se describe un análisis de sondas FRET ratiometric que produce coeficientes lineal en el intervalo de activación.
Abstract
Obtención de imágenes de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) es una herramienta poderosa para el examen de la biología de células en tiempo real. Los estudios que utilizan FRET emplean comúnmente cultura de dos dimensiones (2D), que no imita la de tres dimensiones (3D) microambiente celular. Se presenta un método para llevar a cabo la emisión de imágenes se inactivó FRET usando microscopía de campo amplio de epifluorescencia convencional de células dentro de un entorno de hidrogel 3D. Aquí se describe un método de análisis para las sondas FRET ratiometric que produce coeficientes lineal en el intervalo de activación de la sonda. Medición de los niveles intracelulares de adenosina cíclico monofosfato (cAMP) se demuestra en los condrocitos bajo estimulación forskolina usando una sonda para EPAC1 de activación (ICUE1) y la capacidad de detectar diferencias en cAMP de señalización depende del tipo de material de hidrogel, en el presente documento un hidrogel fotorreticulación (PC-gel, polietileno glicol dimetacrilato) y un hidrogel termosensible (TR-gel). En comparación con los métodos 2D FRET,este método requiere poco trabajo adicional. Laboratorios ya que utilizan imágenes de FRET en 2D pueden adoptar fácilmente este método para realizar estudios celulares en un microambiente 3D. Además, puede estar aplicada a la detección de drogas de alto rendimiento en 3D microtejidos ingeniería. Además, es compatible con otras formas de formación de imágenes FRET, tales como la medición de anisotropía y de formación de imágenes de vida de fluorescencia (FLIM), y con plataformas avanzadas de microscopía confocal usando, por impulsos, o la iluminación modulada.
Introduction
la señalización celular es complejo y trascendental para numerosos campos, incluyendo la farmacología, la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Se necesitan herramientas de investigación útiles para mejorar nuestra comprensión de la biología celular y el desarrollo de materiales óptimos para la regeneración de tejidos. Formación de imágenes por resonancia Förster transferencia de energía (FRET) es una herramienta esencial que permite el análisis de la activación del receptor, conformación molecular, y las interacciones supramoleculares (por ejemplo., Proteína / formación de complejos de ADN) en las células vivas. FRET es un tipo de transferencia de energía no radiante entre fluoróforos 1. Tiene una eficiencia que es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre un fluoróforo donador y fluoróforo aceptor. Por lo tanto, puede proporcionar información sobre la distancia espacial entre dos moléculas diferentes en las distintas regiones o de una molécula en la escala nanométrica (típicamente 1 – 10 nm) 2. Los fluoróforos donante y aceptor pueden ser diferentes mtipos olecule (hetero-FRET), en la que el donante tiene la mayor emisión de energía (longitud de onda más corta), o del mismo tipo (homo-FRET). de imágenes FRET se puede realizar en las células fijas o en vivo, pero en general se utilizan células fijadas para obtener imágenes de las interacciones moleculares en alta resolución espacial cuando los sistemas confocal de alta velocidad no están disponibles. Las células vivas se utilizan para estudiar las interacciones y procesos que son inhibidas o alterado por fijación, tales como la respuesta en tiempo real 3 de señalización intracelular.
