JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Published: August 01, 2016
doi:
10.3791/54135
, ,
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine,University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine,University of Pittsburgh, 3Laerdal AS

Summary

Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor real-time celbiologie studies. Hier een werkwijze voor FRET beeldvorming cellen in fysiologische driedimensionale (3D) hydrogel microenvironments middels conventionele epifluorescentie microscopie wordt gepresenteerd. Een analyse voor ratiometrische FRET probes die lineaire verhoudingen over de activering bereik oplevert wordt beschreven.

Abstract

Beeldvorming van Förster resonance energy transfer (FRET) is een krachtig hulpmiddel voor de behandeling van celbiologie in real-time. Onderzoeken waarin FRET gewoonlijk gebruiken tweedimensionale (2D) cultuur, waarin de driedimensionale (3D) cellulaire micromilieu niet nabootsen. Werkwijze voor geblust emissie FRET beeldvorming uitgevoerd met gebruikelijke groothoek epifluorescentie microscopie van cellen in een 3D-omgeving hydrogel wordt gepresenteerd. Hier een analysemethode voor ratiometrische FRET probes die lineaire verhoudingen over de activering sonde bereik oplevert wordt beschreven. Meting van intracellulair cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) niveaus is aangetoond in chondrocyten onder forskoline stimulatie met een probe voor Epac1 activering (ICUE1) en de mogelijkheid om verschillen in cAMP signalering afhankelijk hydrogel materiaalsoort, hierin een fotoverknoping hydrogel (PC-gel detecteren, polyethyleen glycol dimethacrylaat) en een warmteresponsieve hydrogel (TR-gel). Vergeleken met 2D FRET methoden,Deze methode vereist weinig extra werk. Laboratoria al gebruik te maken van FRET beeldvorming in 2D kan eenvoudig deze methode om cellulaire studies uit te voeren in een 3D-micro-omgeving vast te stellen. Het kan verder worden toegepast op hoge doorvoer screenen van geneesmiddelen in gemanipuleerde 3D microweefsels. Bovendien is compatibel met andere vormen van FRET beeldvorming, zoals anisotropie gemeten en fluorescentie lifetime imaging (FLIM), en met geavanceerde microscopie platforms via confocale, gepulseerde of gemoduleerde belichting.

Introduction

Cellulaire signalering is complex en gevolgschade voor tal van gebieden, met inbegrip van farmacologie, tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Handige onderzoek gereedschap nodig om ons begrip van celbiologie bevorderen en om een ​​optimale materialen voor weefselregeneratie te ontwikkelen. Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming is een essentieel instrument om de analyse van receptor activering, moleculaire conformatie, en supramoleculaire interacties (bijv., Eiwit / DNA complexatie) in levende cellen. FRET is een type niet-radiatieve energieoverdracht tussen fluoroforen 1. Het heeft een efficiëntie die omgekeerd evenredig met de zesde macht van de afstand tussen een donor fluorofoor en acceptor fluorofoor. Zo kan informatie over de ruimtelijke afstand tussen twee verschillende moleculen of tussen gebieden van één molecuul op nanometerschaal (typisch 1-10 nm) 2. De donor en acceptor fluoroforen kunnen verschillend zijn molecule types (hetero-FRET), waarbij de donor de hogere energie-emissie (kortere golflengte) of van hetzelfde type (homo- FRET). FRET beeldvorming kan worden uitgevoerd op vaste of levende cellen, maar in het algemeen gefixeerde cellen worden gebruikt voor beeldvorming van moleculaire wisselwerkingen bij hoge ruimtelijke resolutie bij hoge snelheid confocale systemen niet beschikbaar. Levende cellen worden gebruikt om interacties en processen die worden geremd of gewijzigd door fixatie, zoals real-time intracellulaire signalering reactie 3 bestuderen.

Levende cellen studies die in dienst FRET beeldvorming gebruik tweedimensionale (2D) cellulaire culturen omdat in een deel van de eenvoud en lagere achtergrond (geen uitstoot van uit het vlak cellen). Echter, 2D culturen ook talrijke cellulaire processen te veranderen in vergelijking met de fysiologische micro en driedimensionale (3D) cultuur 4,5. Zo zijn natieve cel tot cel en cel-extracellulaire matrix interacties drastisch veranderd in 2D kweek leidt tot de easily waargenomen veranderingen in celmorfologie en polariteit 6. Membrane microdomeinen (bijv., Caveolae en lipid rafts) en de receptor signalering zijn sterk gereguleerd door de cultuur milieu, voor een deel omdat ze zich binden cytoskelet componenten 7,8 en de structuur mobiele vorm en cytoskelet zijn sterk gereguleerd door de ruimtelijke cultuur milieu 9. Mechanotransductie wordt niet alleen beïnvloed door de 3D-matrix, maar de meer complexe secundaire belastingsomstandigheden veroorzaakt in 3D-omgevingen in vergelijking met 2D culturen 10. Tenslotte de permeabiliteit van 3D matrices is dan het kweekmedium, in het algemeen met een verminderde diffusie en verhoogde binding van cel signaalmoleculen vergelijking met 2D culturen. Met 3D culturen men kunnen maken en zich aan een micro meer vergelijkbaar met de fysiologische opzichte van lijm, chemische en mechanische signalen. Wisselwerking tussen cellen kan worden bevorderd en de hechting kan worden geregeld wet de structuur, samenstelling en architectuur (patroon) van het 3D-materiaal 11-13. De mechanische eigenschappen van het materiaal kan ook worden aangepast door de samenstelling en structuur 14,15. Het kweken van cellen in hydrogels derhalve vergunningen FRET studies op primaire cellen die anders de-differentiëren of verandering in fenotype met gebruikelijke technieken, bijv., Cellen van gewrichtskraakbeen. Derhalve is een werkwijze nodig om FRET assays 3D levende culturen schakelen.

Hydrogel scaffolds zijn ideaal voor 3D FRET gebaseerde studies omdat ze optisch transparant kunnen worden gemaakt en afgestemd op de micro controle en cellulaire signalen verschaffen. Hydrogelen gemaakt van natuurlijke polymeren zijn gebruikt in celcultuur decennia, gelatine en fibrine 16. Meer controle over de cellulaire micro-omgeving kan worden bereikt met chemische modificatie van deze polymeren en het gebruik van synthetische polymeren 17,18. hydrOGEL mechanische stijfheid en doorlaatbaarheid kan worden geregeld door het veranderen van de polymere samenstelling en maaswijdte (polymeer en verknopingsdichtheid) 19,20. Verder kan hydrogels bioactief worden via de incorporatie van groeifactoren en cellulaire liganden. Door deze mogelijkheden, de ontwikkeling van hydrogels voor biosensoren, geneesmiddelafgifte en weefselmanipulatie toepassingen is een actief gebied van onderzoek 21. 3D printen van hydrogels is ook in ontwikkeling voor de productie van micro-weefsels en -organs 15. Aldus FRET beeldvorming van cellen in hydrogels is niet alleen nuttig als middel om fysiologische celgedrag benaderen, maar ook als instrument te gaan wat ontworpen weefselgroei.

Binaire ratiometrische FRET probes zijn zeer nuttig bij het bestuderen van cellulaire signalering en kunnen worden gebruikt in hydrogel culturen. Voor een gedeeltelijke lijst van gepubliceerde fluorescente en FRET-probes, zie de Cel Migratie Consortium website <sup> 22. De meest voorkomende soort probe bevat twee verschillende fluoroforen die zijn verbonden of gekoppeld door een herkenningselement (s) (analyt kwetsbaar gebied). Deze gebieden ondergaan een conformationele verandering, associatie of dissociatie bij detectie van de analyt (bijv., Binding van een ion of molecuul, enzymatische splitsing van de regio) dat de afstand tussen de fluoroforen en dus de FRET magnitude (hoger of lager) wijzigt 23. Een minder gebruikelijke maar nuttige probe Type voert een analyt gevoelig verandering in de spectrale overlap van de twee fluoroforen, die FRET grootte verandert. "Single-chain" ratiometrische probes maken gebruik van een fluorofoor paar gekoppeld aan een enkel molecuul. "Dual-chain" sondes gebruiken fluorofoor paren op afzonderlijke moleculen, maar hun expressie kan onder dezelfde expressiecassette 24 worden gekoppeld. Unlike studies met enkele fluorofoor expressie (bv. Fluorescerende fusie-eiwitten), studies met ratiometrischeFRET probes geen dubbele transfectie vereisen controle voor transfectie-efficiëntie en cellevensvatbaarheid. Ratiometrische FRET probes zijn relatief ongevoelig voor transfectie-efficiëntie bij het ​​boven een minimumdrempel (concentratie ongevoelig) 23,25 uitgedrukt. Ze zijn ongevoelig voor fluctuaties excitatiebron en andere intracellulaire omgevingsfactoren (bijv., PH, ionen), zolang beide fluoroforen zijn eveneens ontvankelijk. Bovendien is hun reactie niet onder transcriptionele vertraging tegenstelling fluorescente en bioluminescente promoter-reporter constructen 26,27.

