FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

1. Préparation des matériaux Préparer diméthacrylate de polyéthylène glycol (PEGDM, 4000 MW) par methacrylating polyéthylène – glycol selon les procédés décrits par Lin Gibson et al. , 29. Alternativement, PEGDM peut être acheté. Synthétiser le photoinitiateur, le lithium phényl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), à travers un processus en deux étapes où le premier phénylphosphonite de diméthyle est mis à réagir avec le 2,4,6-trimethylbenzoyl chlorure par une réaction de Michaelis-Arbuzov, puis le sel de lithium créée par l' ajout de bromure de lithium dans du 2-butanone, conformément Majima et al. , 30. Note: Alternativement, d' autres photoinitiateurs peuvent être achetés , mais LAP montre une meilleure biocompatibilité et réticulation d' efficacité 31. Fonctionnaliser les lamelles de verre pour permettre la liaison de l'hydrogel sur le verre et ainsi empêcher tout mouvement lors de l'imagerie. Dans une hotte chimique avec un équipement de protection adéquat, l'utilisation3- (triméthoxysilyl) propyle , le méthacrylate d'selon le protocole du fabricant pour les PC-gels et les époxy silanes (3-glycidoxypropyltriméthoxysilane) pour TR-31 gels. Remarque: Alternativement, les diapositives prérevêtues peuvent être achetés. Notez que la lamelle doit être plus grand que le bien du plat PDMS à l'étape 3.8. 2. Cellule Transfection Dans une culture hotte de tissus et en utilisant des techniques stériles, dégel et plaque les cellules souhaitées au sous-confluence (50 – 70%), les chondrocytes bovins ici à 15.000 cellules / cm 2 à 6 puits des boîtes de culture non-traités. Remarque: Tout type de cellule concernée peut être utilisée, y compris les cellules indépendantes d'ancrage. Laisser les cellules récupérer pendant un jour dans un incubateur à 37 ° C. Avant les étapes suivantes, éliminer le milieu, rincer avec du PBS, et ajouter du milieu 2 ml de phénol et sans sérum par puits. Le lendemain, pour chaque puits, ajouter 100 pi de milieu phénol- et sans sérum ainsi que 3ul de réactif de transfection dans un tube à essai en verre autoclavée. Pour mélanger, agiter le tube légèrement. Incubation à température ambiante pendant 5 min. Limitez toute exposition à la lumière. Ajouter 1 pg FRET la sonde ADN et secouer légèrement. Laisser incuber le mélange à la température ambiante et à l'abri de la lumière pendant 30 min. Remarque: Dans cette expérience ICUE1 plasmidique (avec la permission du Dr Jin Zhang 33) a été utilisé. Les fluorophores en ICUE1 sont cyan protéine fluorescente (PCP, donneur) et la protéine fluorescente jaune (YFP, accepteur). Le rapport du réactif de transfection à l'ADN plasmidique sera besoin d'ajustement pour une transfection optimale des différents types de cellules. Distribuer le mélange préparé (~ 104 pi) goutte à goutte à chacun des 6 puits contenant des cellules plus 2 ml de phénol et un milieu sans sérum. Ne pas pipeter de haut en bas. Agiter doucement la plaque pour mélanger. Incuber à 37 ° C pendant 48 heures. Remarque: inhibe la confluence efficacité de transfection et modifie l'expression endogène des récepteurs. 