estudios de células vivas que emplean FRET uso de imágenes bidimensionales (2D) cultivos celulares en parte debido a la simplicidad y el fondo inferior (sin emisión desde fuera de las células planas). Sin embargo, los cultivos 2D también alteran numerosos procesos celulares en comparación con el microambiente fisiológico y cultivo en tres dimensiones (3D) 4,5. Por ejemplo, la célula originaria de la célula y las interacciones célula a la matriz extracelular se alteran drásticamente en cultivo 2D que lleva a la EASAIA observó cambios en la morfología celular y la polaridad 6. Microdominios de membrana (por ejemplo., Caveolas y balsas de lípidos) y la señalización del receptor están fuertemente regulados por el ambiente de cultivo, en parte porque se unen componentes del citoesqueleto 7,8 y la estructura de la forma celular y del citoesqueleto están fuertemente regulados por el ambiente de cultivo espacial 9. Mecanotransducción no sólo está influenciada por la matriz de 3D, sino por las más complejas condiciones de carga secundarios engendrada en entornos 3D en comparación con cultivos 2D 10. Por último, la permeabilidad de matrices 3D es menor que el medio de cultivo, en general con una disminución de la difusión y el aumento de la unión de moléculas de señalización celular en comparación con cultivos 2D. Con los cultivos 3D uno es capaz de crear y observar un microambiente más similar a la fisiológica con respecto al adhesivo, química, y las señales mecánicas. Interacciones célula a célula puede ser promovida y las propiedades adhesivas se puede controlar wITH la estructura, la composición y arquitectura (patrón) del material 3D 11-13. Las propiedades mecánicas del material del mismo modo se pueden adaptar por la composición y estructura de 14,15. El cultivo de células en hidrogeles, por tanto, los permisos de FRET estudios sobre células primarias que de otro modo de-Diferenciar o cambio en el fenotipo usando técnicas convencionales, por ejemplo., Las células de cartílago articular. Por lo tanto, se necesita un método para permitir a los ensayos de FRET en cultivos 3D en vivo.
andamios de hidrogel son ideales para los estudios basados 3D FRET, ya que pueden hacerse ópticamente transparente y adaptados para controlar el microambiente y para proporcionar señales celulares. Los hidrogeles a base de polímeros naturales se han utilizado en el cultivo celular durante décadas, incluyendo gelatina y fibrina 16. Un mayor control sobre el microambiente celular se puede lograr con la modificación química de estos polímeros y con el uso de polímeros sintéticos 17,18. hidrOGEL rigidez mecánica y la permeabilidad puede ser controlado cambiando su composición polimérica y el tamaño de malla (polímero y la densidad de reticulación) 19,20. Además, los hidrogeles se pueden hacer bioactivo a través de la incorporación de factores de crecimiento y ligandos celulares. Debido a estas posibilidades, el desarrollo de hidrogeles para biodetección, administración de fármacos, y aplicaciones de ingeniería de tejidos es un área muy activa de investigación 21. La impresión en 3D de los hidrogeles también está en desarrollo para la fabricación de micro-tejidos y -órganos 15. Por lo tanto, FRET de formación de imágenes de células en hidrogeles no sólo es útil como un medio para aproximar el comportamiento celular fisiológica, sino también como una herramienta para estudiar y optimizar el crecimiento del tejido de ingeniería.
sondas FRET ratiometric binarios son muy útiles en el estudio de la señalización celular y pueden ser utilizados en cultivos de hidrogel. Para obtener una lista parcial de los fluorescentes publicado y sondas FRET, consulte la página web de la célula Migración Consorcio <sup> 22. El tipo más común de la sonda contiene dos fluoróforos diferentes que están asociados o conectados por un elemento de reconocimiento (s) (región sensible analito). Estas regiones se someten a un cambio conformacional, asociación o disociación después de la detección del analito (por ejemplo., La unión de un ion o molécula, escisión enzimática de la región) que altera la distancia entre fluoróforos y, por tanto, la magnitud FRET (mayor o menor) 23. Un tipo de sonda menos común pero útil se basa en un cambio sensible analito en la superposición espectral de los dos fluoróforos, que altera la magnitud de FRET. "De cadena sencilla" sondas ratiometric utilizan un par fluoróforo unido en una sola molécula. Sondas "de cadena dual" utilizan pares de fluoróforo en moléculas separadas, pero su expresión se pueden acoplar con el mismo casete de expresión 24. A diferencia de los estudios con la expresión solo fluoróforo (por ejemplo., Proteínas de fusión fluorescentes), los estudios con radiométricasondas FRET no requieren dual transfección para controlar la eficiencia de transfección o la viabilidad celular. Sondas FRET Ratiometric son relativamente insensibles a la eficacia de transfección cuando se expresa por encima de un umbral mínimo (concentración insensible) 23,25. Ellos son insensibles a las fluctuaciones de la fuente de excitación y otros factores del entorno intracelular (por ejemplo., PH, iones) siempre y cuando ambos fluoróforos son igualmente sensibles. Además, su respuesta no está sujeta a un retraso de la transcripción, a diferencia de fluorescente y bioluminiscente de promotor-indicador construye 26,27.
