JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Published: August 01, 2016
doi:
10.3791/54135
, ,
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine,University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine,University of Pittsburgh, 3Laerdal AS

Summary

Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Echtzeit Zellbiologie Studien. Hier wird ein Verfahren für FRET Abbildungszellen in physiologischen dreidimensionalen (3D) Hydrogel-Mikroumgebungen herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskopie verwendet wird präsentiert. Eine Analyse für ratiometrisches FRET-Sonden, die lineare Verhältnisse über den Aktivierungsbereich ergibt beschrieben.

Abstract

Imaging von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Zellbiologie in Echtzeit zu untersuchen. Studien FRET unter Verwendung allgemein zweidimensionale (2D) Kultur eingesetzt werden, die nicht die dreidimensionale (3D) zelluläre Mikroumgebung nicht imitieren. Ein Verfahren zur abgeschreckt Emission FRET-Bildgebung durchführen unter Verwendung herkömmlicher Weitfeld- Epifluoreszenzmikroskopie von Zellen in einer 3D-Hydrogel-Umgebung vorgestellt. Hier ist eine Analysemethode für ratiometrisches FRET-Sonden, die lineare Verhältnisse über die Sonde Aktivierungsbereich ergibt beschrieben. Messung des intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) Ebenen wird in Chondrozyten unter Forskolin-Stimulation unter Verwendung einer Sonde für EPAC1 Aktivierung (ICUE1) und die Fähigkeit, zu erkennen, Unterschiede in der cAMP-Signalisierungs abhängig von Hydrogelmaterial Typ, hierin ein Photo Hydrogel (PC-Gel zeigte, Polyethylenglykoldimethacrylat) und einem Hydrogel thermoresponsive (TR-Gel). Im Vergleich zu 2D-FRET-Methoden,Diese Methode erfordert nur wenig zusätzliche Arbeit. Laboratories bereits FRET-Bildgebung in 2D verwendet, kann diese Methode leicht annehmen zelluläre Studien in einer 3D-Mikroumgebung auszuführen. Es kann weiter auf einen hohen Durchsatz Wirkstoff-Screening in engineered 3D microtissues angewendet werden. Darüber hinaus ist es kompatibel mit anderen Formen der FRET-Bildgebung, wie Anisotropie Messung und Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) und mit erweiterten Mikroskopie-Plattformen mittels konfokaler, gepulst oder modulierte Beleuchtung.

Introduction

Cellular-Signalisierung ist sowohl komplex als auch Folge für zahlreiche Felder, einschließlich Pharmakologie, Tissue Engineering und der regenerativen Medizin. Nützliche Prüfpräparat Werkzeuge nötig sind, um unser Verständnis der Zellbiologie zu fördern und optimale Materialien für die Geweberegeneration zu entwickeln. Förster – Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung ist ein wichtiges Werkzeug , um die Analyse der Rezeptoraktivierung, molekulare Konformation und supramolekularen Wechselwirkungen (z. B. Protein / DNA – Komplexbildung ) in lebenden Zellen. FRET ist eine Art von nicht-radiative Energieübertragung zwischen Fluorophoren 1. Es hat einen Wirkungsgrad, der zwischen einem Donor-Fluorophor und dem Akzeptor-Fluorophor umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstandes ist. (- 10 nm typischerweise 1) 2 Somit kann Informationen über die räumliche Distanz zwischen zwei verschiedenen Molekülen oder zwischen den Regionen eines Moleküls im Nanometerbereich sorgen. Die Spender und Akzeptor-Fluorophore können verschiedene m seinolecule Typen (hetero-FRET), in dem der Spender die höhere Energieemission (kürzere Wellenlänge) aufweist, oder des gleichen Typs (homo-FRET). FRET-Bildgebung kann auf feste oder lebenden Zellen durchgeführt werden, aber im Allgemeinen fixierten Zellen werden für die Bildgebung von molekularen Wechselwirkungen mit hoher räumlicher Auflösung verwendet wird, wenn Hochgeschwindigkeits-konfokale Systeme nicht verfügbar sind. Lebende Zellen werden verwendet , Interaktionen und Prozesse zu untersuchen , die inhibiert werden oder durch Fixierung verändert, wie das Echtzeit – intrazelluläre Signalantwort 3.

Studien an lebenden Zellen, die beschäftigen FRET-Imaging-Anwendung zweidimensionale (2D) Zellkulturen zum Teil wegen der Einfachheit und geringeren Hintergrund (keine Emission von aus der Ebene Zellen). Jedoch auch 2D – Kulturen zahlreiche zelluläre Prozesse , verglichen mit der physiologischen Mikroumgebung und dreidimensionale (3D) Kultur 4,5 verändern. Zum Beispiel nativen Zelle zu Zelle und Zelle zu extrazellulären Matrix-Interaktionen werden in 2D-Kultur drastisch verändert den eas führendenily beobachteten Veränderungen in der Zellmorphologie und Polaritäts 6. Membranmikrodomänen (z. B. Caveolae und Lipid Rafts) und Rezeptor – Signal werden von der Kulturumgebung, teilweise stark reguliert , weil sie Zytoskelett – Komponenten 7,8 und die Zellform und Zytoskelettstruktur binden , werden stark von der räumlichen Kulturumgebung geregelt 9. Mechanotransduktion wird nicht nur durch die Matrix 3D beeinflusst, sondern durch den komplexeren sekundären Belastungsbedingungen erzeugt in 3D – Umgebungen im Vergleich zu 2D – Kulturen 10. Schließlich ist die Durchlässigkeit von 3D-Matrices weniger als das Kulturmedium im allgemeinen mit der Diffusion verringert und eine erhöhte Zellbindungsmoleküle im Vergleich zu 2D Kulturen signalisiert. Mit der 3D-Kulturen ist eine Lage, eine Mikro mehr ähnlich der physiologischen in Bezug auf Klebstoff, chemische und mechanische Signale zu erzeugen und zu beobachten. Zell-Zell-Wechselwirkungen gefördert werden, und die Klebeeigenschaften können gesteuert werden, wit der Struktur, Zusammensetzung und Architektur (Strukturierung) des 3D – Material 11-13. Die mechanischen Eigenschaften des Materials kann ebenfalls durch die Zusammensetzung und Struktur 14,15 zugeschnitten werden. Kultivieren von Zellen in Hydrogelen daher ermöglicht FRET Untersuchungen an primären Zellen , die sonst dedifferenzieren oder Änderung im Phänotyp würde unter Verwendung herkömmlicher Techniken, z. B. Zellen , die aus Gelenkknorpel. Somit wird ein Verfahren benötigt, FRET-Assays mit lebenden Kulturen 3D zu ermöglichen.

Hydrogele Gerüste sind ideal für 3D-FRET-basierte Studien, weil sie optisch transparent gemacht werden können und zugeschnitten auf die Mikroumgebung zu steuern und zelluläre Signale zur Verfügung zu stellen. Hydrogele hergestellt aus natürlichen Polymeren wurden in der Zellkultur seit Jahrzehnten, einschließlich Gelatine und Fibrin 16 verwendet. Größere Kontrolle über die zelluläre Mikroumgebung kann mit chemischen Modifizierung dieser Polymere mit der Verwendung von synthetischen Polymeren 17,18 erreicht werden. HydrOGEL mechanische Steifigkeit und Permeabilität kann durch Änderung ihrer polymeren Zusammensetzung und Maschenweite (Polymer und die Vernetzungsdichte) 19,20 gesteuert werden. Ferner können Hydrogele bioaktiven durch den Einbau von Wachstumsfaktoren und zellulären Liganden hergestellt werden. Aufgrund dieser Möglichkeiten, die Entwicklung von Hydrogelen für die Biosensorik, Arzneimittelabgabe, und Tissue Engineering – Anwendungen ist ein sehr aktiver Forschungsbereich 21. 3D – Druck von Hydrogelen ist auch die Entwicklung für die Herstellung von Mikrogewebe unterzogen und -organs 15. Somit FRET Bildgebung von Zellen in Hydrogelen ist nicht nur nützlich als ein Mittel physiologischen zellulären Verhalten anzunähern, aber auch als Hilfsmittel zum Studium und konstruiert Gewebewachstum zu optimieren.

Binary ratiometrisch FRET-Sonden sind sehr nützlich in zelluläre Signal studieren und kann in Hydrogels Kulturen eingesetzt werden. Für eine unvollständige Liste der veröffentlichten fluoreszierenden Sonden und FRET finden Sie in der Zellmigration Consortium Website <sup> 22. Die häufigste Sondentyp enthält zwei verschiedene Fluorophore, die von einem Erkennungselement (e) (Analyt empfindlichen Bereich) assoziiert oder verbunden sind. Diese Bereiche werden einer Konformationsänderung, Assoziation oder Dissoziation bei Detektion des Analyten (z. B. die Bindung eines Ions oder Moleküls, enzymatische Spaltung der Region), der den Abstand zwischen den Fluorophoren und daher der FRET Grße verändert (entweder höher oder niedriger) 23. Eine weniger häufige, aber nützliche Sondentyp stützt sich auf einen Analyten empfindlich Veränderung der spektralen Überlappung der beiden Fluorophore, die FRET-Größe verändert. "Single-chain" ratiometrisches Sonden verwenden ein Fluorophor Paar auf einem einzigen Molekül verbunden. "Dual-Kette" -Sonden Fluorophor – Paare auf separaten Molekülen nutzen, aber ihr Ausdruck kann unter der gleichen Expressionskassette 24 gekoppelt werden. Im Gegensatz zu Studien mit einzelnen Fluorophor Ausdruck (z. B. fluoreszierende Fusionsproteine), Studien mit ratiometrischemFRET-Sonden erfordern keine dual-Transfektion für die Transfektionseffizienz oder die Lebensfähigkeit der Zellen zu steuern. Ratiometrisch FRET – Sonden sind relativ unempfindlich gegen Transfektionseffizienz wenn sie über eine Mindestschwelle (Konzentration unempfindlich) 23,25 ausgedrückt. Sie sind unempfindlich gegen Anregungsquelle Schwankungen und anderen intrazellulärer Umgebungsfaktoren (z. B. pH, Ionen) so lange beide Fluorophore ähnlich reagieren. Darüber hinaus ist ihre Reaktion nicht unter Transkriptions Verzögerung, im Gegensatz zu Leuchtstofflampen und Biolumineszenz – Promotor-Reporter – Konstrukte 26,27.