Ratiometrische FRET probes zijn gemakkelijk en vaak gebruikt in conventionele groothoek epifluorescentiemicroscoop systemen. Widefield microscopen hebben de voorkeur boven lijn scanning confocale systemen voor live-cell imaging vanwege bezorgdheid over de kosten van het systeem, fluorofoor bleken, en de vangst van het signaal veranderingen met voldoende temporele resolutie. Bovendien eencellige analtion over een grote populatie van cellen is mogelijk met een gemotoriseerde podium en beeld vast te leggen over meerdere gezichtsvelden. Widefield microscopie vereist intensiteit gebaseerde analyse van de hetero-FRET-probe signalen. Hoewel de intensiteit analyse complexe hardware zoals andere FRET methoden niet vereist, wordt meer post-acquisitie werkzaamheden die nodig zijn om te corrigeren voor de effecten van de fluorofoor gedrag en microscoop / imaging systeemconfiguraties 28. De vastgelegde emissie-intensiteit van een fluorofoor is een functie van de excitatie-energie, fluorofoor kwantumopbrengst, en de gecombineerde filter en camera / detector spectrale gevoeligheid en de lineariteit 2. Deze kunnen verschillend voor de donor en acceptor en kalibratie voor kwantitatieve analyse vereisen. Bovendien is beeldvorming van de acceptor emissie onder invloed van de spectrale overlap van de fluoroforen (excitatie van acceptor door donor excitatielicht en doordrukken donor emissie naar de acceptor emissiespectra) 2.4; Single-chain "sondes zijn intern genormaliseerd omdat hun fluoroforen zijn equimolaire op nanoschaal, terwijl de fluoroforen van" dual-chain "sondes kunnen bestaan ​​op verschillende stoechiometrieën gedurende een cel 25,28 Als de fluoroforen van." Single-chain " probes van dezelfde helderheid (functie extinctiecoëfficiënt en kwantumopbrengst), de effecten van niet-lineaire detector gevoeligheid klein en alleen correctie voor achtergrondfluorescentie en gekoppelde kwantumopbrengst / detectorsensitiviteit nodig 23. Aldus "single-chain" ratiometrische FRET probes zijn het meest eenvoudig te implementeren in groothoek microscopie 24.

Dit artikel beschrijft een eenvoudige techniek om FRET beeldvorming van levende cellen in 3D hydrogel kweken met een gebruikelijke groothoek epifluorescerende microscoop voeren. Het kan gemakkelijk worden vastgesteld door laboratoria die al het uitvoeren van FRET experimenten in 2D, maar ook laboratoria geïnteresseerd in intercellulaire signalering in microweefsels. Hier laten we de methode FRET beeldvorming gebaseerde meting van cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) niveaus in levende chondrocyten binnen fotoverknoping (PC-gel, polyethyleenglycol dimethacrylaat) en thermoresponsieve (TR-gel, Matrigel) hydrogels. Een ratiometrische FRET probe wordt gebruikt gebaseerd op Epac1 (ICUE1) cAMP niveaus in reactie op forskoline, een chemische agonist voor adenylaatcyclase die de omzetting van ATP naar cAMP katalyseert detecteren. cAMP is een van de belangrijkste second messengers mediëren G-eiwit-gekoppelde receptor-signalering en activeert verschillende factoren, waaronder stroomafwaartse uitwisseling eiwitten direct cAMP (EPACs) geactiveerd. De fluoroforen elkaar bewegen bij cAMP binding aan de EPAC domein resulteert in een afname van FRET. Hier beschreven is de bereiding van de hydrogel materialen, celtransfectie de ICUE1 probe en inbedding van de cellen in 3D hydrogels. De 3D FRET experiment procedure en de beeldanalyse nodigevalueren probe activiteit per cel toegelicht. We bespreken ook de inherente beperkingen van FRET analyse in 2D en 3D met behulp van groothoek microscopie. De techniek die hier is een verbetering ten opzichte van de bestaande methoden 2D omdat daardoor analyse in een fysiologische omgeving en vereist minder beeldcorrectie en kalibratie. Groot nut ligt in het feit dat vele transparante materialen kunnen worden gebruikt tijdens cel en transfectie voorkeuren kunnen worden gehandhaafd.