3. Fabrication dePDMS Moules pour Hydrogel Fonderie et Culture Pour préparer une lame de verre grand pour lancer le polydiméthylsiloxane (PDMS) sur, nettoyer la vitre d'abord avec du savon, rincer avec une grande quantité d'eau, puis sécher avec de l'isopropanol suivi par air. Traiter le verre avec un réactif de siliconage selon le protocole du fabricant afin que les PDMS peuvent facilement être décollée après durcissement. Rincer réactif résiduel hors de la surface avec du toluène sur un récipient de captage. Laisser la surface sécher à l'air complètement avant ou utiliser la chaleur à 100 ° C pour raccourcir le temps d'attente. Sélectionner une hauteur d'hydrogel (par exemple, 1 mm) et calculer à 1,2 fois le volume de PDMS nécessaire pour couvrir la lame de verre avec des PDMS de cette épaisseur avec les dimensions de la lame de verre et la hauteur d'hydrogel. Remarque: PDMS ne rétrécit pas. Mélanger les composants du kit PDMS à un ratio de 10: 1 en poids dans un bécher. Une fois qu'il est bien mélangé, placer le bécher sous le vide de dégazer. RelIEVE le vide si des bulles commencent à déborder le récipient et répéter. Remarque: D'autres épaisseurs d'hydrogel peuvent être utilisés, mais au prix de l'augmentation de fond et une opacité accrue si centrifugation (étape 6.2) n'est pas utilisé. Envelopper de papier d'aluminium autour de la base et les côtés du verre pour contenir les PDMS. Versez délicatement la quantité désirée de PDMS dégazés sur ce verre entouré par feuille. Mesurer la hauteur PDMS. Gardez à l'esprit que la hauteur du PDMS sera la hauteur maximale de l'hydrogel. Si les bulles sont créées lors de la coulée, dégazer à nouveau ou les faire éclater avec une spatule ou d'une aiguille. Placez les PDMS non durcis sur une surface plane dans un four à 100 ° C pendant 2 heures, ou le laisser à température ambiante pendant 24 heures. Retirez délicatement les PDMS de la surface une fois durci. Découper la forme souhaitée (par exemple, poinçon cylindrique de 3 mm) pour les hydrogels. Note: photoréticulation produira légèrement plus étroites cylindres PC-gel que le diamètre du moule en raisonà la trempe de la réaction par de l'oxygène moléculaire dans le PDMS. Stériliser les PDMS poinçonnés. Pour les expériences à court terme, immerger le PDMS dans 70% d'éthanol pendant 1 heure. Assembler le moule en ajustant la base de PDMS stérilisées avec une lamelle de verre stérile d'une épaisseur adaptée à la correction de microscope objective. Mettez de côté pour une utilisation à l'étape 6. Fabriquez un plat PDMS plus grande en utilisant les méthodes ci-dessus (avec un puits plus large et plus haute que l'hydrogel) pour contenir l'hydrogel et moyen. Accommodez un volume moyen au moins 10x plus que l'hydrogel pour immerger l'hydrogel et de minimiser la dilution de l'analyte. 4. Préparation des hydrogels Précurseurs Solutions Dans une culture hotte de tissus et en utilisant des techniques stériles, préparer l'hydrogel solutions de précurseur approprié pour l'étude immédiatement avant d'ajouter les cellules. Préparer PC-gel à partir d'un précurseur de polymère de la manière suivante. Mélanger la poudre PEGDM dans un tampon phosphate salin (PBS, pH 7,2) à 10% (p / v). Ajouter le photoamorceur (par exemple, LAP) à une concentration finale de 0,005 à 0,01% (p / v) et mélanger par pipetage. Couvrir la solution avec du papier d'aluminium ou de blindage de la lumière comme LAP est sensible à la lumière. Remarque: ici le facteur de matrice extracellulaire de croissance réduit TR-gel est utilisé tel que fourni par le fabricant. 