Ratiometrisch FRET-Sonden sind leicht und häufig in herkömmlichen Weitfeld- Epifluoreszenzmikroskope Systemen eingesetzt. Weitfeld-Mikroskope sind über die Leitung konfokalen Systeme für Live Cell Imaging bevorzugt aufgrund von Bedenken über die Systemkosten, Fluorophore Bleichen und Erfassung von Signaländerungen mit ausreichender zeitlicher Auflösung. Darüber hinaus einzelne Zelle anallyse über eine große Population von Zellen ist mit einer motorisierten Stufe und Bilderfassung über mehrere Sichtfelder. Weitfeldmikroskopie erfordert Intensität basierte Analyse der Hetero-FRET-Sonde Signale. Obwohl Intensitätsanalyse nicht komplex erfordert Hardware wie andere FRET Methoden, mehr nach dem Erwerb Arbeit ist erforderlich , 28 für die Effekte von Fluorophor Verhaltensweisen und Mikroskop / Imaging – System – Konfigurationen zu korrigieren. Die erfassten Emissionsintensität eines Fluorophors ist eine Funktion der Anregungsenergie, Fluorophor Quantenausbeute und die kombinierte Filter- und Kamera / Detektor spektrale Empfindlichkeit und Linearität 2. Diese können für unterschiedliche Donor und Akzeptor und Kalibrierung für quantitative Analyse erfordert. Zusätzlich Abbildung der Akzeptor – Emission wird durch die spektrale Überlappung der Fluorophore (Anregung des Akzeptors durch Geberanregungslicht und Durchbluten von Donoremission in die Akzeptor – Emissionsspektren) 2 beeinflusst.4; Einzelketten "-Sonden sind intern normalisiert , weil ihre Fluorophore auf der Nanoskala äquimolare sind, während die Fluorophore von" Dual-Kette "Sonden an verschiedenen Stöchiometrien während einer Zelle 25,28 existieren kann , wenn die Fluorophore." Single-chain " Sonden sind von ähnlicher Helligkeit (Funktion des Extinktionskoeffizienten und Quantenausbeute) wird die Auswirkungen der nichtlinearen Detektorempfindlichkeit sind klein und nur Korrektur für die Hintergrundfluoreszenz und die gekoppelte Quantenausbeute / Detektorempfindlichkeit 23 benötigt. Somit "single-chain" ratiometrisch FRET – Sonden werden am einfachsten in der Weitfeldmikroskopie 24 umgesetzt.

Dieses Dokument beschreibt eine einfache Technik FRET Abbilden von lebenden Zellen in 3D Hydrogels Kulturen führen eine konventionelle Weitfeld Epifluoreszenz-Mikroskop. Es kann von Laboratorien leicht angenommen werden bereits FRET-Experimente in 2D als auch Labors interessiert sich unter Durchführungzelluläre Signal in microtissues. Hier zeigen wir die Methode mit FRET-Bildgebung auf Basis Messung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) Ebenen in lebenden Chondrozyten innerhalb Photo (PC-Gel, Polyethylenglykoldimethacrylat) und thermoresponsiven (TR-Gel, Matrigel) Hydrogele. A ratiometrisch FRET-Sonde basiert auf EPAC1 (ICUE1) verwendet, um die cAMP-Spiegel in Reaktion auf Forskolin, einem chemischen Agonist für Adenylylcyclase detektieren, die die Umwandlung von ATP zu cAMP katalysiert. cAMP ist eine der Haupt second messengers vermittelnde G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signal und verschiedene Faktoren aktiviert, einschließlich der nachgeschalteten Wechsel Proteine ​​direkt aktiviert durch cAMP (EPACs). Die Fluorophore auseinander bewegen, auf cAMP an das EPAC-Bindungsdomäne zu einer Verringerung des FRET führt. Beschrieben ist hier die Herstellung der Hydrogel-Materialien, Zell Transfektion mit dem ICUE1 Sonde, und Einbetten der Zellen in 3D-Hydrogele. Das 3D-FRET-Experiment Verfahren und die Bildanalyse notwendigSonde Aktivität pro Zelle zu bewerten sind, erläutert. Wir diskutieren auch die inhärenten Grenzen der FRET-Analyse in 2D und 3D mit Weitfeldmikroskopie. Die hier vorgestellte Technik ist eine Verbesserung gegenüber den bestehenden 2D-Verfahren, da sie eine Analyse in einer physiologischen Kontext ermöglicht und erfordert weniger Bildkorrektur und Kalibrierung. Große Nützlichkeit liegt in der Tatsache, dass viele transparente Materialien verwendet werden können, während die Zelle und Transfektion Präferenzen aufrechterhalten werden kann.