Protocol

1. Materialen Voorbereiding Bereid polyethyleen glycol dimethacrylaat (PEGDM, 4000 mw) van methacrylating polyethyleenglycol volgens werkwijzen beschreven door Lin-Gibson et al. 29. Als alternatief kan PEGDM worden aangeschaft. Synthetiseren fotoinitiator, lithium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), door middel van twee stappen waarbij eerst dimethyl phenylphosphonite reageren met 2,4,6-trimethylbenzoyl choride via een Michaelis-Arbuzov-reactie en het lithiumzout gemaakt door toevoeging lithiumbromide in 2-butanon, overeenkomstig Majima et al. 30. Let op: Als alternatief kunnen andere foto-initiatoren worden gekocht, maar LAP toont betere biocompatibiliteit en het verknopen van de efficiëntie 31. Functionaliseren de dekglaasjes om binding van de hydrogel mogelijk om het glas en daardoor beweging tijdens beeldvorming voorkomen. In een chemische kap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, het gebruik3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylaat volgens het protocol van de fabrikant voor PC-gels en epoxysilanen (3-glycidoxypropyltrimethoxysilaan) voor TR-gels 31. Let op: Als alternatief kunnen voorgelakt dia's worden aangeschaft. Merk op dat het dekglaasje groter is dan de bron van het PDMS schotel in Stap 3,8 moet zijn. 2. Cel Transfectie In een weefselkweek kap en met steriele technieken, ontdooien en plaat de gewenste cellen bij sub-confluentie (50-70%), hierin runder chondrocyten bij 15.000 cellen / cm2 in 6-well niet-behandelde kweekschalen. Opmerking: Alle relevante celtype kunnen worden gebruikt, met inbegrip van verankering onafhankelijke cellen. Sta cellen herstellen gedurende één dag in een incubator bij 37 ° C. Voordat daaropvolgende stappen, verwijderen medium, spoelen met PBS, en voeg 2 ml fenol en serum-vrij medium per putje. De volgende dag voor elk putje, voeg 100 pl fenol en met serumvrij medium en 3ul transfectiereagens een geautoclaveerd glazen reageerbuis. Te mengen, schud de buis lichtjes. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Beperk eventuele blootstelling aan licht. Voeg 1 ug FRET probe-DNA en schud lichtjes. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur en weg van het licht gedurende 30 minuten. Let op: In dit experiment ICUE1 plasmide (met dank aan Dr. Jin Zhang 33) werd gebruikt. De fluoroforen in ICUE1 zijn cyaan fluorescerend eiwit (GVB, donor) en geel fluorescerend eiwit (YFP, acceptor). De verhouding van transfectiereagens tot DNA plasmide deze aanpassing nodig heeft voor optimale transfectie van verschillende celtypen. Verdeel het bereide mengsel (~ 104 ul) druppelsgewijs aan elk van de 6 putjes die cellen plus 2 ml fenol en met serumvrij medium. Niet pipet op en neer. Zwenk de plaat te mengen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 48 uur. Opmerking: Confluentie remt transfectie-efficiëntie en verandert endogene expressie van receptoren. 3. Fabricage vanPDMS Mallen voor Hydrogel Gieten en Cultuur Om een ​​grote glazen schuif naar de polydimethylsiloxaan (PDMS) gegoten op, reinig het glas eerst met zeep, spoelen met een ruime hoeveelheid water en daarna droog met isopropanol, gevolgd door de lucht te bereiden. Behandel het glas met een siliconiseerproces reagens volgens het protocol van de fabrikant zodat de PDMS gemakkelijk kan worden afgepeld na uitharding. Spoel resterende reagens af van het oppervlak met tolueen over een stroomgebied container. Laat het oppervlak aan de lucht drogen voordat of gebruik maken van warmte bij 100 ° C om de wachttijd te verkorten. Selecteer een hydrogel hoogte (bijvoorbeeld 1 mm) en bereken 1,2 maal het volume van PDMS nodig glasplaatje met PDMS van deze dikte met de afmetingen van het glaasje en hydrogel hoogte dekken. Opmerking: PDMS krimpt niet. Meng de PDMS kit componenten bij een 10: 1 gewichtsverhouding in een bekerglas. Zodra het goed gemengd is, plaats het bekerglas onder huisarrest vacuüm ontgassen. relieve het vacuüm als belletjes beginnen om de container overlopen en te herhalen. Opmerking: Andere hydrogel diktes worden gebruikt, maar ten koste van een verhoogde achtergrond en grotere opaciteit als centrifugeren (stap 6,2) niet wordt gebruikt. Wikkel aluminiumfolie over de bodem en zijkanten van het glas om de PDMS bevatten. Giet de gewenste hoeveelheid ontgast PDMS op dit glas omgeven door folie. Meet de hoogte PDMS. Houd er rekening mee dat de hoogte van de PDMS de maximale hoogte van de hydrogel zal zijn. Als er luchtbellen worden gemaakt wanneer het gieten, ontgas opnieuw of pop ze met een spatel of naald. Plaats de uitgeharde PDMS op een vlakke ondergrond in een oven bij 100 ° C gedurende 2 uur, of reactie bij kamertemperatuur 24 uur. Verwijder voorzichtig de PDMS van het oppervlak als het eenmaal is uitgehard. Pons de gewenste vorm (bijvoorbeeld cilindrische punch van 3 mm) voor de hydrogels. Opmerking: fotoverknopen zal iets smaller PC-gel cilinders opleveren dan de mal diameter te wijtentot uitdoving van de reactie van moleculaire zuurstof in het PDMS. Steriliseer de geponste PDMS. Voor korte termijn experimenten PDMS onderdompelen in 70% ethanol gedurende 1 uur. Monteer de mal aanbrengen van de basis van de gesteriliseerde PDMS met een steriele glazen dekglaasje met een dikte afgestemd op het microscoopobjectief correctie. gereserveerd voor gebruik in stap 6. Fabriceren grotere schaal PDMS bovenstaande methoden (met een goed breder en langer dan de hydrogel) aan de hydrogel en medium bevatten. Geschikt voor een gemiddeld volume tenminste 10 keer meer dan de hydrogel de hydrogel onder te dompelen en verdunning van analyt minimaliseren. 4. Bereiding van Hydrogel voorloperoplossingen In een weefselkweek kap en met steriele technieken, bereid de hydrogel precursor oplossingen geschikt voor de studie onmiddellijk vóór het toevoegen van cellen. Bereid PC-gel van het polymeer precursor als volgt. Meng PEGDM poeder in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,2) en 10% (w / v). Voeg de foto-initiator (bijv LAP) bij een eindconcentratie van 0,005-0,01% (w / v) en mengen door pipetteren. Bedek de oplossing met aluminiumfolie of afscherming van licht als LAP is lichtgevoelig. Opmerking: Hier de TR-gel verminderde groeifactor extracellulaire matrix wordt gebruikt zoals door de fabrikant. 5. Cell Suspension in Hydrogel Solutions In een weefselkweek kap en steriele technieken zuig het medium uit de putjes. Voeg PBS aan de putjes en daarna naar een spoel bevestigd celmonolagen. Distantiëren de cellen uit de kweek ondergrond met 2 tot 3 ml per 25 cm 2 cel dissociatie oplossing. Wiegen, vervolgens incuberen bij 37 ° C gedurende 10 – 20 minuten of tot gedissocieerd. Tik stevig gerecht indien nodig om cellen te verwijderen. Opmerking: Alternate cel dissociatie oplossingen beschikbaar zijn met de selectie beperkt tot degenen die dat niet doen ivan effectbeoordelingen de signaleringsroute onder analyse door het splitsen receptoren van belang. Nadat de cellen zijn vrijstaand, voeg 2 ml fenol en serum-vrij medium, schorten de cellen, en te tellen cellen met een hemocytometer. Opmerking: Chemisch gedefinieerde serumvrij medium (bijvoorbeeld, aangevuld met insuline, transferrine en selenium) kunnen ook worden gebruikt. Aliquot het gewenste aantal cellen op basis van het celtype in steriele flesjes en pellet (bijvoorbeeld 2,0 x 10 6 cellen per flesje). Verwijder de bovenstaande vloeistof, voeg de gewenste omvang van de hydrogel voorloper op te schorten en de cellen door pipetteren. Gebruik een hoeveelheid precursor die 2 x 10 5 cellen / cm2 oplevert in het xy-vlak bij het ​​visualiseren van de z-as van de hydrogel als ingestort (bijvoorbeeld 1,0 ml per flesje voor een 1 mm dikke hydrogel bevattende 2 x 10 6 cellen / ml). Zorg ervoor dat u luchtbellen te produceren. Snel door naar de volgende stap om negatieve effecten op cellevensvatbaarheid 34 beperken </ Sup>. 