5. suspension cellulaire dans les solutions hydrogels Dans une hotte de culture tissulaire et en utilisant des techniques stériles, aspirer le milieu à partir des puits. Ajouter PBS dans les puits, puis retirez bien rincer monocouches de cellules attachées. Dissocier les cellules du substrat de culture à l' aide de 2 à 3 ml par 25 cm2 de solution de dissociation cellulaire. Roche doucement, puis incuber à 37 ° C pendant 10 – 20 minutes, ou jusqu'à dissociées. Fermement robinet plat si nécessaire pour déloger les cellules. Remarque: Les solutions de dissociation cellulaire alternatifs sont disponibles avec une sélection limitée à ceux qui ne sont pas impact la voie de signalisation en cours d'analyse par clivage des récepteurs d'intérêt. Après que les cellules sont détachées, ajouter 2 ml de milieu phénol- et sans sérum, les cellules en suspension, et compter les cellules avec un hémocytomètre. Remarque: milieu sans sérum chimiquement défini (par exemple, additionné d'insuline, de la transferrine et le sélénium) peuvent également être utilisés. Aliquoter le nombre désiré de cellules sur la base du type de cellules dans des flacons stériles et granulés (par exemple, les cellules à 2,0 x 10 6 par flacon). Éliminer le surnageant, ajouter le volume désiré de précurseur d'hydrogel et les cellules en suspension par pipetage. Utiliser un volume de précurseur qui produira 2 x 10 5 cellules / cm 2 dans le plan xy lors de la visualisation de l'axe z de l'hydrogel affaissé (par exemple 1,0 ml par flacon pour un hydrogel à 1 mm d' épaisseur contenant 2 x 10 6 cellules / ml). Prenez soin de ne pas produire des bulles. Se déplacer rapidement à l'étape suivante pour limiter les effets négatifs sur 34 viabilité des cellules </ Sup>. 6. Hydrogel Préparation Dans une culture tissulaire et le capot en utilisant des techniques stériles, ajouter le précurseur d'hydrogel contenant des cellules dans les moules de fonderie préparés à l' étape 3 (par exemple, 7,1 ul par 3 mm de diamètre x 1 mm moule). Créer un hydrogel supplémentaire, selon les mêmes méthodes décrites, à utiliser pour l'étalonnage du système d'imagerie de microscope et la sonde d'étalonnage (si l'efficacité de la sonde inhérente est inconnue). Centrifuger le précurseur d'hydrogel avant la gélification / réticulation pour optimiser la formation d' image en limitant les cellules à un seul plan focal et en minimisant signal hors plan contenant les cellules préparées (figure 1). Ajuster le temps de centrifugation et de la force du type de cellule et de la viscosité du précurseur (400 g pendant 4 minutes). Un gel ou réticuler la solution Pour l'hydrogel PC-gel, irradier le précurseur contenant des cellules avec un UV-A source de lumière (λ = 365 nm) pendant une durée d'exposition égale à3,2 J / cm 2 par millimètre d' épaisseur à photocrosslink. Remarque: Utilisez une épaisseur minimale de 1 mm dans le calcul. Exposures devraient tomber dans la gamme 1-5 min. Utilisez le temps d'exposition minimum. Évitez de trop irradier les cellules car cela diminue la viabilité et l'eau de Javel du donneur PCP. Cependant, les temps d'exposition à moins de 60 s ne sont pas recommandés, car l'irradiation à haute intensité conduit à l'auto-extinction radicale et faible viabilité cellulaire. Pour l'hydrogel TR-gel, placez le moule rempli dans une boîte de Pétri et de passer à un incubateur pour gelate thermiquement. Incuber à 37 ° C pendant 30 min. Après gélification ou de réticulation de l'hydrogel, retirer le moule de coulée hydrogel PDMS et le remplacer par le plus grand plat préparé PDMS (de l'étape 3.5). Appuyez sur les PDMS vers le bas sur le verre avec une spatule stérile pour la faire adhérer. Placer ce PDMS plat avec lamelle dans un récipient stérile, comme une boîte de Pétri. Ajouter un milieu sans sérum exempt de phénol ou chimiquement me définidium (milieu sans sérum complété avec de l'insuline, de la transferrine et de sélénium (étape 5.4)) pour le bien créé avec le plat PDMS et lamelle pour maintenir l'hydrogel immergé. Incuber à 37 ° C pendant 30 min. Remarque: Si vous utilisez un plat spécialisé avec une lamelle, puis placer la lamelle en cela et ajouter de la même moyenne. Sinon, effectuer cette étape la veille imagerie FRET pour permettre aux sondes pour récupérer les longueurs d'onde d'irradiation se chevauchent avec le spectre donneur d'excitation PCP. 7. 