sondas FRET radiométrica se emplean fácilmente y con frecuencia en los sistemas de microscopio de campo amplio de epifluorescencia convencionales. microscopios de campo amplio se prefieren sobre los sistemas confocal de barrido de línea de imágenes de células vivas, debido a las preocupaciones sobre el costo del sistema, blanqueo fluoróforo, y la captura de los cambios de señal con suficiente resolución temporal. Además, anal sola célulaanalysis sobre una gran población de células es posible con un escenario y la captura de imágenes motorizada a través de múltiples campos de visión. Widefield microscopía requiere un análisis basado intensidad de las señales de la sonda hetero-FRET. Aunque el análisis de la intensidad no requiere un hardware complejo como otros métodos de FRET, se necesita más trabajo posterior a la adquisición para corregir los efectos de comportamientos fluoróforo y configuraciones del sistema microscopio / 28 imágenes. La intensidad de emisión de un fluoróforo capturado es una función de la energía de excitación, fluoróforo rendimiento cuántico, y el filtro y la cámara combinada / detector sensibilidad espectral y la linealidad 2. Estos pueden ser diferentes para el donante y el aceptor y requerirán de calibración para el análisis cuantitativo. Además, las imágenes de la emisión del aceptor está influenciada por la superposición espectral de los fluoróforos (excitación de aceptor por la luz de excitación del donante y de purga a través de la emisión de donante en los espectros de emisión del aceptor) 2.4; de cadena sencilla "sondas son internamente normalizada porque sus fluoróforos son equimolar a nanoescala, mientras que los fluoróforos de" cadena "de doble sondas pueden existir en diferentes estequiometrıas lo largo de una célula 25,28 Si los fluoróforos de." De una sola cadena " sondas son de brillo similar (en función del coeficiente de extinción y el rendimiento cuántico), los efectos de la sensibilidad del detector no lineal son corrección pequeña y sólo para la fluorescencia de fondo y la sensibilidad de rendimiento / detector cuántico acoplado que se necesita 23. Así, "de una sola cadena" sondas FRET radiométrica se implementan con mayor facilidad en la microscopía de campo amplio 24.
En este trabajo se describe una técnica sencilla para realizar FRET de imágenes de células vivas en los cultivos de hidrogel 3D usando un microscopio de campo amplio de epifluorescencia convencional. Puede ser fácilmente adoptada por los laboratorios ya se llevan a cabo experimentos de FRET en 2D, además de los laboratorios interesados en interla señalización celular en microtejidos. Aquí se demuestra con el método de medición basado en imágenes de FRET de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) en los niveles de condrocitos vivos dentro de foto-reticulación (PC-gel, polietileno glicol dimetacrilato) y la respuesta térmica (TR-gel, Matrigel) hidrogeles. Una sonda FRET radiométrica se utiliza sobre la base de EPAC1 (ICUE1) para detectar los niveles de cAMP en respuesta a forskolina, un agonista de química para la adenilil ciclasa, que cataliza la conversión de ATP a AMPc. cAMP es uno de los principales segundos mensajeros que median G señalización del receptor acoplado a proteína y activa varios factores, incluyendo las proteínas de intercambio de aguas abajo directamente activadas por cAMP (EPAC). Los fluoróforos se separan sobre cAMP unión al dominio de EPAC que resulta en una disminución de FRET. Se describe aquí es la preparación de los materiales de hidrogel, la transfección de células con la sonda ICUE1, y la incrustación de las células en hidrogeles 3D. El procedimiento experimento 3D traste y el análisis de imágenes necesariopara evaluar la actividad de la sonda por célula se explican. También se discuten las limitaciones inherentes de análisis FRET en 2D y 3D utilizando microscopía de campo amplio. La técnica presentada aquí es una mejora sobre los métodos 2D existentes, ya que permite el análisis en un contexto más fisiológica y requiere menos corrección de la imagen y la calibración. Gran utilidad reside en el hecho de que muchos materiales transparentes se pueden utilizar mientras que las preferencias de células y transfección se pueden mantener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo demuestra cómo las imágenes FRET se puede utilizar para analizar la señalización celular en hidrogeles 3D. Mientras que los estudios anteriores han demostrado FRET obtención de imágenes de células sembradas en los sustratos de hidrogel de 35-37, de