6. Hydrogel Voorbereiding In een weefselkweek kap en het gebruik van steriele technieken, voeg de cel-bevattende hydrogel voorloper van de gietmallen bereid in stap 3 (bijvoorbeeld 7,1 ul per 3 mm diameter x 1 mm hoog schimmel). Een extra hydrogel, volgens dezelfde werkwijzen beschreven, te gebruiken voor microscoop beeldvormingssysteem ijking en ijking sonde (probe als de inherente efficiency onbekend). Centrifugeer de voorbehandelde cellen bevattende hydrogel precursor voorafgaand aan gelering / verknoping te optimaliseren door beeldvorming beperken cellen één brandvlak en het minimaliseren van het vliegtuig signaal (figuur 1). Pas centrifugeertijd en kracht om het celtype en de viscositeit van de precursor (400 g gedurende 4 min). Gel of verknopen van de oplossing Voor de PC-gel hydrogel, bestralen het cel voorloper met een UV-A lichtbron (λ = 365 nm) gedurende een reactietijd gelijk aan3.2 J / cm2 per millimeter dikte photocrosslink. Opmerking: Gebruik een 1 mm minimale dikte in de berekening. Vorderingen tot in de 1-5 min bereik vallen. Gebruik de minimale belichtingstijd. Vermijd over-bestralen van de cellen, omdat dit zal levensvatbaarheid verminderen en bleken het GVB donor. Echter, de blootstelling keer minder dan 60 s niet aan te raden, omdat een hoge intensiteit straling leidt tot radicale zelf-harden en slechte levensvatbaarheid van de cellen. Voor de TR-gel hydrogel, plaats de gevulde vorm in een petrischaal en verhuizen naar een incubator thermisch gelate. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na geleren of verknopen van de hydrogel, verwijder de PDMS hydrogel gietvorm en te vervangen door de voorbereide grotere PDMS schaaltje (uit stap 3.5). Druk op de PDMS naar beneden op het glas met een steriele spatel om het te hechten. Plaats dit PDMS schaal met dekglaasje in een steriele houder, zoals een petrischaal. Add fenolvrij serumvrij medium of chemisch gedefinieerde medium (serumvrij medium aangevuld met insuline, transferrine en selenium (stap 5,4)) naar de put gemaakt met het PDMS schaal en dekglaasje de hydrogel ondergedompeld houden. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Opmerking: Bij gebruik van een speciale schotel met een dekglaasje, plaats dan de dekglaasje in die en op soortgelijke wijze toe te voegen medium. Anders, voert u deze stap de dag voordat FRET beeldvorming, zodat de sondes te herstellen als de bestraling golflengten overlappen met het GVB donor excitatie spectrum. 7. 3D FRET Imaging Verwijder de PDMS gerecht met de hydrogel uit de petrischaal, bereid in stap 6.4, en zet hem in een verstelbare specimen houder voor de XY microscoop podium (figuur 2). Plaats het monster houder op de microscoop podium. Smeer het doel indien nodig. Gebruik een doelstelling van ten minste 40x en hoge numerieke apertuur (NA) (dat wil zeggen 1,3 NA) aan de relatief zwakke fluorofoor vangene-uitstoot. Configureren van de gezichtsveld (EPB) voor het verkrijgen: Selecteer de cellen voor beeldvorming met behulp van doorvallend licht imaging en controleer transfectie met fluorescentiebeeldvorming. Minstens 15 verschillende cellen. Selecteer de cellen die noch te licht, noch te zwak (die anders zou kunnen leiden tot probe oververzadiging of een lage gevoeligheid) en met de FRET verhouding tussen 0,0 en 1,0 (die anders aangeeft beschadiging of verval van het binaire sonde). Schakel dan het licht uit om de blootstelling te beperken. Select EPB dicht bij het ​​centrum van de hydrogel en de cellen van belang in het relatief vlakke belichtingsveld (zie Figuur 3B en Stap 9.2 hieronder). Configureren van de camera-instellingen voor het beeld FRET kanalen. U kunt kiezen uit een paar cellen in de buurt van het centrum van het FOV naar de "optische configuraties" (dwz., Belichting en gain per beeld kanaal) te optimaliseren. Opmerking: De onderstaande nomenclatuur varieert dependinG op de software waarmee de microscoop en de camera bedient. De microscoop software, NIS-Elements, wordt hier gebruikt voor het vastleggen en analyseren. FRET analyse van enkele keten probes, selecteert twee beeld kanalen per FOV: gedoofd emissie (QE), de donor emissie onder excitatie donor en acceptor emissie onder excitatie acceptor (Aem). Opmerking: Voor de ICUE1 GVB-YFP sonde, een CFP excitatie en emissie filter paar voor QE (418-442 ex, 458-482 em) en een YFP excitatie en emissie paar voor Aem (490-510 ex, 520-550 em) worden gebruikt. Stel de belichting voor QE en AEM de maximale intensiteit van het signaal zonder verzadiging te verwerven (en als het gebruik van een CCD, met de minimale mogelijke winst) op de achtergrond ruis te minimaliseren. Houd de optische configuratie voor beide fluoroforen en gedurende het experiment, alsook tussen experimentele groepen te vermijden voorspannen van het resultaat (bijv excitatievermogen, iris grootte, belichting en camera gain) (Figure 3A). Acquire additional image kanalen mogelijk te maken voor meer analyse mogelijkheden na de overname (bijvoorbeeld gecorrigeerd gesensibiliseerd emissie (CSE) beeldvorming (zie Discussie)). Voor de ICUE1 GVB-YFP sonde, het verwerven van de excitatie (Ex) en emissie (Em) kanalen van Ex donor – Em donor (QE, selecteer GVB-GVB in de microscoop software), Ex donor – Em acceptor (SE, selecteert CFP- YFP), Ex acceptor – Em acceptor (AEM selecteer YFP-YFP) en Ex acceptor – Em donor (YFP-GVB) configuraties (zie figuur 3A). Configureert de vangst tarief voor time-lapse beeldacquisitie. Verlaag de vangst tarief als beperkt door de hardware. Voor de korte termijn assays (bijvoorbeeld 30 – 60 min), duiden ongeveer 12 acquisities per minuut voor elke FOV (5 sec sampling rate) te signaleren kinetiek vast te leggen. Gebruik de minimale sampling rate nodig signi te vermijdenficantly fotobleken de sonde. Stel de overname snelheid door het intikken van de periodiciteit van de vangsten in de microscoop software. Voor de lange termijn assays (bijv. 24 uur), te beginnen met de hoge overname tarief voor de eerste puls reactie vast te leggen en vervolgens over te schakelen naar een lage overname tarief, bijvoorbeeld om de 5 tot 10 minuten. Selecteer "Nu uitvoeren" in de microscoop software om het beeld acquisitie en beelden vast te leggen initiëren gedurende 5 minuten naar een basislijn voor sonde reactie op de aangewezen EPB vast te stellen. Na 5 minuten van het beeld acquisitie, pipet in de gewenste agonist of antagonist te analyseren (bijv Forskolin bij 100 nm), meng door pipetteren, en verder beeldvorming. 8. FRET Calibration System Calibration: Gebruik de extra kalibratie hydrogel, vervaardigd zoals beschreven in stap 6, tot AEM beelden te verwerven van ten minste 6 representatief cellen met dezelfde FOV criteria, optische configuraties en camera settings voor FRET beeldvorming hierboven (stappen 7,1, 7,2 en 7,3). Opmerking: Kwantificering van de quantum yield en spectrale gevoeligheid (QS) voor de gecombineerde sonde en microscoop imaging-systeem is nodig voor "absolute" FRET analyse, maar niet voor "relatieve" FRET. Photobleach de acceptor fluorofoor door het selecteren van een 5 min lange blootstelling aan het excitatielicht op volle intensiteit (excitatie op Aem kanaal). Gebruik een smalle opening om alleen de cellen van belang bleken. Controleer of de Aem signaal ten minste 10% lager is dan het oorspronkelijke signaal door vergelijking van de signaalintensiteit histogram ( "LUT" window) voor en na fotobleken. Doorgaan fotobleken als signaalverlies is minder dan 90%. Opmerking: Controleer de donor fluorofoor wordt tijdens deze procedure niet gebleekt met Aem excitatie filters die niet overlappen met de donor excitatiespectrum. Verwerven donor emissie onder donor excitatie met de inmiddels gebleekte acceptor fluorofoor (Dem) onsing dezelfde optische configuratie als voor QE in stap 7.3. Bereken QS per pixel als Dem gedeeld AEM na achtergrond correctie, zoals in paragraaf 9 hieronder. QS = Dem / Aem Bereken de gemiddelde QS tussen de cellen van het cellulaire gemiddelden. Schat de inherente FRET efficiëntie van de sonde (Ei) met de kalibratiemonster. Induceren maximale FRET van de sonde en het berekenen van Ei = 1 – QE / (AEM x QS) als in paragraaf 9 hieronder. Anders, gebruik Ei = CSE / AEM of Ei berekend met behulp van een conventionele eindpunt assay voor FRET efficiëntie met Ei = 1 – (QE / Dem). Noot: Ei is nodig om de absolute fractie van geactiveerde probes (FAP, dwz fractie van probes bindende analyt) te kwantificeren, maar niet noodzakelijk "relatieve" FRET analyse. Verzadigen peilreactiesignaal door het stimuleren van de kweek met een agonist analyt productie / activering probes die toenemen in FRET na interactie met een analyt. Remmen sonde interaction de analyt via een antagonist van signalering voor probes die afnamen in FRET bij binding van de analyt. Opmerking: Bij de ICUE1 probe onderdrukken cAMP niveaus met een adenyl cyclase inhibitoren zoals 2 ', 5'-dideoxyadenosine (specifiek) of 3-isobutyl-methyl-xanthine (niet-specifiek). 