Protocol

1. Materialien Vorbereitung Bereiten Polyethylenglykoldimethacrylat (PEGDM, 4000 mw) durch Methacrylierung Polyethylenglycol nach Verfahren , beschrieben von Lin-Gibson et al. 29. Alternativ kann PEGDM erworben werden. Synthetisieren den Photoinitiator, Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), durch einen zweistufigen Prozess, bei dem erste dimethyl phenylphosphonit mit 2,4,6-trimethylbenzoyl Chlorid über eine Michaelis-Arbuzov-Reaktion und dann das Lithiumsalz umgesetzt wird, durch Zugabe von Lithiumbromid in 2-Butanon, gemäß Majima et al geschaffen. 30. Hinweis: Alternativ können andere Photoinitiatoren gekauft werden , aber LAP zeigt eine bessere Biokompatibilität und Vernetzungseffizienz 31. Funktionalisieren die Deckgläser Bindung des Hydrogels an das Glas zu ermöglichen und dadurch eine Bewegung während der Bildgebung. In einer chemischen Haube mit der richtigen Schutzausrüstung anlegen, verwenden3- (Trimethoxysilyl) propyl – methacrylat gemäß dem Protokoll des Herstellers für PC-Gelen und Epoxysilane (3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan) für TR-Gele 31. Hinweis: Alternativ können vorbeschichtete Folien erworben werden. Beachten Sie, dass das Deckglas muss größer sein als die Vertiefung der PDMS-Schale in Schritt 3.8. 2. Zelltransfektion In einer Gewebekultur Kapuze und mit sterilen Techniken, Tauwetter und die Platte die gewünschten Zellen in Unter Konfluenz (50-70%), hier Rinder-Chondrozyten bei 15.000 Zellen / cm 2 in 6-Well nicht behandelten Kulturschalen. Hinweis: Jeder relevante Zelltyp verwendet werden können, einschließlich der Verankerung unabhängige Zellen. Erlauben Zellen einen Tag lang in einem Inkubator bei 37 ° C zu gewinnen. Vor weiteren Schritten entfernen Medium, Spülen mit PBS und 2 ml Phenol- und Serum-freiem Medium pro Vertiefung. Am nächsten Tag für jede Vertiefung werden 100 ul Phenol- und Serum-freiem Medium sowie 3ul Transfektionsreagenz zu einem autoklavierten Glas Reagenzglas. Zum Mischen, leicht schütteln den Schlauch. 5 min bei RT inkubiert. Begrenzen Sie jede Belichtung. 1 & mgr; g FRET Sonden-DNA und leicht schütteln. Inkubieren der Mischung bei RT und lichtgeschützt für 30 min. Hinweis: In diesem Experiment ICUE1 Plasmid ( mit freundlicher Genehmigung von Dr. Jin Zhang 33) verwendet wurde. Die Fluorophore in ICUE1 sind cyan fluoreszierendes Protein (GFP, Donor) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP, Akzeptor). Das Verhältnis von Transfektionsreagenz DNA Plasmid wird für eine optimale Transfektion verschiedener Zelltypen angepasst werden müssen. Verteilen das hergestellte Gemisch (~ 104 & mgr; l) zu jeder der 6 Vertiefungen wise Drop-Zellen plus 2 ml Phenol- und serumfreies Medium enthält. Nicht pipettieren nach oben und unten. Vorsichtig schwenken die Platte zu mischen. für 48 Stunden bei 37 ° C inkubieren. Hinweis: Konfluenz hemmt Transfektionseffizienz und verändert endogene Expression von Rezeptoren. 3. Herstellung vonPDMS Formen für Hydrogele Casting und Kultur Zur Herstellung eines großen Glasträger das Polydimethylsiloxan (PDMS) auf, reinigen Sie das Glas zunächst mit Seife gründlich mit viel Wasser, und dann trocken mit Isopropanol, gefolgt von Luft zu werfen. Behandeln Sie das Glas mit einem Silizierverfahren Reagens laut Protokoll des Herstellers, so dass die PDMS leicht abgeschält nach dem Aushärten werden kann. Spülen Rest Reagenz von der Oberfläche mit Toluol über einen Auffangbehälter. Lassen Sie die Boden-Luft vollständig trocknen, bevor oder verwenden Wärme bei 100 ° C, um die Wartezeit zu verkürzen. Wählen eines Hydrogels Höhe (beispielsweise 1 mm) und berechnen das 1,2 – fache des Volumens der PDMS benötigt , um den Glasobjektträger mit PDMS dieser Dicke mit den Abmessungen des Glasobjektträger und Hydrogel Höhe zu bedecken. Hinweis: PDMS nicht schrumpft. Mischen Sie die PDMS-Kit-Komponenten in einem 10: 1-Gewichtsverhältnis in einem Becher. Sobald es gut gemischt wird, das Becherglas unter Hausvakuum entgast. RelIEVE das Vakuum, wenn Blasen um den Behälter zu überfluten und zu wiederholen beginnen. Anmerkung: Andere Hydrogel Dicken verwendet werden können, jedoch auf Kosten einer erhöhten Hintergrund und erhöhte Opazität wenn Zentrifugation (Schritt 6.2) wird nicht verwendet. Wickeln Aluminiumfolie um die Basis und die Seiten des Glas die PDMS enthält. Gießen Sie die gewünschte Menge an entgastem PDMS auf dieses Glas mit Folie umgeben. Messen Sie die PDMS-Höhe. Beachten Sie, dass die Höhe der PDMS wird die maximale Höhe des Hydrogels sein. Wenn irgendwelche Blasen entstehen, wenn Gießen, entgasen wieder oder sie mit einem Spatel oder Nadel Pop. Legen Sie die nicht ausgehärteten PDMS auf einer ebenen Fläche in einem Ofen bei 100 ° C für 2 Stunden, oder lassen bei RT für 24 Stunden. Entfernen Sie vorsichtig die PDMS von der Oberfläche, wenn es ausgehärtet ist. Punch – Out die gewünschte Form (zB zylindrische Stempel von 3 mm) für die Hydrogele. Hinweis: Die Photovernetzung ergeben wird etwas schmaler PC-Gel-Zylinder als Form Durchmesser durchzu Quenchen der Reaktion mit molekularem Sauerstoff in den PDMS. Sterilisieren der gestanzten PDMS. Für Kurzzeitversuche, unterzutauchen PDMS in 70% Ethanol für 1 Stunde. Montieren Sie die Form durch Einsetzen der Basis der sterilisierten PDMS mit einem sterilen Deckglas mit einer Dicke von zum Mikroskopobjektiv Korrektur abgestimmt. Nehmen Sie sich für die Verwendung in Schritt 6. Fabrizieren eine größere PDMS Schale mit den oben genannten Methoden (mit einem gut breiter und höher als das Hydrogel), um das Hydrogel und Medium zu enthalten. Platz für mindestens 10-fach mehr als das Hydrogel, das Hydrogel und zu minimieren Verdünnung des Analyten eine mittlere Volumen einzutauchen. 4. Herstellung von Hydrogel Precursorlösungen In einer Gewebekultur Haube und sterile Techniken, bereiten die Hydrogel-Vorläuferlösungen geeignet für die Untersuchung unmittelbar vor Zellen hinzufügen. Bereiten PC-Gel aus dem Vorläuferpolymer wie folgt. Mischungs PEGDM Pulver in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,2) bei 10% (w / v). Hinzufügen , den Photoinitiator (zB LAP) in einer Endkonzentration von 0,005-0,01% (w / v) und Mischen durch Pipettieren. Decken Sie die Lösung mit Aluminiumfolie oder Abschirmung von Licht als LAP Licht empfindlich ist. Anmerkung: Hier wird das TR-Gel reduzierte Wachstumsfaktor der extrazellulären Matrix verwendet wird, wie vom Hersteller geliefert. 5. Zellsuspension in Hydrogel-Lösungen In einer Gewebekultur Haube und sterile Techniken, aspirieren das Medium aus den Vertiefungen. In PBS in die Vertiefungen und entfernen Sie dann gründlich befestigt Zellmonolayern spülen. Dissoziieren die Zellen von dem Kultursubstrat 2 bis 3 ml pro 25 cm 2 der Zelldissoziationslösung verwenden. Schaukeln sanft, dann bei 37 ° C für 10 – 20 min oder bis distanzierte. Fest Schale klopfen, wenn nötig Zellen zu entfernen. Hinweis: Alternative Zelldissoziationsmedium Lösungen mit Auswahl verfügbar sind auf diejenigen beschränkt, die dies nicht tun imit Folgen den Signalweg unter Analyse von Rezeptoren von Interesse zu spalten. Nachdem die Zellen abgelöst werden, fügen Sie 2 ml Phenol- und Serum-freien Medium, um die Zellen unterbrechen, und zählen Zellen mit einem Hämozytometer. Anmerkung: Chemisch definierte serumfreie Medium (zB ergänzt mit Insulin, Transferrin und Selen) können ebenfalls verwendet werden. Aliquotieren die gewünschte Anzahl von Zellen auf der Basis des Zelltyps in sterile Fläschchen und Pellet (beispielsweise 2,0 x 10 6 Zellen pro Röhrchen). Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie das gewünschte Volumen an Hydrogel-Vorläufer und suspendieren die Zellen durch Pipettieren. Verwenden , um ein Volumen des Vorläufers , die 2 x 10 5 Zellen / cm 2 in der xy – Ebene ergeben, wenn die z-Achse des Hydrogels Visualisierung als kollabierte (zB 1,0 ml pro Fläschchen für eine 1 mm dicke Hydrogel , das 2 x 10 6 Zellen / ml). Achten Sie darauf, keine Blasen zu erzeugen. Bewegen sich schnell auf den nächsten Schritt auf negative Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen 34 begrenzen </ Sup>. 