las interacciones extracelulares con hidrogeles 38, y de las moléculas atrapadas en hidrogeles 39-41, esta es la primera publicación para describir imágenes FRET análisis intracelular base de células embebidas dentro de hidrogeles 3D. El trabajo resuelve varios problemas de implementación cuando se traduce de imágenes FRET de 2D a 3D. En primer lugar, se necesitan objetivos gran apertura numérica para formación de imágenes FRET para reunir señal de emisión suficiente, pero limitan la profundidad de campo. Las células aquí se dejan sedimentar ligeramente a través de centrifugación para aumentar el número de células en un plano focal cerca del cristal para compensar esto. En segundo lugar, los andamios de hidrogel 3D se deriva a través del campo de visión durante la formación de imágenes que complica el análisis. Los hidrogeles aquí están unidos al coverslip de modo que permanecen fijos durante todo el experimento. En tercer lugar, la selección de composiciones de hidrogel adecuados para 3D FRET es esencial porque los hidrogeles pueden dificultar la visualización de las células. se utilizan hidrogeles Aquí transparentes de PC-gel y TR-gel. Sin embargo, la recolección de las células con centrifugación a un plano focal cerca del cubreobjetos se puede utilizar para celdas de imagen en hidrogeles con mayor diffraction.The elección de hidrogel depende de las condiciones microambiente que deberá ser simulado, que se pueden encontrar en una revisión en hidrogeles 42 . En cuarto lugar, se emplea un cálculo alternativo aquí para la relación de FRET de la sonda ICUE1 de cadena única (es decir, E = QE QE / CAEM) para minimizar el número de canales de imagen necesarios para el análisis y de este modo minimizar photobleaching. La relación media FRET por célula se calcula como el promedio de las proporciones por píxel dentro de una célula para minimizar la subestimación de la relación de FRET real. Por último, un análisis radiométrico lineal y mediospara calcular la fracción activa de sondas binarios de cadena sencilla se describe.
Hay varios aspectos críticos de la realización de experimentos exitosos FRET usando microscopía de campo amplio. Con respecto al hardware, la cámara debe ser lo suficientemente sensible para resolver pequeños cambios en la señal, dejando cámaras CMOS científicos más recientes y de electrones multiplicando CCD adaptan mejor que los CCD convencionales. Para analizar mejor la distribución espacial de la relación de FRET, la cámara debe, como mínimo, poseen el doble de la resolución espacial de la función de dispersión de punto del objetivo (criterio de Nyquist). Esto hace que los sistemas de doble visión menos adecuado para la tarea. Más importante es seleccionar una velocidad de adquisición de la exposición y la imagen apropiada para el par FRET dado a fin de minimizar photobleaching de los fluoróforos. Una disminución de la tasa de adquisición se recomienda medida que aumenta la duración de la prueba. El uso de ruedas de filtros rápidos aumenta la velocidad de adquisición y el número de FOV para el análisis, mientras que evitaning las cuestiones de registro de imágenes con visualización dual y cubos de filtros torreta. El campo de iluminación no homogénea complica corrección para la fluorescencia de fondo que surge de la autofluorescencia de la muestra y el ruido del sistema de la cámara. Algunos hidrogeles, particularmente los que contienen proteínas de colágeno son altamente autofluorescent 43,44. Las relaciones de FRET se subestiman y sin corrección de fondo. Aquí empleamos un simple método de corrección de fondo que se basa en el campo de iluminación relativamente plana que a menudo se puede configurar con iluminación epi-fluorescencia a lo largo del centro de la imagen (Figura 3B, Etapa 7.2). Por lo tanto, este método restringe las células de interés para aquellos dentro de este campo de iluminación. La corrección de fondo se describe aquí no tiene en cuenta la autofluorescencia celular en las longitudes de onda de lectura de la sonda binario. En tal caso, las células no marcadas (sin sonda de transfección) deben ser reflejados en las mismas condiciones y antecedentes resta. A mix de células marcadas y no marcadas se puede usar y las células no marcadas seleccionado para el retorno de la inversión de fondo. Los métodos alternativos que proporcionan para el análisis de células en todo el campo de imagen incluyen el uso de una máscara de sombra, varias regiones de interés del fondo, o muestras idénticas sin células y un protocolo está disponible bajo petición.