9. FRET Ratio Berekening Tekenen en wijst een interessegebied (ROI) per FOV bij de cellen aan het achtergrondniveau (figuur 3B) in elk FOV tijd definiëren, maar het ROI naar het gebied van relatief homogene belichting beperkt boven het midden van het beeld (Figuur 4A ). Zie de bespreking voor een uitleg van de achtergrond correctie opties. Met de microscoop software: Selecteer de pijl op de "Background ROI Icon" en selecteer "Trek Elliptical Achtergrond ROI" (andere vormen zal werken). Zorg dat "Keep Achtergrond Offset bijwerken" is geselecteerd. activeren vievleugel van de achtergrond ROI door te klikken op het pictogram Achtergrond ROI. Anders, gebruik dan de "ROI Icon 'en de ROI eigenschappen in te stellen als' gebruiken als achtergrond ROI" en "ROI's zijn verschillend in elk multipoint". Met ImageJ: Gebruik de werkbalk om de cirkelvormige tekening gereedschap te selecteren. Voeg vervolgens de vorm van de ROI manager via het menu 'Analyseren → Extra → ROI Manager ". Stel een andere kleur voor de achtergrond ROI in de ROI Manager indien gewenst. Voor elke FOV en het kanaal (bijv QE en AEM), aftrekken van de gemiddelde waarde in de achtergrond ROI per time-point om een gecorrigeerd beeld per kanaal te maken, bijvoorbeeld, SQE t, p = QE t, p – BQE t, p waarbij t de acquisitietijd, p is de FOV (dwz xy positie) en BQE en bAem de scalaire waarden van het signaal binnen de achtergrond ROI. Gebruik de afbeelding rekenkundige functies die beschikbaar zijn in de software. wet de microscoop software, gebruik dan de "ROI Achtergrond Icon" en selecteer "Aftrekken Achtergrond Met behulp van ROI". In de pop-up venster, selecteer "Every Image" onder "Aftrekken achtergrond ROI op" en selecteer "All frames" onder "toe te passen". Opmerking: Een achtergrond ROI dient in elk FOV worden gedefinieerd voor deze functie goed te laten werken (bijvoorbeeld de functie niet naar behoren achtergronden aftrekken voor FOV met achtergrond ROI als sommige FOV hebben ongedefinieerde achtergrond ROI.). Met ImageJ, gebruik dan de "BG aftrekken van ROI" macro geschreven door Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/). Sla de gecorrigeerde tijdreeksen van beelden door "Opslaan als" voor de volgende analyse stappen selecteren. Definieer een ROI rond de cel met behulp van een binair masker voor elke cel wordt geanalyseerd per FOV (figuur 4B). Gebruik het beeld per FOV de AEM kanaal drempel bij het begin of het experiment, identificeren van de cel grenzen en de definitie van de ROI. Sla de ROI. Met de microscoop software: Voor elk frame (dat wil zeggen, FOV), gebruikt u eerst het menu "Binary → Define Threshold" en selecteer "van toepassing zijn op huidige frame". Pas de onderste drempelwaarde om de cellen te selecteren. Maak dan gebruik van de functie "Binary → Sluiten" in het binaire masker in de gaten op te vullen indien nodig. Volgende u het pictogram ROI "Kopiëren Binary om de ROI" te selecteren; de binaire laag wordt automatisch verwijderd. Voeg ROI voor de volgende beelden gebruikt om de bestaande pool van ROI. Verwijder eventuele valse ROI. Volgende "rechts-klik 'op de ROI en ervoor zorgen dat hun eigenschappen worden" Gebruik als Standard ROI "en" ROI's zijn verschillend in elk multipoint ". Met ImageJ: Voor elke FOV, eerst gebruik maken van het menu "Beeld → Aanpassen → Drempel". Maak dan gebruik van 'Analyze → Analyseer Deeltjes "met Toon Contouren en Toevoegen aan Manager geselecteerd. Gebruiken"Binary → Sluiten" om in "gaten" in te vullen in het binaire masker indien nodig. Verwijder valse ROI. Gratis plugins zijn beschikbaar om dit proces te automatiseren. Bereken de QE gebaseerde FRET ratio op elke pixel, SQE / Saem voor relatieve analyse (zie stap 10) en E QE = SQE / (QS x SAEM) voor absolute analyse (zie Stap 10) met QS verkregen in stap 8.1. Gebruik floating point verdeling van de beelden. Zie de discussie sectie voor een toelichting op de verhouding afleidingen. Met de microscoop software: Gebruik het menu "Afbeelding → Afbeelding Operations" en selecteer "Floating Point". Met ImageJ: Gebruik ofwel de "Process → Afbeelding Calculator" functie of de "Calculator_Plus.java" plugin. Opmerking: Als alternatief macro "pH_ratioMacro" .txt "kunnen worden aangepast om de FRET verhoudingen berekenen wendt de achtergrondcorrectie macro hierboven beschreven en is verkrijgbaar bij. Exporteer de gemiddelde verhouding per cel (dat wil zeggen, per ROI) in een spreadsheet en grafische software. Met de microscoop software: Gebruik ofwel de ND export knop in de "ROI Statistics" analyse controle of de knop "Spreadsheet Export" in de "Time Analysis" analyse controle. Met ImageJ: Selecteer eerst het menu "Analyseren → Set Metingen" en zorg ervoor dat "Gemiddelde waarde" en "standaarddeviatie" zijn geselecteerd. Maak dan gebruik van de ROI Manager en selecteer de knop "Measure". Sla de gegenereerde resultaten venster. 10. FRET Ratio Analyse Bereken de gemiddelde mobiele FRET-ratio in de tijd van de gemiddelde ratio's per cel (geëxporteerd in stap 9.4). Beschouw de basislijn FRET ratio (de verhouding Alvorens de analyt) in deze berekening. Opmerking: Spreadsheet en grafische software wordt hier gebruikt om de basislijn-subtr plothandelde gemiddelde FRET verhoudingen en de standaardfout van het gemiddelde (SEM) met een lineaire regressie op de basislijn zoals in stap 10.1.2 en 10.1.3 hieronder (figuren 5 en 6). Relatieve Analyse (magnitude van de respons): Normaliseer elke curve van een gemeenschappelijk referentiekader monster (bv onbehandeld monster.). Absolute Analyse (tijdsverloop van de respons): Shift de rondingen van een gemeenschappelijk beginpunt door het normaliseren van elke curve met zijn basislijn FRET-ratio. In de spreadsheet en grafische software, doorschieten van de gegevens (kolommen van de gemiddelde ratio's per cel) met nieuwe kolommen, zodanig dat elke oorspronkelijke kolom is gekoppeld aan een nieuwe kolom met alleen verhouding gegevens voor de referentieperiode (verhoudingen voordat analyt toegevoegd). Selecteer "Insert Column" naar een lege kolom wilt invoegen na elke kolom met gegevens. kopieert vervolgens de basisgegevens in de gepaarde lege kolommen. In de spreadsheet en grafische software, selecteer "Insert → Nieuw Analyse → Transform Verwijder de baseline "en vervolgens" Geselecteerde kolom "tot" alle andere ", selecteer" aannemen dat de basislijn is lineair ", en selecteer" Difference "onder" Calculation ". Bereken de gemiddelde mobiele ratio en beschrijvende statistiek. In de spreadsheet en grafische software, kies "Invoegen → Nieuw Analyse → XY Analyses → Rij Middelen met SD- of SEM" en selecteer vervolgens "Row betekent met SEM" in het pop-up venster.