6. Hydrogelpräparat In einer Kultur , Kapuze Gewebe und sterile Techniken verwenden, fügen Sie die Zellen enthaltende Hydrogel – Vorläufer zu den Gießformen in Stufe 3 ( zum Beispiel 7,1 & mgr; l pro 3 mm Durchmesser x 1 mm hohe Form). Schaffen eine zusätzliche Hydrogels nach den gleichen Methoden beschrieben, für Mikroskop-Abbildungssystemkalibrierung zu verwenden und Sondeneichung (wenn die inhärente Sonde Effizienz unbekannt ist). Zentrifuge die hergestellte zellhaltigen Hydrogel – Vorläufer vor der Gelierung / Vernetzung Bildgebung zu optimieren , indem Zellen zu einer einzigen Brennebene und zur Minimierung von Signalebene (Figur 1) begrenzen. Einstellen Zentrifugationszeit und Kraft auf den Zelltyp und der Viskosität des Vorläufers (400 g für 4 min). Gel oder vernetzen die Lösung Für die PC-Gel-Hydrogel, bestrahlen die zellhaltige Vorstufe mit einem UV-A-Lichtquelle (λ = 365 nm) für eine Belichtungszeit gleich3,2 J / cm 2 pro Millimeter Dicke zu photovernetzen. Hinweis: Verwenden Sie eine 1 mm Mindeststärke in die Berechnung ein. Exposures sollte in der 1-5 min Bereich fallen. Verwenden Sie die minimale Belichtungszeit. Vermeiden Sie Über Bestrahlung der Zellen, da diese Lebensfähigkeit verringern wird und der GFP Spender bleichen. Allerdings Belichtungszeiten von weniger als 60 s sind nicht zu empfehlen, da hohe Intensität der Bestrahlung zu einer radikalen Selbstlöschung und schlechte Lebensfähigkeit der Zellen führt. Für die TR-Gel Hydrogel, legen Sie die gefüllte Form in einer Petrischale und in einen Inkubator thermisch zu gelieren bewegen. für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Nach dem Gelieren oder das Hydrogel Vernetzung, entfernen Sie das Gießen PDMS Hydrogel Form und ersetzen Sie es mit dem hergestellten größeren PDMS Schale (aus Schritt 3.5). Drücken Sie die PDMS nach unten auf das Glas mit einem sterilen Spatel daran zu halten. Platzieren dieses PDMS-Schale mit Deckglas in einen sterilen Behälter, wie beispielsweise einer Petrischale. In phenolfreien Serum-freiem Medium oder mir chemisch definiertdium zum Brunnen erstellt mit der PDMS-Schale und Deckglas (freies Serum-Medium mit Insulin, Transferrin und Selen (Schritt 5.4) ergänzt) getaucht, um das Hydrogel zu halten. für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Hinweis: Wenn ein spezialisiertes Gericht mit einem Deckglas verwenden, dann, dass das Deckglas legen und ähnlich Medium hinzuzufügen. Alternativ führen Sie den Tag ist dieser Schritt vor FRET-Bildgebung die Sonden zu ermöglichen, sich zu erholen, da die Bestrahlung mit Wellenlängen der GFP Donoranregung Spektrum überlappen. 7. 3D-FRET-Imaging Entfernen Sie die PDMS – Schale mit dem Hydrogel aus der Petrischale, hergestellt in Schritt 6.4, und sichern Sie sie in einem einstellbaren Probenhalter für die XY – Mikroskoptisch (Abbildung 2). Positionieren Sie den Probenhalter auf dem Mikroskoptisch. Öl auf dem Ziel, wenn erforderlich. Verwenden Sie ein Ziel von mindestens 40 – fach und der hohen numerischen Apertur (NA) (dh 1,3 NA) die relativ schwache Fluorophor zu erfassene-Emissionen. Konfigurieren Sie die Sichtfelder (FOVs) für die Bildaufnahme: Markieren Sie die Zellen für die Bildgebung Durchlicht-Bildgebung und Überprüfung der Transfektion mit Fluoreszenz-Bildgebung. Wählen Sie mindestens 15 verschiedenen Zellen. Markieren Sie die Zellen, die weder zu hell noch zu dunkel sind (die sonst Sonde Übersättigung oder niedrige Empfindlichkeit führen könnte) und mit dem FRET-Verhältnis zwischen 0,0 und 1,0 (was sonst Beschädigung oder Verfall der binären Sonde anzeigt). Schalten Sie dann erst das Licht um die Belichtung zu begrenzen. Wählen Sie FOVs der Nähe des Zentrums des Hydrogels und mit den Zellen von Interesse innerhalb der relativ flachen Beleuchtungsfeld (siehe Abbildung 3B und Schritt 9.2 unten). Konfigurieren Sie die Kameraeinstellungen für die FRET Bildkanäle. Wählen Sie aus wenigen Zellen in der Nähe der Mitte des FOV die "optische Konfigurationen zu optimieren " (dh., Belichtung und Verstärkung pro Bildkanal). Hinweis: Die Nomenklatur unten variiert depending auf der Software verwendet, um das Mikroskop und die Kamera zu betreiben. Die Mikroskop-Software, NIS-Elements wird hier für die Bilderfassung und Analyse verwendet. Für FRET-Analyse von Einzelketten-Sonden, wählen Sie zwei Bildkanäle pro FOV: Vergütet Emission (QE), die die Donoremission unter Donoranregung und Akzeptor-Emission unter Anregung des Acceptors (AEM). Hinweis: Für die ICUE1 CFP-YFP-Sonde, ein CFP Anregungs- und Emissionsfilterpaar für QE (418-442 ab, 458-482 em) und einem YFP Anregungs- und Emissionspaar für Aem (490-510 ex, 520-550 em) werden verwendet. Stellen Sie die Belichtung für QE und Aem die maximale Signalintensität ohne Sättigung zu erwerben (und bei Verwendung einer CCD, mit dem minimal möglichen Gewinn) zu Hintergrundrauschen zu minimieren. Halten Sie die optische Konfigurationen die gleiche für beide Fluorophore und während des gesamten Experiments sowie unter experimentellen Gruppen zu vermeiden , dass die Ergebnisse Vorspannen (dh Anregungsleistung, Iris Größe, Belichtung und Kameraverstärkung) (Abbure 3A). Erwerben Sie zusätzliche Kanäle für weitere Analysemöglichkeiten nach dem Erwerb (zB korrigiert sensibilisierte Emission (CSE) Bildgebung (siehe Diskussion)) zu ermöglichen. Für die ICUE1 CFP-YFP – Sonde, erwerben die Anregung (Ex) und Emission (Em) Kanäle von Ex Spender – Em Spender (QE, wählen GFP-GFP in der Mikroskop – Software), Ex Spender – Em – Akzeptor (SE, wählen Sie CFP- YFP), Ex – Akzeptor – Em – Akzeptor (AEM, wählen YFP-YFP) und Akzeptor Ex – Em Spender (YFP-GFP) Konfigurationen (siehe 3A). Konfigurieren Sie die Erfassungsrate für Zeitraffer-Bildaufnahme. Verringern Sie die Aufnahmerate durch die Hardware begrenzt, wenn. Für kurzfristige Assays (zB 30 – 60 min), bezeichnen rund 12 Akquisitionen pro Minute für jeden FOV (5 sec Abtastrate) zur Signalisierung Kinetik erfassen. Verwenden Sie die minimale Abtastrate signi notwendig zu vermeidennifikant Photobleaching der Sonde. Stellen Sie die Erfassungsrate durch die Periodizität der Aufnahmen in der Mikroskop-Software eingeben. Für die Langzeittests (z. B. 24 h), mit der hohen Erfassungsrate beginnen , um die anfängliche Impulsantwort zu erfassen und dann auf eine niedrige Erfassungsrate wechseln, beispielsweise alle 5 bis 10 Minuten. Wählen Sie "Jetzt ausführen" in der Mikroskop-Software Bildaufnahme und die Aufnahmen für 5 min zu initiieren eine Basis für die Probe-Antwort an den dafür vorgesehenen FOVs zu etablieren. Nach 5 min der Bildaufnahme, pipettieren in der gewünschten Agonisten oder Antagonisten Analyten (zB Forskolin bei 100 nM), mischen durch Pipettieren und Abbildungs ​​fortzusetzen. 8. FRET-Kalibrierung Systemkalibrierung: Verwenden Sie die zusätzliche Kalibrierung Hydrogel, hergestellt, wie in Schritt 6 beschrieben, Aem Bilder von mindestens 6 repräsentative Zellen unter Verwendung der gleichen FOV Kriterien, optische Konfigurationen und Kamera-Set zu erwerbenlungen verwendet für FRET-Bildgebung oben (Schritte 7.1, 7.2 und 7.3). Anmerkung: Die Quantifizierung der Quantenausbeute und der spektralen Empfindlichkeit (QS) für die kombinierte Sonde und Mikroskop-Abbildungssystem ist für "absolute" benötigt Analyse FRET aber nicht für "relative" FRET. Photobleach das Akzeptor-Fluorophor eine 5 min lange Exposition gegenüber dem Anregungslicht bei voller Intensität (Anregung auf Aem Kanal) durch die Auswahl. Verwenden Sie eine schmale Öffnung nur die Zellen von Interesse zu bleichen. Stellen Sie sicher, dass das Aem Signal um mindestens 10% niedriger ist als das ursprüngliche Signal ist die Signalintensität Histogramm durch einen Vergleich ( "LUT" Fenster) vor und nach Photobleaching. Weiter Photobleaching, wenn Signalverlust von weniger als 90% beträgt. Hinweis: Sicherstellen, dass der Donor-Fluorophor bei diesem Vorgang nicht durch die Verwendung Aem Anregungsfilter gebleicht wird, die mit dem Spenderanregungsspektrum nicht überlappen. Erwerben Sie Donoremission unter Donoranregung mit dem nun gebleichten Akzeptor-Fluorophor (dem) unsing die gleiche optische Konfiguration, wie sie für QE in Schritt 