3D FRET Imaging Retirer le plat PDMS avec l'hydrogel de la boîte de Pétri, préparé à l' étape 6.4, et le fixer dans un porte-échantillon réglable pour la phase XY de microscope (Figure 2). Positionner le porte-échantillon sur la platine du microscope. Appliquer de l'huile à l'objectif si nécessaire. Utilisez un objectif d'au moins 40X et de grande ouverture numérique (NA) (c. -à- 1,3 NA) pour capturer le relativement faible fluorophoreémission e. Configurer les champs de vision (FOV) pour l'acquisition d'images: Sélectionnez les cellules pour l'imagerie en utilisant l'imagerie lumière transmise et vérifier la transfection avec l'imagerie de fluorescence. Choisissez au moins 15 cellules différentes. Sélectionnez les cellules qui ne sont ni trop clair ni trop faible (qui pourrait autrement conduire à sonde sur-saturation ou de faible sensibilité) et le ratio de FRET entre 0,0 et 1,0 (qui indique le contraire dommage ou désintégration de la sonde binaire). Ensuite, éteindre la lumière pour limiter l'exposition. Sélectionnez FOV à proximité du centre de l'hydrogel et avec les cellules d'intérêt dans le champ d'éclairage relativement plat (Voir Figure 3B et Etape 9.2 ci – dessous). Configurez les réglages de l'appareil pour les canaux d'image FRET. Choisissez parmi les quelques cellules à proximité du centre de la FOV pour optimiser les "configurations optiques" (ie., L' exposition et le gain par canal d'image). Note: La nomenclature ci-dessous varie depending du logiciel utilisé pour faire fonctionner le microscope et la caméra. Le logiciel de microscope, NIS-Elements, est utilisé ici pour la capture d'image et d'analyse. Pour l'analyse FRET de sondes à une seule chaîne, sélectionnez deux canaux d'image par FOV: Trempé émission (QE), qui est l'émission du donneur sous excitation du donneur et accepteur émission sous accepteur excitation (Aem). Note: Pour la sonde ICUE1 CFP-YFP, une paire pour QE CFP excitation et filtre d'émission (418-442 ex, 458-482 em) et une excitation et d'émission paire YFP pour Aem (490-510 ex, 520-550 em) sont utilisés. Réglez l'exposition pour QE et Aem pour acquérir l'intensité maximale du signal sans saturation (et si vous utilisez un CCD, avec le gain minimal possible) pour minimiser le bruit de fond. Maintenir les configurations optiques identiques pour les deux fluorophores et tout au long de l'expérience, ainsi que parmi les groupes expérimentaux pour éviter de biaiser les résultats ( par exemple, la puissance d'excitation, la taille de l' iris, l' exposition et le gain de la caméra) (figure 3A). Acquérir des canaux d'image supplémentaires pour permettre plus d' options d'analyse après l' acquisition (par exemple, corrigée émission sensibilisée (Cse) Imagerie (voir Discussion)). Pour la sonde ICUE1 CFP-YFP, acquérir l'excitation (Ex) et d' émission (Em) canaux Ex donneur – Em donneur (QE, sélectionnez CFP-CFP dans le logiciel de microscope), Ex donneur – Em accepteur (SE, sélectionnez CFP – YFP), Ex accepteur – Em accepteur (Aem, sélectionnez YFP-YFP) et Ex accepteur – Em donneur (YFP-CFP) configurations (voir la figure 3A). Configurez le taux de capture pour l'acquisition d'images temps-lapse. Diminuer le taux de capture si elle est limitée par le matériel. Pour les essais à court terme (par exemple, 30 – 60 min), représentent environ 12 