Representative Results

Alle hydrogel voorlopers, cellen en spuitgieten werden bereid zoals hierboven is beschreven. De cel beladen voorloper oplossingen werden gegoten in PDMS mallen en vervolgens gecentrifugeerd voordat gelering / fotoverknopen om cellen te immobiliseren in de buurt van het dekglaasje en FRET vergemakkelijken imaging-analyse (figuur 1). De hydrogels met aangehechte dekglaasjes werden bereid in PDMS imaging putjes microscopische beeldvorming (Figuur 2) geplaatst. De optische configuraties en beeldopname parameters werden vervolgens zoals getoond in figuur 3A. Vastleggen van alle vier FRET aanverwant kanalen voor CFP-YFP fluorofoor paren wordt aangetoond (zie onder "Optical Conf." In figuur 3), als nodig is voor niet-binaire probes. Maar in dit werk slechts twee beelden nodig zijn voor de enkele keten binaire ICUE1 probe, QE = "CFP CFP" en AEM = "YFP YFP" (excitatie emissie). Meerdere EPB (xy posities) geselecteerd waarin meerdere cellen verbleven in het homogene verlichtingsgebied (Figuur 3B). Na de time lapse overname, werd het signaal gegevens voor de sonde geëxporteerd. ROI voor achtergrondcorrectie van kanaalsignalen en celanalyse aangewezen behulp thresholded Aem beelden van het begin van de experimenten (figuur 4). Cellen gekozen uit de celpool die welke expressie voldoende (niet te zwak), maar niet te hoog is (te lichte) probe (Figuur 4B). De QE en SE FRET-ratio's per pixel bij elke overname werden berekend met behulp van floating-point deling van de achtergrond afgetrokken afbeelding kanalen. De gemiddelde FRET-ratio per cel (dat wil zeggen, per ROI) werd berekend, genormaliseerd naar de basislijn signaal voorafgaand aan stimulatie (dwz een regressie op de basislijn afgetrokken van alle tijd-punten), en uitgezet met fout bars als de standaard fout van de gemiddelde (SEM). Zowel de QE en CSE gebaseerde FRET verhoudingen detect de verhoogde cAMP activiteit chondrocyten onder forskoline stimulatie (100 nM, figuur 5). De QE FRET ratio gevoeliger voor achtergrondcorrectie dan de CSE FRET verhouding omdat de QE signaal lager was te wijten aan de lage basale niveau van cAMP activiteit chondrocyten ingebed in de hydrogelen. Beide types hydrogel (TR-gel en PC-gel) werd een verhoogde FRET verhouding in de tijd (Figuur 6), wijst op een verhoogde cAMP signalering reactie op de toevoeging van forskoline. Zoals de QE FRET verhouding chondrocyten in PC-gel hydrogelen vertonen een grotere verandering in cAMP (getoond) en een hogere basale niveau van cAMP (E QE = 0,19 in PC-gel versus E QE = 0,09 in TR-gel, niet getoond in de basislijn afgetrokken figuur). Figuur 1: Cell Distribution in fotoverknoopte Hydrogel (PC-gel) </strong> A: De cel geladen hydrogel voorloper werd gecentrifugeerd om het aantal cellen te maximaliseren in een brandvlak bij de dekglaasje. B: Dit verhoogt het aantal cellen in het FOV en minimaliseert achtergrondsignaal uit uit het vlak cellen. (Schaal bar = 200 micrometer) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Hydrogel in PDMS Dish De hydrogel werd geplaatst in een hoog PDMS goed (10x volume hydrogel) met een dekglaasje basis voor microscopische beeldvorming en analyseren stimulatie. De PC-gel hydrogels transparant en gehecht aan het dekglaasje zodat zij gedurende de test op hun plaats blijven. De PDMS goed kan groter worden gemaakt dan 10x medium de hydrogel volume met een grotere punch biopsie naast ten bevattenhicker PDMS vel. (Schaal bar = 2 mm) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Overname configuratie voor FRET Imaging A: De overname is geconfigureerd voor het vastleggen elke 7 seconden op meerdere locaties. Voor QE FRET-ratio berekening, worden slechts twee beeld kanalen die nodig zijn voor de ICUE1 probe hier gebruikt (binair enkele keten sonde), QE = "GVB GVB" en AEM = "YFP YFP" (excitatie emissie) onder de "Optical Conf." kolom in de tab λ van de microscoop software. B: EPB ( "XY" stand) geselecteerd waarin meerdere cellen verbleven in het homogene verlichtingsgebied. Het perceel onder de afbeelding toont de lichtintensiteit langs de blauwe pijlen lijndat doorkruist door het centrum van de FOV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Selectie van ROI voor FRET Imaging Analyse A: Een gebied van belang (ROI) vrij van cellen werd geselecteerd ter correctie van achtergrondsignaal van elk kanaal. Een afbeelding van een celvrije hydrogel kan in plaats daarvan worden gebruikt voor de achtergrond aftrekking als celdichtheid of migratie hoog is, of indien een schaduw masker niet wordt gebruikt wanneer cellen niet binnen een homogeen belichtingsveld liggen. B: De cel ROI's werden geselecteerd met behulp van het drempelwaarden en binaire maskeren van de Aem kanaal. Selecteren van een ROI groter dan de cellen nadelig beïnvloeden berekening van de gemiddelde FRET verhouding per cel door opname van extracellulaire verhoudingen gegenereerd uit de achtergrond noise. Berekening van de cellulaire FRET-ratio met behulp van het gemiddelde van elk kanaal per cel wordt niet aanbevolen, omdat dit onderschat de ratio. (Schaal bar = 50 pm) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Vergelijking van FRET Ratio's in thermoresponsieve Hydrogel (TR-gel) Zowel QE en SE gebaseerde FRET verhoudingen detecteren de toegenomen cAMP activiteit in chondrocyten onder forskoline stimulatie. Forskolin is een adenylcyclase agonist die cAMP-productie induceert. FRET af wanneer de ICUE1 probe bindt cAMP, en daardoor de QE FRET verhouding (E = QE SQE / (SAEM x QS)) toeneemt. Omgekeerd, de SE FRET-ratio daalt en wordt dus uitgezet als E SE = 1 – CSE / Saem. In hydrogel ingesloten chondrocyten, het QE FRET verhouding gevoeliger voor achtergrondcorrectie dan SE FRET verhouding omdat de QE signaal laag door het lage basale cAMP activiteit. Error bars = SEM, n = 25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Vergelijking van FRET Ratio in verschillende hydrogels De chondrocyten in beide soorten hydrogel reageerde op forskoline stimulatie met een verhoging van cAMP-activiteit zoals aangetoond door de toegenomen QE FRET verhouding in de tijd. Het type hydrogel effecten de cellulaire respons door verschillende effecten, zoals verschillen in permeabiliteit voor forskoline en basale cellulaire cAMP activiteit (E QE = 0,19 in PC-gel versus E QE = 0,09 in TR-gel, niet getoond). Foutbalken = SEM, n voor TR-gel= 25, n voor PC-gel = 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit werk toont aan hoe FRET beeldvorming kan worden gebruikt om cellulaire signalering analyseren in 3D hydrogels. Hoewel eerdere studies FRET beeldvorming van cellen gezaaid op hydrogel substraten 35-37 van extracellulaire interactie met hydrogels 38 aangetoond, en moleculen opgesloten in hydrogels 39-41, dit is de eerste publicatie FRET gebaseerde beeldvorming intracellulaire analyse van cellen ingebed in beschrijven 3D-hydrogels. Het werk lost verschillende problemen implementatie bij het vertalen van FRET beeldvorming van 2D naar 3D. Eerst worden hoge apertuur doelstellingen numerieke nodig FRET beeldvorming voldoende emissiesignaal verzamelen, maar ze beperken de scherptediepte. De cellen hier mag enigszins regelen via centrifugeren om het aantal cellen in een brandvlak verhogen het venstertje te compenseren. Ten tweede kan 3D-hydrogel steigers drift over het gezichtsveld tijdens de beeldvorming die de analyse bemoeilijkt. De hydrogels hier zijn gebonden aan de coverslip zodat ze vast blijven gedurende het experiment. Ten derde, selectie van geschikte hydrogel samenstellingen voor 3D FRET is essentieel omdat hydrogels visualisatie van de cellen hinderen. Hier transparante hydrogels PC-gel en TR-gel worden gebruikt. Echter, het verzamelen van de cellen met centrifugeren om een brandvlak bij de dekglaasje kan worden gebruikt om beeld cellen in hydrogels met hogere diffraction.The keuze hydrogel afhankelijk van de micro voorwaarden waaraan moet worden gesimuleerd, die kan worden gevonden in een op 42 hydrogelen . Ten vierde wordt een alternatieve methode hier gebruikt voor het FRET verhouding van de enkele keten ICUE1 probe (dwz E QE = QE / CAEM) het aantal kanalen beeld voor de analyse te minimaliseren en daardoor minimaliseren fotobleken. De gemiddelde FRET verhouding per cel wordt berekend als het gemiddelde van de verhoudingsgetallen per pixel in een cel tot een onderschatting van de werkelijke verhouding FRET minimaliseren. Tenslotte lineaire ratiometrische analyse en middelenhet geactiveerde deel van enkelketenige binaire probes berekend, wordt beschreven.