7.3. Berechnen QS pro Pixel als Dem dividiert durch Aem nach Hintergrundkorrektur, wie in Abschnitt 9 unten. QS = Dem / Aem Berechnen der durchschnittlichen QS zwischen den Zellen aus den Zellmittelwerte. Schätzung der inhärenten FRET-Effizienz der Sonde (Ei) unter Verwendung der Kalibrierungsprobe. Induce maximale FRET der Sonde und berechnen Ei = 1 – QE / (AEM x QS), wie in Abschnitt 9 unten. Alternativ können Sie Ei = CSE / Aem oder Ei für FRET-Effizienz eines herkömmlichen Endpunkt-Assays berechnet mit Ei = 1 – (QE / Dem). Anmerkung: Ei wird benötigt , um die absolute Anteil an Aktivsonden (FAP, das heißt Fraktion von Sonden – Bindungs ​​Analyt), aber nicht notwendig für die "relative" FRET – Analyse zu quantifizieren. Sättigen Probe-Antwort durch die Kultur mit einem Agonisten des Analyten Produktion / Aktivierung für Sonden stimulieren, die mit dem Analyten bei Wechselwirkung in FRET erhöhen. Hemmen Sonde Zusan mit dem Analyten einen Antagonisten der Signalgebung für Sonden, die bei der Bindung des Analyten in FRET verringern. Anmerkung: In dem Fall der ICUE1 Sonde unterdrücken cAMP-Spiegel mit einer Adenylcyclase-Inhibitoren, wie 2 ', 5'-didesoxyadenosin (spezifischen) oder 3-isobutyl-methyl-xanthin (unspezifisch). 9. FRET Verhältnisberechnung Zeichnen und eine Region of Interest (ROI) pro FOV in der Nähe der Zellen bezeichnen die Hintergrundebene (3B) in jedem FOV im Laufe der Zeit zu definieren, aber den ROI auf den Bereich der relativ homogenen Ausleuchtung über die Mitte des Bildes (4A beschränken ). Siehe die Diskussion um eine Erklärung von Grundkorrektur-Optionen. Mit dem Mikroskop-Software: Wählen Sie den Pfeil auf dem "Hintergrund ROI-Symbol" und wählen Sie "Elliptical Hintergrund ROI Draw" (andere Formen funktionieren). Stellen Sie sicher, dass "Keep Hintergrund aktualisiert Offset" ausgewählt ist. aktivieren Sie vieFlügel des Hintergrund ROI durch den Hintergrund ROI-Symbol klicken. Alternativ können Sie die "ROI-Symbol" und die ROI Eigenschaften wie "Einsatz als Hintergrund ROI" und "ROIs in jedem Mehr unterschiedlich sind". Mit ImageJ: Verwenden Sie die Symbolleiste, um den Kreiszeichenwerkzeug auswählen. Dann fügen Sie die Form mit dem ROI-Manager über das Menü "Analysieren → Extras → ROI-Manager". Legen Sie eine andere Farbe für den Hintergrund ROI in der ROI-Manager, falls gewünscht. Für jeden FOV und Bildkanal (zB QE und AEM), subtrahieren den Mittelwert im Hintergrund ROI pro Zeitpunkt ein korrigiertes Bild pro Kanal zu schaffen, zum Beispiel SQe t, p = QE t, p – BQE t, p wobei t die Erfassungszeit ist, p die FOV (dh xy – Position) und BQE und Baem sind die skalaren Werte des Signals im Hintergrund ROI. Verwenden Sie die Bild arithmetischen Funktionen in der Software zur Verfügung. Wit dem Mikroskop-Software und nutzen die "ROI Hintergrund Symbol" und wählen Sie "subtrahieren Hintergrund ROI verwenden". Im Pop-up-Fenster, wählen Sie "Jedes Bild" unter "subtrahieren Hintergrund ROI" und wählen Sie "Alle Frames" unter "Anwendung auf". Hinweis: Ein Hintergrund ROI muss in jedem FOV für diese Funktion definiert werden , um richtig zu arbeiten ( zum Beispiel wird die Funktion nicht richtig mit Hintergrund ROIs Hintergründe für FOV subtrahieren , wenn einige FOV undefinierten Hintergrund ROIs haben.). Mit ImageJ und nutzen die "BG Subtraction von ROI" Makro geschrieben von Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/). Speichern Sie die korrigierte Zeit Reihe von Bildern von "Speichern unter" für die folgenden Analyseschritte auswählen. Definieren eines ROI um die Zelle eine binäre Maske für jede Zelle unter Analyse in jedem FOV (4B) verwendet wird . Verwenden Sie den Aem Kanal Schwelle das Bild pro FOV zu Beginn of das Experiment, identifizieren die Zellgrenzen und die ROIs definiert. Speichern Sie die ROIs. Mit dem Mikroskop – Software: Für jeden Rahmen (dh FOV), verwenden Sie zunächst das Menü "Binary → Schwellenwert definieren" und wählen Sie " In den aktuellen Rahmen anwenden". Stellen Sie den unteren Schwellenwert der Zellen auszuwählen. Dann nutzen Sie die "Binary → Schließen" -Funktion in Löcher in der binären Maske zu füllen, wenn nötig. Verwenden Sie anschließend den ROI Symbol "Copy Binary zu ROI" zu wählen; die binäre Schicht wird automatisch gelöscht. Anfügen ROIs für nachfolgende Rahmen des bestehenden Pool von ROIs. Löschen Sie alle unechten ROIs. "Rechtsklick auf" Weiter auf der ROIs und stellen Sie sicher, ihre Eigenschaften sind "Verwendung als Standard-ROI" und "ROIs sind unterschiedlich in den einzelnen Mehr". Mit ImageJ: Für jeden FOV, verwenden Sie zunächst das Menü "Bild → → Threshold Adjust". Verwenden Sie dann "Analysieren → Analysieren Partikel" mit Show-Outlines und In den Verwalters ausgewählt. Benutzen"Binary → Close" in "Löcher" in der binären Maske zu füllen, wenn nötig. Löschen unechten ROIs. Kostenlose Plugins sind verfügbar, um diesen Prozess zu automatisieren. Berechnen Sie die QE basierten FRET – Verhältnis bei jedem Pixel, SQE / Saem für relative Analyse (siehe Schritt 10) und E QE = SQe / (QS x Saem) für absolute Analyse (siehe Schritt 10) mit QS , erhalten in Schritt 8.1. Verwenden Sie Gleitkomma-Division der Bilder. Siehe die Diskussion Abschnitt für eine Erklärung der Verhältnis Ableitungen. Mit dem Mikroskop-Software: Verwenden Sie das Menü "Bild → Bildoperationen" und wählen Sie "Floating Point". Mit ImageJ: Verwenden Sie entweder den "Prozess → Bild Rechner" -Funktion oder die "Calculator_Plus.java" Plugin. Hinweis: Alternativ kann das Makro "pH_ratioMacro" .txt "angepasst werden, um die FRET-Verhältnisse zu berechnen Es verwendet die Hintergrundkorrektur Makro oben beschrieben und ist abrufbar unter. Exportieren Sie das durchschnittliche Verhältnis pro Zelle (dh pro ROI) in eine Tabelle und Grafik – Software. Mit dem Mikroskop-Software: Verwenden Sie entweder die ND Export-Button in der "ROI Statistics" Analyse-Steuerung oder der "Tabelle exportieren" in der "Time Analysis" Analyse Kontrolle. Mit ImageJ: Zuerst wählen Sie das Menü "Analysieren → Stellen Messungen" und stellen Sie sicher, "Mittelwert" und "Standardabweichung" ausgewählt werden. Dann nutzen Sie die ROI-Manager und wählen Sie die Schaltfläche "Messen". Speichern Sie die generierten Ergebnisse Fenster. 10. FRET Ratio-Analyse Berechnen Sie die durchschnittliche zelluläre FRET-Verhältnis im Laufe der Zeit von den durchschnittlichen Verhältnissen pro Zelle (exportiert in Schritt 9.4). Betrachten Sie die Baseline-Verhältnisse FRET (das Verhältnis vor den Analyten Verabreichung) bei dieser Berechnung. Hinweis: Kalkulationstabelle und Grafik-Software wird hier verwendet, um die zu plotten Baseline-subtrdurchschnittliche FRET – Verhältnisse und deren Standardfehler des Mittelwerts beaufschlagt (SEM) einer linearen Regression auf der Basislinie , wie in Schritt 10.1.2 und 10.1.3 unten (Figuren 5 und 6) verwendet wird . Relative Analysis (Größe der Antwort): Normalisieren jede Kurve auf einen gemeinsamen Referenzprobe (zB unbehandelten Probe.). Absolute-Analyse (Zeitverlauf der Reaktion): Verschieben Sie die Kurven mit einem gemeinsamen Startpunkt, indem jede Kurve mit ihren Ausgangs Verhältnis normalisieren FRET. In der Tabelle und Grafik-Software, die Daten (Spalten der durchschnittlichen Verhältnisse pro Zelle) verschachteln mit neuen Spalten, so dass jede ursprüngliche Spalte mit einer neuen Spalte gepaart ist nur Verhältnisdaten für die Basisperiode enthält (Verhältnisse vor Analyten hinzugefügt). Wählen Sie "Spalte einfügen", um eine leere Spalte nach jeder Datenspalte einfügen. Kopieren Sie dann die Basisdaten in den paarigen leere Spalten. In der Tabelle und Grafik-Software, wählen Sie "Einfügen → Neue Analyse → TransfoEntfernen Sie rm Baseline "und dann" Ausgewählte Spalte "bis" alle anderen ", wählen Sie" übernehmen die Basislinie linear ist ", und wählen Sie" Difference "unter" Berechnung ". Berechnen Sie die durchschnittliche zelluläre Verhältnis und deskriptive Statistik. In der Tabelle und Grafik-Software, wählen Sie "Einfügen → Neue Analyse → XY Analysen → Reihenmittel mit SD- oder SEM" und wählen Sie dann "Row bedeutet, mit SEM" im Pop-up-Fenster.