acquisitions par minute pour chaque FOV (taux d'échantillonnage de 5 sec) pour capturer la cinétique de signalisation. Utiliser le taux d'échantillonnage minimum nécessaire pour éviter signiphotoblanchiment tivement la sonde. Régler la vitesse d'acquisition en tapant la périodicité des captures dans le logiciel de microscope. Pour les essais à long terme (par exemple., 24 h), commencer par le taux élevé d'acquisition pour capturer la réponse impulsionnelle initiale, puis passer à une vitesse d'acquisition faible, par exemple, toutes les 5 à 10 min. Sélectionnez "Exécuter maintenant" dans le logiciel de microscope pour lancer l'acquisition et la capture d'image des images pendant 5 minutes pour établir une base de référence pour la réponse de la sonde aux FOV désignés. Après 5 min de l' acquisition d'image, pipettes dans l'agoniste ou un antagoniste analyte désiré (par exemple, la forskoline à 100 nM), mélanger par pipetage, et continuer l' imagerie. 8. FRET Calibration Etalonnage du système: Utiliser l'hydrogel d'étalonnage supplémentaire, fabriqué comme décrit dans l'étape 6, pour acquérir des images Aem d'au moins 6 cellules représentatives en utilisant les mêmes critères FOV, configurations optiques et jeu de la caméraréglages utilisé pour FRET imagerie ci-dessus (étapes 7.1, 7.2, et 7.3). Remarque: La quantification du rendement quantique et de la sensibilité spectrale (QS) pour le système de sonde et d'imagerie de microscope combinée est nécessaire pour l'analyse «absolue» mais non FRET FRET "relatif". Photobleach le fluorophore accepteur en sélectionnant une longue exposition de 5 min à la lumière d'excitation à pleine intensité (excitation sur le canal Aem). Utilisez une ouverture étroite pour blanchir seulement les cellules d'intérêt. Vérifiez que le signal Aem est d'au moins 10% inférieur à celui du signal original en comparant l'histogramme de l'intensité du signal (fenêtre "LUT") avant et après photoblanchiment. Continuer photoblanchiment si la perte de signal est inférieur à 90%. Remarque: Vérifiez que le fluorophore donneur est non blanchie au cours de cette procédure en utilisant des filtres d'excitation Aem qui ne se chevauchent pas avec le spectre donneur d'excitation. Acquérir émission du donneur sous donneur d'excitation avec le fluorophore accepteur maintenant blanchi (Dem) nousment la même configuration optique pour QE à l'étape 7.3. Calculer QS par pixel comme Dem divisé par Aem après correction de fond, comme dans la section 9 ci-dessous. QS = Dem / Aem Calculer la moyenne QS parmi les cellules des moyennes cellulaires. Estimer l'efficacité de FRET inhérente de la sonde (Ei) en utilisant l'échantillon d'étalonnage. Provoquer FRET maximum de la sonde et calculer Ei = 1 – QE / (Aem x QS) de l'article 9 ci-dessous. Alternativement, utilisez Ei = Cse / Aem, ou Ei calculées en utilisant un test de point de terminaison classique pour une efficacité FRET avec Ei = 1 – (QE / Dem). Note: Ei est nécessaire de quantifier la fraction absolue des sondes activées (FAP, à savoir, la fraction de sondes analyte de liaison), mais pas nécessaire pour l' analyse "relative" FRET. Saturer réponse de la sonde en stimulant la culture avec un agoniste de la production analyte / activation pour les sondes qui augmentent en FRET lors de l'interaction avec l'analyte. Inhibition sonde INTERACTIONSn avec l'analyte en utilisant un antagoniste de la signalisation pour les sondes qui diminuent en FRET lors de la liaison de l'analyte. Remarque: Dans le cas de la sonde ICUE1, supprimer les niveaux de AMPc avec une inhibiteurs adényl cyclase tels que 2 ', 5'-dideoxyadenosine (spécifique) ou 3-isobutyl-méthyl-xanthine (non spécifique). 