Er zijn verschillende kritische aspecten van het uitvoeren van succesvolle FRET experimenten met groothoek microscopie. Met betrekking tot hardware, moet de camera gevoelig genoeg voor kleine signaal veranderingen lossen, waardoor nieuwere wetenschappelijke CMOS camera en elektronenmicroscopie vermenigvuldigen CCD beter dan conventionele CCD's. Om zo goed analyseren van de ruimtelijke verdeling van de FRET verhouding, moet de camera beschikken minimaal twee keer de ruimtelijke resolutie van de puntspreidingsfunctie van de doelstelling (Nyquist criterium). Dit maakt dual-view systemen minder geschikt voor de taak. Belangrijker is om een ​​juiste belichting en beeldacquisitie tarief voor de gegeven FRET paar selecteren om fotobleken van de fluoroforen te minimaliseren. Een verlaagde opnamesnelheid wordt aanbevolen als duur experiment toeneemt. Het gebruik van snelle filter wielen verhoogt de verwerving en het aantal van de EPB voor analyse, terwijl vermijdening de beeldregistratie problemen met dual-view en torentje filter blokjes. De homogene verlichting gebied bemoeilijkt correctie voor achtergrond fluorescentie die voortvloeit uit het monster autofluorescentie en camera-systeem lawaai. Sommige hydrogels, met name die welke collagene eiwitten zijn zeer autofluorescente 43,44. De FRET-ratio's worden onderschat zonder achtergrond correctie. Hier gebruiken we een eenvoudige achtergrondcorrectie die gebruikmaakt van de relatief vlakke belichtingsveld die vaak worden geconfigureerd met epi-fluorescentie verlichting over het midden van het beeld (figuur 3B, stap 7,2). Deze methode beperkt daarom cellen van belang voor degenen onder deze verlichting veld. De achtergrondcorrectie hier beschreven houdt geen rekening met cellulaire autofluorescentie in de golflengten lezen de binaire probe. In dat geval moet ongelabelde cellen (geen probe transfectie) worden afgebeeld onder dezelfde omstandigheden en de achtergrond afgetrokken. A mix van gelabelde en ongelabelde cellen kunnen worden gebruikt en ongelabelde cellen geselecteerd voor de achtergrond ROI. Alternatieve methoden die voorzien in de cel analyse over het gehele beeldveld onder andere gebruik van schaduw masker, meerdere achtergrond ROI, of identieke monsters zonder cellen en een protocol is op aanvraag beschikbaar.

Specifiek voor 3D beeldvorming FRET probe reactie is zeer gevoelig voor de hydrogel permeabiliteit voor de analyt (figuur 6). Derhalve dezelfde hydrogel gebieden worden vergeleken in experimentele behandelingen, bij voorkeur bij een bijzondere geometrische symmetrie zoals bij een steiger centrum zoals hier gebruikt. Alternatief microfluïdische kamers / bioreactoren kan worden gebruikt om snel en uniform perfuseren de hydrogel met analytoplossing 45. Een FRET signaal kan niet worden gedetecteerd (signaal-ruisverhouding is te laag) als autofluorescentie de hydrogel is te hoog; een dunnere hydrogel of andere probe (verschillende fluoroforen) worden gebruikt.Wat FRET 3D beeldvorming in fotoverknoopte hydrogels, wordt het gebruik van minimale straling blootstelling en golflengtes buiten de excitatie spectra van de probe fluoroforen aanbevolen. LAP kan worden gebruikt met een zichtbare lichtbron bij 405 nm potentiële celschade 31,46 verder te minimaliseren. Gebruikt evenwel LAP met 365 nm straling aanbevolen omdat dit minimaliseert probe bleken. 365 nm ligt aan het uiteinde van het GVB donor excitatie spectrum, terwijl 405 nm ligt op het hoogtepunt excitatie. Als alternatief kan de probe expressie worden toegestaan ​​voor de ene dag. Gebruik van binaire probes minimaliseert problemen van gevoeligheid voor verschillen in expressieniveaus en moleculaire diffusie van donor en acceptor fluoroforen. Niet-binaire probes worden gebruikt, maar in plaats van SE QE beeldvorming en aanvullende correctie voor spectrale doorbloeding van excitatie- en emissie-spectra (zie hieronder). Voorts is de lage commerciële beschikbaarheid en de complexiteit van het ontwerp FRET probeskan een belemmering. De belangrijkste factor voor een succesvolle experimenten blijft goede correctie en analyse van de fluorescentiesignalen.

Een alternatieve methode van het FRET-ratio wordt gebruikt om verschillende andere redenen naast minimalisering van fotobleken. Voor binaire enkele keten sondes, de gemelde verhouding acceptor emissie onder donor excitatie (gesensibiliseerd emissie, SE) om donor emissie onder donor excitatie (geblust emissie, QE), dat wil zeggen, FRET-ratio = SE / QE 25,47,48. SE / QE niet-lineair ten opzichte van veranderingen in FRET efficiëntie 21,22,47. Namelijk het quotiënt een exponentieel niet-lineaire relatie inherente FRET efficiëntie van de sonde (Ei) (Donius, AE, Taboas, JM gepubliceerd werk. (2015)), waarbij de verhouding meest lineaire voor Ei minder dan ongeveer 15%. SE / QE zal ook onderschatten de fractie van actieve sondes (FAP, dwz fractie van probes binden analyt). Therefore, analyse van SE / QE vereist een omslachtige evenwicht dosis-respons studie en curve fit. Gelukkig is de verhoudingen van SE of QE aan de acceptor emissie onder acceptor excitatie (AEM) zijn lineair met betrekking tot Ei en de FAP, dat wil zeggen, de FRET verhoudingen SE / AEM en QE / Aem. SE / AEM wordt vaak gebruikt voor binaire sondes en vereist alleen end-punts kalibratie (zonder sonde activiteit en volledige sonde activiteit), maar basale cellulaire signalering maakt dit moeilijk. De noodzaak eindpunt kalibratie elimineren, kan SE corrigeren (CSE) voor de spectrale overlap van de donor en acceptor excitatie en emissie spectra (spectrale doorbloeding) en de kwantumopbrengst en spectrale gevoeligheid (QS) van de gecombineerde probe fluoroforen en microscoop afbeeldingssysteem. De gecorrigeerde SE FRET laatste percentage CSE definieert de waargenomen FRET efficiëntie van de probes in elke pixel van een beeld, dat wil zeggen, E SE = cse / Aem. Commerciële en vrije software is beschikbaar om te corrigeren SE voor deze effecten ende lezer wordt verwezen naar het werk van Chen en Periasamy 2006 voor een gedetailleerde uitleg van de methoden 50. Echter, het berekenen van E SE vereist gevangenneming van drie image kanalen per time-point (SE, QE AEM). Daarom is in dit werk hebben we ook gebruik van een alternatieve FRET-ratio E QE = 1 – QE / Caem, die vangst van slechts twee beeld kanalen (QE en AEM) vereist. Het berekenen van E QE van deze kanalen vereist slechts corrigeren Aem voor QS (Caem = Aem x QS). QS = Dem / AEM is gemakkelijk geschat met behulp van twee beelden van de ene kalibratie monster, waarbij Dem is de donor emissie onder donor excitatie met acceptor gebleekt. FAP op elk moment kan worden berekend door E SE of E QE het Ei van de probe.

Uiteindelijk moet FRET-ratio selectie (E SE = CSE / AEM vs. E QE = QE / Caem) gebaseerd zijn op de bestudering van het type sonde en de kanalen met de beste signaal. zowel eenpproaches bevatten achtergrondgeluiden correctie van beelden per frame zoals hierboven beschreven om rekening te houden voor veranderingen in de autofluorescentie in de tijd. Ze nemen geen overlap van AEM excitatie licht in de Dem excitatie spectrum, wat vaak het geval is te wijten aan het ontwerp en de microscoop filter configuratie sonde. Enkele keten sondes kunnen gebruik maken en de selectie is gebaseerd op de probe-signaal (helderheid) om de camera ruis en op de achtergrond signaal op SE en QE kanalen. Voor de ICUE1 sonde en de hier gebruikte experimentele omstandigheden (cel en hydrogel types), SE heeft een sterker signaal dan QE. Dubbele ketting probes vereisen gebruik van E SE door niet-equimolaire verdeling van donor en acceptor fluoroforen. Voor probes die daling in FRET bij binding te analyseren zoals ICUE1, FRET-efficiëntie kan worden "geïnverteerd" naar een positief signaal verandering bij binding van de analyt te presenteren als wij hier doen, met E SE = 1 – CSE / AEM of E QE = QE / (AEM x QS).