Específico para imágenes 3D FRET, respuesta de la sonda es muy sensible a la permeabilidad de hidrogel al analito (Figura 6). Por lo tanto las mismas regiones de hidrogel se comparan a través de los tratamientos experimentales, preferiblemente en un punto de simetría geometría como por ejemplo cerca del centro de andamio, como se usa aquí. Alternativamente, las cámaras de microfluidos / biorreactores pueden emplearse para perfundir rápida y uniformemente el hidrogel con una solución de analito 45. Una señal de FRET puede no ser detectado (relación señal a ruido es demasiado bajo) cuando la autofluorescencia del hidrogel es demasiado alto; un hidrogel más delgada o una sonda diferente (diferentes fluoróforos) deben ser utilizados.Con respecto a las imágenes en 3D FRET en hidrogeles fotoentrecruzado, se recomienda el uso de la exposición de irradiación de menos y longitudes de onda fuera de los espectros de excitación de los fluoróforos de la sonda. LAP se puede usar con una fuente de luz visible a 405 nm para minimizar aún más el potencial de daño celular 31,46. Sin embargo, se recomienda el uso de la irradiación LAP con 365 nm, porque esto minimiza la decoloración de la sonda. 365 nm se encuentra en el extremo de cola del espectro de excitación del donante PPC, mientras que 405 nm se encuentra en el pico de excitación. Alternativamente, la expresión sonda se puede dejaron recuperar durante un día. El uso de sondas binarios minimiza los problemas de sensibilidad a las diferencias en los niveles de expresión y en la difusión molecular de los fluoróforos donante y aceptor. sondas no binarias se pueden usar, pero con SE en lugar de formación de imágenes QE y corrección adicional para espectral de purga a través de la excitación y espectros de emisión (ver abajo). Por otra parte, la baja disponibilidad comercial y la complejidad en el diseño de sondas FRETpuede ser un obstáculo. El factor más crítico para el éxito de los experimentos se mantiene la corrección adecuada y el análisis de las señales de fluorescencia.
Un cálculo alternativo de la relación de FRET es utilizado por varias razones adicionales además de la reducción al mínimo de photobleaching. Para las sondas de una sola cadena binarios, la relación frecuente es emisión del aceptor bajo excitación donante (emisión sensibilizada, SE) para la emisión del donador bajo excitación donante (emisión se inactivó, QE), es decir, FRET ratio = SE / QE 25,47,48. SE / QE es relativa no lineal a los cambios en la eficiencia de FRET 21,22,47. A saber, la relación tiene una relación exponencial no lineal para inherente eficiencia FRET de la sonda (Ei) (trabajo no publicado Donius, AE, Taboas, JM. (2015)), con la relación más lineal para Ei menos de aproximadamente 15%. SE / QE también subestimar la fracción de sondas activadas (FAP, es decir, la fracción de sondas analito de unión). Therefore, el análisis de SE / QE requiere una dosis de equilibrio engorroso estudio de respuesta y ajuste de la curva. Afortunadamente, las relaciones de SE o QE a la emisión del aceptor bajo excitación del aceptor (AEM) son lineales con respecto a Ei y la FAP, es decir, las relaciones de FRET SE / Aem y QE / Aem. SE / Aem se utiliza a menudo para sondas binarias y sólo requiere la calibración de punto final (sin actividad de la sonda y la actividad de la sonda completa), pero la señalización celular basal hace esto difícil. Para eliminar la necesidad de calibración de punto final, SE puede ser corregida (CSE) para la superposición espectral de donantes y de excitación del aceptor y de emisión de espectros (espectral derrame) y para el rendimiento cuántico y la sensibilidad espectral (QS) de los fluoróforos de la sonda combinados y microscopio sistema de imagen. La relación SE FRET corregido basado en CSE define la eficiencia de FRET observada de las sondas dentro de cada píxel de una imagen, es decir, E SE = CSE / Aem. El software comercial y libre está disponible para corregir SE para estos efectos yse remite al lector a la obra de Chen y Periasamy 2006 para una explicación detallada de los métodos 50. Sin embargo, el cálculo de E SE requiere captura de tres canales de imagen por punto de tiempo (SE, QE, AEM). Por lo tanto, en este trabajo también empleamos una relación de FRET alternativo E QE = 1 – QE / CAEM, que requiere la captura de sólo dos canales de imagen (QE y AEM). El cálculo de E QE de estos canales sólo requiere la corrección de AEM para QS (CAEM = Aem x QS). QS = Dem / AEM se estima fácilmente utilizando dos imágenes de la muestra de uno de calibración, donde Dem es la emisión del donador bajo excitación de los donantes con blanqueada aceptor. El FAP en cualquier instante puede calcularse mediante la comparación de E SE o E QE a la Ei de la sonda.