9. FRET Ratio Calcul Dessiner et désigner une région d'intérêt (ROI) par FOV près des cellules pour définir le niveau de fond (figure 3B) dans chaque FOV au fil du temps, mais limiter le retour sur investissement à la zone d'éclairage relativement homogène sur le centre de l'image (figure 4A ). Voir la discussion pour une explication des options de correction d'arrière-plan. Avec le logiciel de microscope: Sélectionnez la flèche sur l'icône "Contexte de ROI" et sélectionnez "Dessiner le fond Elliptique ROI" (d'autres formes vont travailler). Assurez-vous que "Keep Mise à jour de fond Offset" est sélectionné. Activer vieaile du ROI de fond en cliquant sur l'icône d'arrière-plan ROI. Vous pouvez également utiliser l'icône «ROI» et les propriétés de ROI définies comme "Utiliser comme fond d'un retour sur investissement» et «ROIs sont différentes dans chaque multipoint". Avec ImageJ: Utilisez la barre d'outils pour sélectionner l'outil de dessin circulaire. Puis ajouter la forme au gestionnaire de ROI via le menu "Analyser → Outils → ROI Manager". Définissez une couleur différente pour le retour sur investissement de fond dans le gestionnaire de ROI si désiré. Pour chaque canal FOV et de l' image (par exemple, QE et Aem), soustraire la valeur moyenne dans le retour sur investissement de fond par point de temps pour créer une image corrigée par canal, par exemple, SQE t, p = QE t, p – BQE t, p où t est le temps d'acquisition, p est égal à l'angle de champ ( par exemple, la position xy), et Bqe et BAEM sont les valeurs scalaires du signal à l' intérieur de la ROI de fond. Utilisez les fonctions arithmétiques d'image disponibles dans le logiciel. Wvec le logiciel de microscope, utilisez l'icône "ROI de fond" et sélectionnez "Background Soustraire Utilisation de retour sur investissement". Dans la fenêtre pop-up, sélectionnez "Chaque image" sous "fond Soustraire retour sur investissement" et sélectionnez "Tous les cadres" sous "Appliquer à". Note: Un retour sur investissement de fond doit être défini dans chaque FOV pour cette fonction pour fonctionner correctement (par exemple, la fonction ne correctement soustraire pas de milieux pour FOV avec ROIs de fond si certains FOV ont undefined ROIs de fond.). Avec ImageJ, utilisez le "Soustraction BG de ROI" macro écrite par Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/). Enregistrer la série temporelle corrigée des images en sélectionnant "Enregistrer sous" pour les étapes d'analyse suivantes. Définir un retour sur investissement autour de la cellule à l' aide d' un masque binaire pour chacune des cellules en cours d' analyse dans chaque champ de vision (figure 4B). Utilisez le canal Aem au seuil de l'image par FOV au début of l'expérience, déterminer les limites de la cellule, et a défini le ROI. Save the ROIs. Avec le logiciel de microscope: Pour chaque trame (ie, FOV), utilisez d' abord le menu "binaire → Définir Threshold" et sélectionnez "appliquer à la trame courante". Réglez la valeur de seuil inférieure pour sélectionner les cellules. Ensuite, utilisez la fonction "binaire → Close" pour remplir les trous dans le masque binaire si nécessaire. Ensuite, utilisez l'icône de ROI pour sélectionner "Copier binaire ROI"; la couche binaire est automatiquement supprimé. Append ROIs pour les images suivantes à la piscine existante de ROIs. Supprimez tout ROIs parasite. Suivant "clic-droit" sur le ROIs et assurez-vous que leurs propriétés sont "Utilisation comme standard ROI" et "ROIs sont différentes dans chaque multipoint". Avec