Analyse van the FAP is gevoelig voor de juiste correctie van het FRET-ratio's en de raming van Ei. Het kan worden geschat met dezelfde kalibratie monster gebruikt voor QS en een conventionele eindpunt FRET efficiency test zoals Ei = 1- (QE / Dem) (QE image gevolgd door acceptor fotobleken en Dem afbeelding) 28, maar zorg moet worden genomen om zoveel mogelijk te beperken toevallige bleken van de donor. We beschrijven een aangepaste versie waarin de schatting van Dem op basis van AEM gecorrigeerd voor QS wordt vervangen, dat wil zeggen, Ei = 1 – (QE / (AEM x QS)). Alternatief kan Ei = CSE / AEM gebruikt. Schatting van Ei in levende cellen vereist dat alle sondes worden gereden om de volledige FRET. Dit is moeilijk te bereiken in de praktijk probes zoals ICUE1 die afnamen in FRET bij binding van de analyt. Een in vitro berekend op basis van het gebruik Ei cellysaten gezuiverd analyt beste, maar buiten het bereik van dit werk. Hier raden we aan 2 ', 5'-dideoxyadenosine aan cAMP in de cellen te verminderen. Echter, zou een relatieve FAP be berekend aan de hand van een Ei schatting afgeleid van het basisniveau van de signalering. Daarom onderzoeken geven meestal het FRET verhouding (vanaf hier gedaan) of een relatieve FAP gebaseerd op eindpunt kalibratie, waarbij de signalering basislijn voor het toevoegen agonist de ondergrens en het signaal na toevoeging van een tweede agonist die signalering verzadigd wordt het bovenste gebonden. Forskoline wordt vaak gebruikt als controle agonist cAMP signaal verzadigen. Alternatief kan een cAMP analoog worden gebruikt, zoals 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-cyclisch monofosfaat. Positieve controles gebruikt bij voltooiing van studies om mogelijke veranderingen in de signaalweg tussen experimentele behandelingen identificeren worden aanbevolen.

Berekening van de gemiddelde signalering reactie per cel moet rekening worden gehouden met verschillende factoren. Eerst wordt het gemiddelde FRET verhouding worden berekend als het gemiddelde van de verhoudingen van elke pixel in een cel, dat wil zeggen, (Σ (QE/cAem)) / (aantal pixels), in plaats van de ratio van de gemiddelde QE en AEM in een cel, dat wil zeggen (ΣQE) / (ΣcAem). Hoewel de laatste voorzichtig maskeren niet nodig als achtergrond ruis laag is, ernstig onderschat de werkelijke gemiddelde FRET-ratio. Echter, pixel verhoudingen vereisen floating-point berekeningen en zorgvuldige binaire maskeren van de cel gebied om de ROI te bepalen en de opname van valse verhoudingen gegenereerd op basis van achtergrondruis buiten de cel te voorkomen. De gehele cel gebied moet worden gekwantificeerd om vertekenende resultaten op mobiele vorm te vermijden. Het maskeren moet mogelijk opnieuw worden gedefinieerd in de tijd, afhankelijk van veranderingen in cel vorm en migratie. Als alternatief kan ROI's groter zijn dan de cel gebruikt worden als uitsluitingscriteria worden gedefinieerd om pixel verhoudingen van QE en AEM signalen die vallen ver onder de cellulaire niveaus en zijn in de buurt van het achtergrondniveau verwijderen. De beschreven analysemethoden detail de basisstappen die in dit werk voor FRET analyse zonder gespecialiseerde software / plugins. Microscoop fabrikanten en andere leveranciers verkopen add-on modulevanwege hun microscoop software, die automatisch ratiometrische ondersteunen en FRET-analyse. Ook het publieke domein ImageJ software heeft diverse plugins beschikbaar voor deeltje en FRET analyse, zoals RiFRET. Ten tweede, de op pixels gebaseerde FRET gemiddelde verhouding onderschat de werkelijke gemiddelde verhouding van de 3D celstructuur omdat een 2D-beeld wordt gebruikt. Het 2D signalen representeren en gemiddeld langs de z-as. Berekening van de 3D ​​ruimtelijke verdeling van FRET verhoudingen in levende cellen kan niet zonder snelle 3D beeldvorming (bv., Middels draaiende schijf confocale microscopie). Dit is een probleem voor zowel 2D- als 3D culturen, maar heeft een groter effect in 3D als meer van de celstructuur bestaat uit het vlak. Dit is van groot belang voor probes die lokaliseren naar cellulaire structuren, zoals de plasmamembraan Epac1 probe PM-ICUE. Zie Spiering et al. 2013 om suggesties te corrigeren voor celdikte effecten op de verhouding tussen berekeningen 24. Analyse van de verdeling van Aem kan worden gebruiktdetecteren of probe accumuleert in gebieden van de cel en beeldvlak gecorrigeerd. Dit zal ook helpen om de ruimtelijke verdeling van FRET verhoudingen interpreteren en valse resultaten te elimineren, bijv., Het identificeren van sonde verzadiging (dat wil zeggen, zal een lage streek Aem lage concentratie sonde te gebruiken en kunnen sonde verzadiging en hoge FRET-ratio vertonen). Ten derde, verschillende FRET uitgangswaarden kan een verschil in transfectie-efficiëntie te geven, sonde uitdrukking of basale signalering tussen experimentele groepen. "Relatief Analysis" (Stap 10.1.1) helpt bij het verwijderen drift in de FRET-ratio in de tijd, indien aanwezig. Het vergemakkelijkt de vergelijking van de relatieve grootte van de reacties tussen de monsters, maar belemmert vergelijking met het tijdsverloop van de respons van het referentiemonster (controle plot is een vlakke lijn). "Absolute Analysis" (Stap 10.1.2) vergemakkelijkt de vergelijking van de snelheid van de respons over monsters, maar belemmert de vergelijking van de omvang van het antwoord, want elke regel wordt geschaald door een dissimilar constant. Studies gebruiken vaak een lineaire regressie op de basislijn te corrigeren voor drift in de FRET verhouding in de tijd.

De beschreven werkwijze 3D FRET is een nuttige en praktische wijze te vervaardigen en uitvoeren van time-lapse beeldvorming van cellen beladen 3D hydrogels, die kunnen worden toegepast op andere sondes en beeldvormingsmodaliteiten. Andere FRET systeem naast enkelketenige binaire probes complexere correctie intensiteit gebaseerde signalen vereist, zoals hierboven besproken. Als alternatief kan de fluorescentie levensduur imaging van FRET (FLIM-FRET) worden gebruikt om de FRET-efficiëntie te berekenen via een verandering in de emissie levensduur van de sonde donor. In tegenstelling tot de intensiteit gebaseerde FRET, FLIM-FRET is ongevoelig voor ruis, spectrale bloeden-through, quantum efficiency, en de detector spectrale gevoeligheid 2. Echter, FLIM systemen zijn duur, ingewikkeld en ongewoon, en het beste werken met fluoroforen met enkele exponent verval en geen FLIM run-off 49. De beschreven werkwijze kan ook worden gebruikt met more geavanceerde microscoop platforms (bijv., FRET-TIRF, fluorescentie anisotropie, en spectrale correlatie FRET). Het toepassen van deze methode om 3D-beeldvorming met hoge snelheid confocale microscopie en multi zal een analyse van de sub-cellulaire distributie van signalering reactie te vergemakkelijken en verhoging van de nauwkeurigheid van de signalering analyse. Deze 3D FRET methode in staat zal stellen geavanceerde celbiologie studies in gesimuleerde 3D-cellulaire micro-omgevingen. Als zodanig kan deze gemakkelijk worden toegepast op farmacologie en regeneratieve geneeskunde behoeften, zoals bestuderen intercellulaire signalering en screening geneesmiddelenrespons in gemanipuleerde hydrogel gebaseerde microweefsels.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen de financiële steun van de School of Dental Medicine aan de Universiteit van Pittsburgh, de National Institutes of Health award K01 AR062598 en subsidie ​​P30 DE030740. De auteurs danken ook Dr. Jin Zhang voor de ICUE1 plasmide, Wayne Rasband voor het ontwikkelen van ImageJ en Michael Cammer voor de ImageJ macro.

Materials

Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 mL, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ=365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. . Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O., Capri, A. . Progress in Molecular and Environmental Bioengineering – From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. , 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K., Nagamune, I. E. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. 119, 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators – Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X., Burdick, J. A., Mauck, R. L. . Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. , 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).

Tags

FRET Imaging3D HydrogelsIntracellular SignalingBiologia dello sviluppoPharmacologyRegenerative MedicineBiomaterialsDrug ScreeningWide Field MicroscopyHydrogel CastingCell SuspensionCrosslinkingUV ExposurePDMS DishPhenol-free MediumMicroscope ImagingFRET Ratio

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image