Representative Results

Alle Hydrogel-Vorläufer, Zellen und Gießformen wurden hergestellt, wie oben beschrieben. Die Zellbeladenen Vorläuferlösungen wurden in PDMS Formen gegossen und dann vor dem Gelieren zentrifugiert / Photozellen in der Nähe des Deckglases zu immobilisieren und zu erleichtern FRET Bildgebungsanalyse (Abbildung 1). Die Hydrogele mit angebrachtem Deckgläser wurden in vorbereitete PDMS Bildgebungs Vertiefungen für mikroskopische Abbildung (Abbildung 2) angeordnet ist . Die optischen Konfigurationen und Bildaufnahmeparameter wurden dann eingestellt , wie in 3A gezeigt. Erfassung aller vier FRET im Zusammenhang mit Bildkanäle für CFP-YFP Fluorophor – Paare (siehe unter "Optical Conf." In Abbildung 3) gezeigt, wie für nicht-binäre Sonden benötigt wird. Doch in dieser Arbeit nur zwei Bilder für die einzelnen Kette binären ICUE1 Sonde, QE = "CFP CFP" und AEM = "YFP YFP" (Anregung Emission) erforderlich. Mehrere FOVs (xy-Positions) wurden ausgewählt , in denen mehrere Zellen innerhalb der homogenen Beleuchtungsbereich residiert (3B). Nach Zeitraffer Akquisition wurde die Signaldaten für die Sonde exportiert. ROIs für die Hintergrundkorrektur von Kanalsignalen und für die Zellanalyse wurden unter Verwendung gethresholdeten Aem Bilder von Beginn der Experimente (Abbildung 4) bezeichnet. Die Zellen wurden aus den Reihen der Zellpool als diejenigen ausgewählt ausdrücken ausreichend (nicht zu dunkel), aber nicht zu hoch (zu hell) Sonde (4B). Die QE und SE FRET Verhältnisse pro Pixel bei jeder Akquisition wurden berechnet Gleitkommadivisionsschaltung der Hintergrund subtrahiert Bildkanäle. Die durchschnittliche FRET – Verhältnis pro Zelle (dh pro ROI) berechnet wurde, normiert auf das Basissignal vor der Stimulation (dh eine Regression auf der Basislinie von allen Zeitpunkten subtrahiert) und aufgetragen mit Fehlerbalken als Standardfehler des Mittelwert (SEM). Sowohl die QE und CSE basierte FRET-Verhältnisse deZum Schutz des erhöhten cAMP – Aktivität in Chondrozyten unter Forskolin – Stimulation (100 nM, Abbildung 5). Die QE FRET-Verhältnis war empfindlicher gegenüber Hintergrundkorrektur ist als das Verhältnis CSE FRET weil das QE-Signal aufgrund der niedrigen Grundniveau der cAMP-Aktivität geringer war innerhalb der Hydrogele in Chondrozyten eingebettet. Beide Hydrogel – Typen (TR-Gel und PC-Gel) zeigte einen Anstieg in FRET – Verhältnis über die Zeit (Abbildung 6), was auf eine erhöhte cAMP – Signalisierung Reaktion auf die Zugabe von Forskolin. Wie durch das QE FRET – Verhältnis angegeben, zeigen Chondrozyten in PC-Gel – Hydrogele eine größere Änderung in cAMP (gezeigt) und eine höhere Grundniveau von cAMP (E QE = 0,19 in PC-gel vs. E QE = 0,09 in TR-Gel, nicht in Basislinie subtrahiert Figur nicht gezeigt). Abbildung 1: Zellverteilung in photo Hydrogels (PC-Gel) </strong> A: Die Zelle beladene Hydrogel-Vorläufer wurde zentrifugiert, um die Anzahl von Zellen in einer Brennebene in der Nähe des Deckglases zu maximieren. B: Dies erhöht die Anzahl von Zellen in dem FOV und minimiert Signal Hintergrund von aus der Ebene Zellen. (Maßstabsbalken = 200 & mgr; m) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Hydrogele in PDMS Dish Das Hydrogel wurde in einem riesigen PDMS gut (10x Volumen von Hydrogel) mit einem Deck Basis für mikroskopische Bildgebung und Analyt Stimulation platziert. Die PC-Gel-Hydrogele sind transparent und auf dem Deckglas verbunden, so dass sie während des Tests an Ort und Stelle bleiben. Die PDMS kann auch größer gemacht werden, 10x Medium als das Hydrogel Volumen enthalten eine breitere Biopsie Punch zusätzlich zur Verwendung beihicker PDMS Blatt. (Maßstab = 2 mm) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Acquisition Konfiguration für FRET – Imaging A: alle 7 sec an mehreren Standorten Die Akquisition wurde für die Bilderfassung konfiguriert. Für QE FRET Verhältnis Berechnung werden nur zwei Bildkanäle für die ICUE1 verwendete Sonde benötigt hier (binär single chain-Sonde), QE = "CFP CFP" und AEM = "YFP YFP" (Anregung Emission) im Rahmen der "Optical Conf." Spalte in der λ-Registerkarte des Mikroskop-Software. B: FOVs ( "XY" Positionen) wurden ausgewählt, in denen mehrere Zellen innerhalb des homogenen Beleuchtungsbereich wohnhaft war. Das Grundstück unterhalb des Bildes zeigt die Beleuchtungsintensität entlang der blauen Linie arroweddass quert durch das Zentrum des FOV. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Auswahl von ROIs für FRET – Imaging – Analyse A: Eine Region von Interesse (ROI) frei von Zellen wurde für das Hintergrundsignal auf jedem Kanal zu korrigieren ausgewählt. Ein Bild eines zellfreien Hydrogel stattdessen für Hintergrundsubtraktion verwendet werden, wenn die Zelldichte oder Migration hoch ist, oder wenn eine Schattierungsmaske nicht verwendet wird, wenn die Zellen nicht in einer homogenen Beleuchtungsfeldes liegen. B: Die Zelle ROIs wurden ausgewählt, unter Verwendung von Bild Schwellwertbildung und binäre Maskierung des Aem Kanal. Auswählen eines ROI größer als die Zellen wird sich negativ auf die Berechnung des durchschnittlichen FRET-Verhältnis pro Zelle beeinflussen aufgrund des Einschlusses von extrazellulären Verhältnisse von Hintergrund n erzeugtoise. Die Berechnung des zellulären FRET Verhältnis der durchschnittlich pro Kanal pro Zelle wird nicht empfohlen, da dies das Verhältnis unterschätzt. (Maßstabsbalken = 50 & mgr; m) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5: Vergleich der FRET – Ratios in Thermoresponsive Hydrogels (TR-Gel) Sowohl QE und SE basierte FRET-Verhältnisse erfassen die erhöhte cAMP-Aktivität in Chondrozyten unter Forskolin-Stimulation. Forskolin ist ein Adenylzyklase-Agonist, der cAMP-Produktion induziert. FRET abnimmt , wenn die Sonde ICUE1 cAMP bindet und somit die QE FRET – Verhältnis (E = QE SQE / (Saem x QS)) zunimmt. Im Gegensatz dazu nimmt die SE FRET – Verhältnis und damit als E SE = 1 aufgetragen ist – CSE / Saem. In Hydrogel eingebettet Chondrozyten, die QE FRET-Verhältnis ist empfindlicher gegenüber Hintergrundkorrektur als das Verhältnis SE FRET, weil das QE-Signal aufgrund der niedrigen basalen cAMP-Aktivität niedrig ist. Die Fehlerbalken = SEM, n = 25. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 6: Vergleich der FRET – Verhältnis in verschiedenen Hydrogele Die Chondrozyten in beiden Typen Hydrogel reagierte auf Forskolin-Stimulation mit einer Zunahme der cAMP-Aktivität wie durch die erhöhte QE FRET-Verhältnis über die Zeit demonstriert. Die Hydrogel – Typ wirkt sich auf die zelluläre Antwort durch verschiedene Effekte, einschließlich der Unterschiede in der Permeabilität an Forskolin und in basalen zellulären cAMP – Aktivität (E QE = 0,19 in PC-gel vs. E QE = 0,09 in TR-Gel, nicht gezeigt). Die Fehlerbalken = SEM, n für TR-Gel= 25, n für PC-Gel = 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Diese Arbeit zeigt, wie FRET-Bildgebung verwendet werden können zelluläre Signal in 3D Hydrogele zu analysieren. Während frühere Studien FRET – Bildgebung von Zellen auf Substraten Hydrogels 35-37, von extrazellulären Wechselwirkungen mit Hydrogele 38 und von Molekülen gefangen in Hydrogelen 39-41, ist dies die erste Veröffentlichung FRET Bildgebung basierend intrazellulärem Analyse von Zellen ausgesät gezeigt haben innerhalb eingebettet zu beschreiben 3D Hydrogelen. Die Arbeit löst mehrere Probleme Implementierung bei FRET-Bildgebung von 2D auf 3D zu übersetzen. Zunächst werden mit hoher numerischer Apertur Ziele für FRET-Bildgebung benötigt eine ausreichende Emissionssignal zu sammeln, aber sie begrenzen die Tiefe des Feldes. Die hier Zellen dürfen leicht absetzen durch Zentrifugieren der Anzahl von Zellen in einer Brennebene in der Nähe der Glas dies zu kompensieren zu erhöhen. Zweitens 3D Hydrogels Gerüste während der Bildgebung über das Sichtfeld, die Analyse erschwert driften kann. Die Hydrogele sind hier an den cov gebundenerslip so daß sie bleiben während des gesamten Versuchs festgelegt. Drittens Auswahl geeigneter Hydrogelzusammensetzungen für 3D FRET ist wesentlich, weil Hydrogele Sichtbarmachung der Zellen behindern. Hier transparente Hydrogele von PC-Gel und TR-Gel verwendet. Jedoch Sammeln der Zellen mit Zentrifugation in eine Brennebene in der Nähe des Deckglas kann auf Bildzellen in Hydrogele mit einem höheren hängt diffraction.The Wahl des Hydrogels auf die Mikroumgebung Bedingungen verwendet werden , die simuliert werden müssen, was in einer Bewertung auf Hydrogelen zu finden sind 42 . Viertens ist eine alternative Berechnung hier für das FRET – Verhältnis der einzelnen Kette ICUE1 Sonde (dh E QE = QE / CAEM) verwendet , um die Anzahl der Bildkanäle für die Analyse zu minimieren und dadurch Photobleaching minimieren. Die durchschnittliche FRET-Verhältnis pro Zelle wird als Mittelwert der Verhältnisse pro Pixel in einer Zelle Unterschätzung des tatsächlichen FRET-Verhältnis zu minimieren, berechnet. Schließlich wird eine lineare ratiometrisch Analyse und MittelZur Berechnung der aktivierten Fraktion von einkettigen binären Sonden beschrieben.