ImageJ: Pour chaque FOV, utilisez d'abord le menu "Image → Ajuster → Seuil". Ensuite, utilisez "Analyser → analyser des particules» avec Afficher Outlines et Ajouter au gestionnaire sélectionné. Utilisation"Binaire → Fermer" pour remplir des "trous" dans le masque binaire si nécessaire. Supprimer parasite ROIs. plugins gratuits sont disponibles pour automatiser ce processus. Calculer le QE basé ratio de FRET à chaque pixel, SQE / SAEM pour l' analyse relative (Voir l' étape 10) et E QE = SQE / (QS x SAEM) pour l' analyse absolue (voir l' étape 10) avec QS obtenu à l' étape 8.1. Utilisez flottante division point des images. Voir la section de discussion pour une explication des dérivations de rapport. Avec le logiciel de microscope: Utilisez le menu «Image → image Opérations" et sélectionnez "virgule flottante". Avec ImageJ: Utilisez soit le «Processus → Photo Calculator" fonction ou le plug-in "Calculator_Plus.java". Remarque: Sinon, la macro "pH_ratioMacro" .txt "peut être adapté pour calculer les ratios de FRET Il utilise la macro de correction de fond décrit ci-dessus et est disponible à. Exporter le rapport moyen par cellule (ie, par ROI) dans un logiciel de tableur et de graphiques. Avec le logiciel de microscope: Utilisez soit le bouton d'exportation ND dans le "Statistiques ROI" contrôle de l'analyse ou le bouton "Spreadsheet Export" dans le "Temps d'analyse" contrôle de l'analyse. Avec ImageJ: Sélectionnez d'abord le menu "Analyser → Définir mesures" et assurez-vous que la «valeur moyenne» et «écart-type» sont sélectionnés. Ensuite, utilisez le gestionnaire de ROI et sélectionnez le bouton "Mesure". Enregistrer la fenêtre des résultats générés. Ratio 10. FRET Analyse Calculer le ratio de FRET cellulaire moyenne dans le temps à partir des ratios moyens par cellule (exporté à l'étape 9.4). Considérons la ligne de base de FRET ratios (le rapport avant d'administrer la substance à analyser) dans ce calcul. Note: Tableur et logiciel graphique est utilisé ici pour tracer la ligne de base-subtragi ratios moyens de FRET et leur erreur standard de la moyenne (SEM) en utilisant une régression linéaire sur la ligne de base comme dans l' étape 10.1.2 et 10.1.3 ci – dessous (figures 5 et 6). Analyse relative (amplitude de la réponse): Normaliser chaque courbe à un échantillon de référence commun (par exemple, un échantillon non traité.). Analyse absolue (évolution temporelle de la réponse): Maj les courbes à un point de départ commun en normalisant chaque courbe avec sa ligne de base FRET ratio. Dans le logiciel de feuille de calcul et graphique, entrelacer les données (colonnes de ratios moyens par cellule) avec de nouvelles colonnes, de telle sorte que chaque colonne d'origine est jumelé avec une nouvelle colonne ne contenant que des données de rapport pour la période de référence (rapports avant analyte ajouté). Sélectionnez «Insérer une colonne" pour insérer une colonne vide après chaque colonne de données. Ensuite, copiez les données de base dans les colonnes vides appariés. Dans le logiciel de feuille de calcul et graphique, sélectionnez "Insérer → Nouvelle analyse → Transform Retirez la ligne de base "et réglez ensuite" colonne Sélectionné "à" tous les autres ", sélectionnez" suppose la ligne de base est linéaire ", et sélectionnez« Différence »sous la rubrique« calcul ». Calculer le rapport cellulaire moyenne et statistiques descriptives. Dans le logiciel de feuille de calcul et graphique, sélectionnez "Insérer → Nouvelle analyse → XY Analyses → Moyens Row avec SD ou SEM" puis sélectionnez "signifie Row avec SEM" dans la fenêtre pop-up.