En última instancia, la selección de relación de FRET (E SE = CSE / AEM vs E = QE QE / CAEM) debe basarse en la consideración del tipo de sonda y los canales con mejor señal. tanto unapproaches incluyen corrección de ruido de fondo de las imágenes por trama como se describió anteriormente para dar cuenta de los cambios en la autofluorescencia lo largo del tiempo. Ellos asumen ninguna superposición de la luz de excitación AEM en el espectro de excitación Dem, que suele ser el caso debido a sondear la configuración del filtro de diseño y el microscopio. sondas de cadena simple pueden utilizar y selección se basa en la mejor señal de la sonda (luminosidad) para que el ruido de la cámara y de la señal de fondo en SE y canales de alivio cuantitativo. Para la sonda ICUE1 y las condiciones experimentales utilizadas aquí (tipos de células y de hidrogel), SE tiene una señal más fuerte que el QE. Sondas de cadena doble requieren el uso de E SE debido a la distribución no equimolar de donante y aceptor fluoróforos. Para sondas que disminuyen de FRET a analito como ICUE1, traste eficiencia puede ser "invertido" para presentar un cambio de señalización positiva tras la unión del analito como lo hacemos aquí, con E SE = 1 – CSE / AEM o E QE = QE / (AEM x QS).
Análisis de THe FAP es sensible a la corrección adecuada de las relaciones de FRET y para la estimación de la IE. Se puede estimar con la misma muestra de calibración utilizado para QS y un punto final convencional FRET ensayo de eficacia que Ei = 1- (QE / DEM) (imagen QE seguido de aceptor photobleaching y una imagen Dem) 28, pero hay que tener cuidado para minimizar blanqueo accidental del donante. Se describe una versión modificada en la que se sustituye la estimación del Dem basado en Aem ajustado por QS, es decir, Ei = 1 – (QE / (AEM x QS)). Alternativamente, Ei = CSE / Aem puede ser utilizado. Estimación de la IE en las células vivas requiere que todas las sondas de ser conducidos a la plena FRET. Esto es difícil de lograr en la práctica para las sondas, tales como ICUE1 que disminuyen en FRET tras la unión del analito. Un cálculo in vitro basado en el uso de Ei lisados celulares y analito purificado es lo mejor, pero fuera del alcance de este trabajo. Aquí se recomienda el uso de 2 ', 5'-didesoxiadenosina para disminuir cAMP en las células. Sin embargo, un FAP relativa puede be calculado utilizando una estimación Ei derivada del nivel basal de señalización. Por estas razones, los estudios más a menudo informan de la relación de FRET (como se hace aquí) o una FAP relativo basado en la calibración de punto final, donde la línea de base de señalización antes de añadir agonista es el límite inferior y la señal después de la adición de un segundo agonista que satura de señalización es el superior ligado. Forskolin se utiliza a menudo como un agonista de control para saturar señal de cAMP. Alternativamente, un análogo de cAMP puede ser utilizado como 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-monofosfato cíclico. Se recomiendan controles positivos utilizados en la realización de estudios para identificar cambios potenciales en la vía de señalización entre los tratamientos experimentales.