Es gibt einige kritische Aspekte der erfolgreichen FRET Durchführung von Experimenten unter Verwendung von Weitfeldmikroskopie. In Bezug auf die Hardware, muss die Kamera empfindlich genug sein, kleine Signaländerungen zu lösen, so dass neuere wissenschaftliche CMOS-Kameras und Elektronenvervielfachungs CCDs besser geeignet als herkömmliche CCDs. Um am besten die räumliche Verteilung des FRET-Verhältnis zu analysieren, die Kamera auf mindestens besitzen muss zweimal die räumliche Auflösung der Punktbildfunktion des Objektivs (Nyquist-Kriterium). Dies macht Dual-View-Systeme weniger geeignet für die Aufgabe. Entscheidender ist es, eine angemessene Belichtung und Bildaufnahmerate für das gegebene FRET-Paar auszuwählen, um Photobleichens der Fluorophore zu minimieren. Eine verringerte Erfassungsrate wird als Versuchsdauer erhöht empfohlen. Die Verwendung von schnellen Filterräder erhöht Erfassungsrate und die Anzahl der FOVs zur Analyse während vermeidening die Bildregistrierung Probleme mit Dual-View und Revolver Filterwürfel. Die inhomogene Beleuchtungsfeld erschwert Korrektur für die Hintergrundfluoreszenz, die von der Probenautofluoreszenz und Kamerasystem Lärm entsteht. Einige Hydrogele, insbesondere solche kollagenen Proteine ​​enthalten , sind 43,44 hoch autofluoreszierenden. Die FRET-Verhältnisse werden ohne Hintergrundkorrektur unterschätzt. Hier beschäftigen wir einen einfachen Hintergrund – Korrekturverfahren, die auf dem relativ flachen Beleuchtungsfeld stützt , die oft mit Epi-Fluoreszenz – Beleuchtung über der Mitte des Bildes (3B, Schritt 7.2) konfiguriert werden können. Diese Methode schränkt daher Zellen von Interesse für die in diesem Beleuchtungsfeld. Die Hintergrundkorrektur hier beschrieben berücksichtigt nicht zelluläre Autofluoreszenz in den Wellenlängen für die binäre Sonde lesen. In einem solchen Fall unmarkierter Zellen (keine Sonde Transfektion) sollte subtrahiert unter den gleichen Bedingungen und Hintergrund abgebildet werden. A mix von markierten und unmarkierten Zellen können verwendet werden und die nicht markierten Zellen für den Hintergrund ROI ausgewählt. Alternative Methoden, die für die Zellanalyse über das gesamte Bildfeld liefern, schließen die Verwendung eines Abschattungsmaske, mehrere Hintergrund ROIs oder identische Proben ohne Zellen und ein Protokoll ist auf Anfrage erhältlich.

Spezifisch für 3D – FRET – Bildgebung ist Sondenantwort sehr empfindlich auf die Hydrogel – Durchlässigkeit für den Analyten (Abbildung 6). Daher sind die gleichen Hydrogels Regionen sind über experimentelle Behandlungen verglichen, vorzugsweise an einem Punkt, der Geometrie Symmetrie wie in der Nähe der Gerüstmitte wie hier verwendet. Alternativ mikrofluidischen Kammern / Bioreaktoren schnell eingesetzt werden können und gleichmäßig um das Hydrogel mit Lösung 45 Analyten perfuse. Eine FRET-Signal kann nicht detektiert werden (Signal-Rausch-Verhältnis zu niedrig ist), wenn das Hydrogel der Autofluoreszenz zu hoch ist; ein dünneres Hydrogel oder verschiedene Sonde (verschiedene Fluorophore) verwendet werden soll.In Bezug auf die 3D-FRET-Bildgebung in der photovernetzten Hydrogelen, die Verwendung von Mindest Bestrahlung Belichtung und Wellenlängen außerhalb der Anregungsspektren der Sonde Fluorophore wird empfohlen. LAP kann bei 405 nm mit einer sichtbaren Lichtquelle verwendet werden , um potentielle minimieren Zellschäden 31,46. Jedoch wird mit LAP mit 365 nm Bestrahlung empfohlen, da diese Sonde Bleichen minimiert. 365 nm liegt am hinteren Ende der GFP Donoranregung Spektrum, während 405 nm an der Spitze Anregung liegt. Alternativ kann die Sonde Ausdruck für einen Tag zu erholen dürfen. Verwendung von binären Sonden minimiert Probleme der Empfindlichkeit auf Unterschiede in Expressionsniveaus und in der molekularen Diffusion der Donor- und Akzeptor-Fluorophoren. Nicht-binäre Sonden verwendet werden können, aber mit SE statt QE Bildgebung und zusätzliche Korrektur für die spektrale Durchbluten von Anregungs- und Emissionsspektren (siehe unten). Darüber hinaus ist die geringe Verfügbarkeit im Handel und die Komplexität bei der Gestaltung FRET-Sondenkann ein Hindernis sein. Der kritischste Faktor für eine erfolgreiche Experimente bleibt richtige Korrektur und Analyse der Fluoreszenzsignale.

Eine alternative Berechnung des FRET-Verhältnis für mehrere weitere Gründe außer Minimierung der Photobleaching verwendet. Für binäre Einzelketten – Sonden, die häufigsten berichteten Verhältnis Akzeptor – Emission unter Anregung des Donors (sensibilisierte Emission, SE) zu Donoremission unter Donoranregung (abgeschreckt Emission, QE), dh das Verhältnis = SE / QE 25,47,48 FRET. SE / QE nicht linear ist in Bezug auf Veränderungen der FRET – Effizienz 21,22,47. Weist nämlich das Verhältnis eine exponentiell nichtlineare Beziehung inhärenter FRET – Effizienz der Sonde (Ei) (Donius, AE, Taboas, JM unveroffentlicht. (2015)), wobei das Verhältnis linearsten für Ei weniger als etwa 15%. SE / QE wird unterschätzen auch den Anteil von Aktivsonden (FAP, das heißt Fraktion von Sonden – Bindungs ​​Analyt). Therefore, die Analyse der SE / QE erfordert eine umständliche Gleichgewicht Dosis-Wirkungs-Studie und Kurvenanpassung. Glücklicherweise linear sind die Verhältnisse der SE oder QE an den Akzeptor – Emission unter Anregung des Acceptors (AEM) in Bezug auf Ei und der FAP, dh die FRET – Verhältnisse SE / Aem und QE / Aem. SE / Aem wird häufig für binäre Sonden verwendet und erfordert nur die Endpunktkalibrierung (ohne Sonde Aktivität und vollständige Sonde Aktivität), aber basale zelluläre Signal macht dies schwierig. Um die Notwendigkeit für die Endpunktkalibrierungs eliminieren kann SE für die spektrale Überlappung von Donor- und Akzeptor-Anregungs- und Emissionsspektren (spektrale Durchbluten) und für die Quantenausbeute und die spektrale Empfindlichkeit (QS) der kombinierten Sonde Fluorophore und Mikroskop korrigiert (CSE) werden Abbildungssystem. Die korrigierte SE FRET – Verhältnis basierend auf CSE definiert die beobachteten FRET – Effizienz der Sonden innerhalb jedes Pixels eines Bildes, das heißt, E SE = CSE / Aem. verfügbar Kommerzielle und freie Software SE für diese Effekte zu korrigieren undwird der Leser auf die Arbeit von Chen und Periasamy 2006 für eine detaillierte Erläuterung der Methoden 50 bezeichnet. Allerdings erfordert E SE Berechnung Erfassung von drei Bildkanäle pro Zeitpunkt (SE, QE, AEM). Daher wird in dieser Arbeit beschäftigen wir auch ein alternatives FRET Verhältnis E QE = 1 – QE / CAEM, die nur zwei Bildkanäle erfordert Erfassung von (QE und AEM). Die Berechnung E QE aus diesen Kanälen erfordert nur die Korrektur Aem für QS (CAEM = Aem x QS). QS = Dem / Aem ist leicht mit zwei Bilder von der einen Kalibrierungsprobe geschätzt, wobei Dem ist die Donoremission unter Donoranregung mit Akzeptor gebleicht. Die FAP zu jedem Zeitpunkt durch einen Vergleich E SE oder E QE zum Ei der Sonde berechnet werden.

Letztendlich sollten FRET Verhältnis Auswahl (E SE = CSE / Aem vs. E QE = QE / CAEM) unter Beachtung des Sondentyp basieren und die Kanäle mit den besten Signal. sowohl einpproaches umfassen Hintergrundrauschen Korrektur von Bildern pro Bild oben für Änderungen in Autofluoreszenz im Laufe der Zeit Rechnung beschrieben. Sie übernehmen keine Überlappung von Aem Anregungslicht in den Dem Anregungsspektrum, was oft der Fall ist durch Design und Mikroskop Filterkonfiguration zu sondieren. Einzelketten-Sonden können entweder verwenden und die Auswahl beruht auf dem besten Sondensignals (Helligkeit) zur Kamera Lärm und Hintergrundsignal auf SE und QE-Kanäle. Für die ICUE1 Sonde und experimentellen Bedingungen verwendet hier (Zellen und Hydrogel-Typen), hat SE ein stärkeres Signal als QE. Zweikettigen Sonden erfordern die Verwendung von E SE aufgrund nicht-äquimolare Verteilung von Donor- und Akzeptor – Fluorophoren. Für Sonden , die bei der Bindung Analyten wie ICUE1 in FRET verringern, FRET – Effizienz kann "invertiert" werden , um eine positive Signaländerung zu präsentieren bei der Bindung des Analyten wie wir es hier zu tun, mit E SE = 1 – CSE / Aem oder E QE = QE / (AEM x QS).