Cálculo de la respuesta promedio de señalización por célula requiere la consideración de varios factores. En primer lugar, la relación media FRET debe calcularse como el promedio de las proporciones en cada píxel dentro de una célula, es decir, (Σ (QE/cAem)) / (número de píxeles), en lugar de la ratio de la QE media y AEM en una célula, es decir, (ΣQE) / (ΣcAem). Aunque este último no requiere una cuidadosa enmascaramiento como ruido de fondo es bajo, subestima gravemente la verdadera razón media de FRET. Sin embargo, las relaciones de píxeles requieren cálculos de punto flotante y el enmascaramiento binaria cuidado del área de la celda para definir el rendimiento de la inversión y evitar la inclusión de relaciones espurias generadas por el ruido de fondo fuera de la célula. Toda la zona de la celda debe ser cuantificada para evitar sesgar los resultados en forma de la célula. puede necesitar el enmascaramiento que redefinirse con el tiempo dependiendo de los cambios en la forma celular y la migración. Alternativamente, ROIs más grande que la célula se puede utilizar si se definen los criterios de exclusión para eliminar proporciones de píxel a partir de señales Aem que caen muy por debajo de los niveles celulares y están cerca de los niveles de fondo y QE. Los métodos de análisis se describe detalladamente los pasos básicos utilizados en este trabajo para el análisis FRET sin software / plugins especializados. fabricantes de microscopios y otros vendedores ofrecen módulo adicionals para su software de microscopio, que apoyan radiométrica automatizada y FRET análisis. Del mismo modo, el software ImageJ dominio público tiene varios plugins disponibles para el análisis de partículas y FRET, como RiFRET. En segundo lugar, la relación de FRET promedio basado en píxeles subestima la verdadera relación media de la estructura celular en 3D porque se utiliza una imagen 2D. Las señales 2D representan y media a lo largo del eje z. Cálculo de la distribución espacial de las relaciones de 3D FRET en las células vivas no es posible sin la formación de imágenes en 3D de alta velocidad (por ejemplo., Utilizando microscopía confocal disco giratorio). Este es un problema tanto para los cultivos 2D y 3D, pero tiene un efecto mayor en 3D como más de la estructura celular existe fuera del plano. Esto es de gran preocupación para las sondas que localizan a las estructuras celulares, tales como la membrana plasmática sonda EPAC1 PM-ICUE. Ver Spiering et al. 2013 para sugerencias para corregir los efectos de espesor celular en cálculos de la relación 24. Análisis de la distribución de Aem se puede utilizar paradetectar si la sonda se acumula en las regiones del plano de formación de imágenes de células y ajustado. Esto también ayudará a interpretar la distribución espacial de las relaciones de FRET y eliminar resultados espurios, por ejemplo., La identificación de la saturación de la sonda (es decir, una región de baja AEM tendrá baja concentración de sonda y puede presentar saturación de la sonda y alta relación de FRET). En tercer lugar, los diferentes niveles de línea de base FRET pueden indicar una diferencia en la eficacia de la transfección, la sonda de expresión, o la señalización basal entre los grupos experimentales. "El análisis relativo" (Paso 10.1.1) ayuda a eliminar la deriva en la proporción de FRET con el tiempo si está presente. Se facilita la comparación de la magnitud relativa de las respuestas entre muestras, pero impide comparación con el curso de tiempo de respuesta para la muestra de referencia (parcela de control es una línea plana). "Análisis absoluta" (Paso 10.1.2) facilita la comparación de la tasa de respuesta a través de muestras, pero dificulta la comparación de la magnitud de la respuesta, ya que cada línea se escala por un dissimIlar constante. Los estudios a menudo utilizan una regresión lineal sobre la línea de base para corregir la deriva en la relación de FRET con el tiempo.