Analyse von the FAP ist, um eine ordnungsgemäße Korrektur der FRET-Verhältnisse und der Schätzung von Ei empfindlich. Es kann mit dem gleichen Kalibrierungsprobe für QS und einem herkömmlichen Endpunkt – FRET – Effizienz – Test verwendet geschätzt werden als Ei = 1- (QE / Dem) (QE Bild gefolgt von Acceptor Photobleaching und einem Dem Bild) 28, sondern muss darauf geachtet werden , zu minimieren versehentliche Bleichen des Spenders. Wir beschreiben eine modifizierte Version , in der die Schätzung von Dem basierend auf Aem für QS eingestellt wird ersetzt, dh Ei = 1 – (QE / (AEM x QS)). Alternativ Ei = CSE / Aem verwendet werden. Die Einschätzung von Ei in lebenden Zellen erfordert, dass alle Sonden auf volle FRET gefahren werden. Dies ist schwierig für die Sonden in der Praxis zu erreichen, wie ICUE1 die bei der Bindung des Analyten in FRET verringern. Eine In – vitro – basierte Berechnung von Ei unter Verwendung von Zelllysaten und gereinigten Analyten ist am besten, aber nicht in den Anwendungsbereich dieser Arbeit. Hier empfehlen wir 2 'mit, 5'-Didesoxyadenosin cAMP in den Zellen zu verringern. Jedoch kann eine relativ FAP be berechnet ein Ei Schätzung unter Verwendung von aus dem Basisniveau der Signalisierung abgeleitet. Aus diesen Gründen Studien berichten meistens der FRET-Verhältnis (wie hier geschehen) oder ein relatives auf Endpunkt Kalibrierung basierend FAP, wobei die Signalisierungsbasislinie vor Agonist Zugabe ist die untere Grenze und das Signal nach einer zweiten Agonist hinzufügen, die Signalisierungs sättigt die obere gebunden. Forskolin wird oft als Steuer Agonist verwendet cAMP Signal zu sättigen. Alternativ kann ein cAMP-Analogon wie 8-Bromadenosin 3 'verwendet werden, 5'-Monophosphat. Positive Kontrollen bei Beendigung der Studien verwendet, um mögliche Veränderungen in den Signalweg zwischen experimentellen Behandlungen identifizieren empfohlen.

Berechnung der durchschnittlichen Signalantwort pro Zelle erfordert die Berücksichtigung mehrerer Faktoren. Erstens sollte die durchschnittliche FRET – Verhältnis als Mittelwert der Verhältnisse innerhalb einer Zelle, dh (Σ (QE/cAem)) / (Anzahl der Pixel), anstelle der ra bei jedem Pixel berechnet werdentio des durchschnittlichen QE und AEM in einer Zelle, dh (ΣQE) / (ΣcAem). Obwohl diese nicht vorsichtig Maskierung erfordert als Hintergrundrauschen gering ist, unterschätzt sie streng die wahre durchschnittliche FRET-Verhältnis. Jedoch erfordern Pixelverhältnisse Fließkommaberechnung und vorsichtig binäre Maskierung der Zellfläche die ROIs und vermeiden Aufnahme von unechten Verhältnisse von Hintergrundgeräuschen außerhalb der Zelle erzeugt zu definieren. Die gesamte Zellenbereich muss Vorbelastungs Ergebnisse auf der Zellform zu vermeiden, werden quantifiziert. Die Maskierung benötigen im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von Änderungen in der Zellform und der Migration neu definiert werden. Alternativ ROIs größer ist als die Zelle kann verwendet werden, wenn Ausschlusskriterien definiert werden Pixelverhältnisse von QE und Aem Signale zu entfernen, die auch fallen unter zellulärer Ebene und sind in der Nähe von Hintergrundwerten liegen. Die beschriebene Analyseverfahren sollen die grundlegenden Schritte in dieser Arbeit für FRET-Analyse ohne spezielle Software / Plugins verwendet. Hersteller von Mikroskopen und anderen Anbietern verkaufen Add-on-Moduls für ihre Mikroskop-Software, die automatisierte ratiometrischem unterstützen und Analyse FRET. Ebenso hat die Public Domain ImageJ Software mehrere Plugins für Partikel und FRET-Analyse, wie RiFRET. Zweitens ist die pixelbasierten durchschnittlichen FRET Verhältnis unterschätzt die wahre mittlere Verhältnis der 3D-Zellstruktur, weil ein 2D-Bild verwendet wird. Die 2D-Signale darstellen und die mittlere entlang der z-Achse. Berechnung der 3D räumlichen Verteilung von FRET – Verhältnisse in lebenden Zellen nicht möglich ist, ohne Hochgeschwindigkeits – 3D – Bildgebung (z. B. unter Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie). Dies ist ein Problem für die 2D- und 3D-Kulturen, aber einen größeren Effekt in 3D, da mehr der Zellstruktur aus der Ebene existiert. Dies ist von großer Bedeutung für die Sonden, die an zellulären Strukturen, wie beispielsweise die Plasmamembran EPAC1 Sonde PM-ICUE lokalisieren. Siehe Spiering et al. 2013 Vorschläge für die Zelldicke Auswirkungen auf die Berechnungen des Verhältnisses von 24 zu korrigieren. Analyse der Verteilung von Aem kann verwendet werden,erkennen, ob Sonde in Regionen der Zelle und Abbildungsebene eingestellt ansammelt. Dies wird auch dazu beitragen , die räumliche Verteilung der FRET – Verhältnisse zu interpretieren und zu falschen Ergebnissen zu beseitigen, z. B. Sonde Sättigung zu identifizieren (dh eine niedrige Aem Region niedrige Sondenkonzentration aufweisen und Sondensättigung und hohe FRET – Verhältnis aufweisen). Drittens können unterschiedliche FRET Ausgangswerte einen Unterschied in der Transfektionseffizienz zeigen Sonde Ausdruck oder basalen Signalisierung zwischen den Versuchsgruppen. "Relative-Analyse" (Schritt 10.1.1) hilft Drift in der FRET-Verhältnis im Laufe der Zeit zu entfernen, falls vorhanden. Es erleichtert den Vergleich der relativen Größe der Antworten zwischen den Proben, sondern behindert Vergleich zum Zeitverlauf der Reaktion für die Referenzprobe (Kontrollparzelle ist eine flache Linie). "Absolute Analysis" (Schritt 10.1.2) erleichtert den Vergleich der Geschwindigkeit der Reaktion in Proben, aber behindert Vergleich der Größe der Reaktion, da jede Zeile durch eine dissim skaliertIlar konstant. Studien verwenden häufig eine lineare Regression auf der Basislinie für die Drift in der FRET-Verhältnis über die Zeit zu korrigieren.

Die beschriebene 3D-FRET-Verfahren ist eine nützliche und praktische Weise Zeitraffer-Bildgebung von Zellen beladen 3D Hydrogele herzustellen und auszuführen, die zu anderen Sonden und Bildgebungsverfahren angewendet werden kann. Andere FRET-System neben einkettigen binären Sonden komplexere Korrektur der Intensitätsbasierte Signale erfordern, wie oben diskutiert. Alternativ Fluorescence Lifetime Imaging von FRET (FLIM-FRET) verwendet werden FRET-Effizienz über eine Änderung der Emissionslebensdauer der Sonde Spender zu berechnen. Anders als Intensität basiert FRET, FLIM-FRET ist unempfindlich gegenüber Hintergrundrauschen, spektralen Durchbluten, Quanteneffizienz und die spektrale Empfindlichkeit des Detektors 2. FLIM – Systeme sind jedoch teuer, komplex und ungewöhnlich, und die Arbeit am besten mit Fluorophore mit einzelnen Exponenten Zerfall und keine FLIM Run-off – 49. Das beschriebene Verfahren kann auch mit Mo verwendet werdenWiedermikroskopieplattformen (z. B. FRET-TIRF, Fluoreszenzanisotropiemessungen und spektrale Korrelation FRET). Die Anwendung dieser Methode auf die 3D-Bildgebung mit hoher Geschwindigkeit konfokale und Multiphotonen-Mikroskopie wird Analyse der subzellulären Verteilung von Signalantwort erleichtern und erhöhen die Genauigkeit der Analyse zu signalisieren. Diese 3D-FRET-Methode erweiterte Zellbiologie Studien in simulierten 3D-zellulären Mikroumgebung ermöglichen. Als solches kann es leicht zu Pharmakologie und der regenerativen Medizin Bedürfnisse angewendet werden, einschließlich interzelluläre Signalübertragung zu studieren und Screening-Arzneimittelreaktion in engineered Hydrogel-basierte microtissues.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren erkennen an, die finanzielle Unterstützung der School of Dental Medicine an der University of Pittsburgh, die National Institutes of Health Award K01 AR062598 und die Gewährung von P30 DE030740. Die Autoren danken auch Dr. Jin Zhang für die ICUE1 Plasmid, Wayne Rasband für ImageJ und Michael Cammer für die ImageJ Makro zu entwickeln.

Materials

Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 mL, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ=365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. . Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O., Capri, A. . Progress in Molecular and Environmental Bioengineering – From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. , 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K., Nagamune, I. E. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. 119, 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators – Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X., Burdick, J. A., Mauck, R. L. . Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. , 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).

Tags

FRET Imaging3D HydrogelsIntracellular SignalingBiologia dello sviluppoPharmacologyRegenerative MedicineBiomaterialsDrug ScreeningWide Field MicroscopyHydrogel CastingCell SuspensionCrosslinkingUV ExposurePDMS DishPhenol-free MediumMicroscope ImagingFRET Ratio

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image