El método 3D FRET descrito es una forma útil y práctica de fabricar y realizar las imágenes de lapso de tiempo de los teléfonos hidrogeles 3D cargados, que se pueden aplicar a otras sondas y de modalidades de imágenes. Otro sistema de FRET, además de sondas binarios de cadena única requerirá más compleja corrección de señales basado intensidad, como se discutió anteriormente. Alternativamente, las imágenes de vida de fluorescencia de FRET (FLIM-FRET) se puede utilizar para calcular la eficiencia de FRET a través de un cambio en la vida de emisión del donante de la sonda. A diferencia de FRET a base de intensidad, Flim-FRET es insensible al ruido de fondo, espectral derrame, la eficiencia cuántica, y el detector de sensibilidad espectral 2. Sin embargo, los sistemas de Flim son costosas, complejas y poco común, y funcionan mejor con fluoróforos con caries exponente sola y sin Flim escorrentía 49. El método descrito también se puede utilizar con more microscopios avanzados (por ejemplo., FRET-TIRF, la anisotropía de fluorescencia, y FRET correlación espectral). La aplicación de este método para imágenes en 3D con confocal de alta velocidad y la microscopía multifotónica facilitará el análisis de la distribución subcelular de la respuesta de señalización e incrementar la exactitud del análisis de señalización. Este método permitirá 3D FRET estudios avanzados de biología celular en microambientes celulares 3D simulado. Como tal, se puede aplicar fácilmente a la farmacología y las necesidades de medicina regenerativa, incluyendo el estudio de señalización intercelular y cribado de la respuesta al fármaco en microtejidos a base de hidrogel de ingeniería.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo financiero de la Escuela de Medicina Dental de la Universidad de Pittsburgh, los Institutos Nacionales de Salud de adjudicación K01 AR062598, y DE030740 P30 subvención. Los autores también agradecen al Dr. Jin Zhang por el plásmido ICUE1, Wayne Rasband para el desarrollo de ImageJ y Michael Cammer para la macro ImageJ.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] | Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) | NC0162601 | Reagents |
| Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) | Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich | 95904 | Reagents |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514 | Reagents |
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 440167 | Reagents |
| Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470-5g | Reagents |
| 2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride | Fisher Scientific | AC244280100 | Reagents |
| 2-Butanone | Fisher Scientific | AC149670010 | Reagents |
| Lithium Bromide | Fisher Scientific | AC199871000 | Reagents |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 190764 | Reagents |
| Sigmacote (siliconizing reagent) | Sigma Aldrich | SL2 | Reagents |
| Toluene | Fisher Scientific | AC36441-0010 | Reagents |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH3025601 | Reagents |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) | Life Technologies | 11058-021 | Reagents |
| FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) | Promega | E2311 | Reagents |
| Cellstripper (cell dissociation solution) | Corning | 25-056-CI | Reagents |
| Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free | Corning | 356231 | Reagents |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Reagents |
| Pipette Tips (10,200,1000 μl) | Fisher Scientific | 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 | Disposable lab equipment |
| Powder Free Examination Gloves | Fisher Scientific | 19-149-863B | Disposable lab equipment |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Disposable lab equipment |
| Biopsy punch (3 mm) | Miltex | 3332 | Disposable lab equipment |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-544C | Disposable lab equipment |
| Precoated glass coverslips (epoxysilane) | Arrayit | CCSL | Disposable lab equipment |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12550D | Disposable lab equipment |
| Sterile vials (15 mL, 50 ml conical) | Fisher Scientific | 14-959-70C, 14-959-49A | Disposable lab equipment |
| Cell culture dish (6-well) | Falcon | 351146 | Disposable lab equipment |
| Epifluorescent Microscope with motorized stage | Nikon | MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) | Large/non-disposable lab equipment |
| Adjustable Specimen Holder for XY Stage | Nikon | 77011393 | Non-disposable lab equipment |
| 60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) | Nikon | MRD01605 | Non-disposable lab equipment |
| CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) | Nikon (Sutter Instrument reseller) | 77016231, 77016088 | Non-disposable lab equipment |
| CYF/YFP filter set | Nikon (Chroma Technology Corp) | 77014928 | Non-disposable lab equipment |
| Camera (ORCA Flash 4.0 v1) | Nikon (Hamamatsu reseller) | 77054076 | Non-disposable lab-equipment |
| NIS-Elements 40.20.02 microscope software) | Nikon | MQS31100 | Non-disposable lab equipment |
| Prism (spreadsheet and graphing software) | GraphPad Software, Inc | Version 6 | Non-disposable lab equipment |
| OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ=365 or 405) | OmniCure | S1000 | Large/non-disposable lab equipment |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | DP-100 | Non-disposable lab equipment |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | Reichert Bright-Line 1475 | Non-disposable lab equipment |
| Vacuum desiccator chamber/degasser | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Tissue Culture Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Chemical Fume Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Oven | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Spatula | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Beaker | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Incubator | Any | Large/non-disposable lab equipment |
Riferimenti
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