Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in<em> Pseudomonas aeruginosa</em

Opmerking: Procedure voor het kloneren en transformatie van het gezuiverde C-di-GMP reporterplasmide 12 worden elders besproken. 1. Generatie van GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain Inoculeer 5 ml lysogenie bouillon (LB) medium met een enkelvoudige kolonie van P. aeruginosa en incubeer overnacht bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm. Overdracht 2 ml van de overnacht kweek in 200 ml vers LB-medium in een 1 L kolf en incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm. Monitor optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) elke 30 minuten door een 1 ml monster uit de kolf en gaan met een spectrofotometer (zoals eerder beschreven 12). Wanneer de OD600 0,3 bereikt – 0,5, plaats 40 ml van de kweek in een 50 ml conische centrifugebuis. Pellet de cellen door centrifugeren bij 8000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C, verwijder het supernatant en re-schorten de cellen in 40 ml van ijskoude steriele, 300 mM sucrose oplossing. Pellet de cellen een tweede maal door centrifugeren zoals beschreven in stap 1.5 en resuspendeer in 20 ml van ijskoude steriele, 300 mM sucrose oplossing. Pellet de cellen een laatste keer door centrifugeren zoals beschreven in stap 1.5 en resuspendeer in 400 ul ijskoud, steriel, 300 mM sucrose oplossing. Opmerking: De celdichtheid op dit punt moet ongeveer 1 x 10 11 kolonievormende eenheden per milliliter (CFU / ml). Koel de cellen op ijs gedurende 30 minuten, waarna ze klaar voor elektroporatie. Voeg 1 pl van een 0,2 ug / ul pCdrA :: GFP plasmide 12 C oplossing van 40 ui P. aeruginosa elektro-competente cellen boven bereid in een 1,5 ml microcentrifuge buis die vooraf gekoeld op ijs is. Meng de suspensie en over in een voorgekoeld, 2 mm elektrodenafstand, elektroporatie cuvet. Opmerking: pCdrA :: GFP </em> C: pUCP22Not-P Cdra -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r GM r, die een fluorescerende uitlezing van het intracellulaire niveau van c-di-GMP in P. geeft aeruginosa stammen, werd ontwikkeld en gevalideerd door Rybtke et al. 12. Verwijderen van vocht aan de buitenkant van de cuvette met tissuepapier en plaats de cuvet in de monsterkamer van de elektroporator. Puls met een spanning van 2,5 kV, capaciteit van 25 uF en weerstand van 200 Ω. Verwijder de cuvette en voeg 1 ml van LB medium. Vervolgens overbrengen van de cellen naar een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm. Verspreid 10 ul, 50 ul en 100 ul aliquots van de kweek op steriele LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline (bij een concentratie van 100 ug / ml) en incubeer de platen bij 37 ° C overnacht. Bevestig het GFP-expressie (excitatiop 485 nm, emissie bij 520 nm) door het onderzoeken van de plaat onder een fluorescentiemicroscoop met een standaard GFP-kanaal en kies een enkele kolonie voor het enten van 5 ml LB. Incubeer overnacht zoals beschreven in stap 1.1. Meng 0,5 ml van de overnacht kweek met 0,5 ml 50% glycerol in een 2 ml met schroefdop gelast en bewaard bij -80 ° C. 2. Voorbereiding van de Starter Cultuur voor Enten Twee dagen voordat het scherm, de plaat P. aeruginosa stam (dat de pCdrA :: GFP plasmide C) vanaf de -80 ° C moederplant een LB-agarplaat (aangevuld met ampicilline bij een concentratie van 100 ug / ml) door voorzichtig verspreiden de bacteriën op de plaat met een steriele inoculatie lus. Incubeer de plaat overnacht bij 37 ° C. De avond voor de screening, het enten van een enkele kolonie van P. aeruginosa van de plaat in 10 ml LB-medium (aangevuld met ampicilline bij een concentratie van 100 ug / ml) in een tuen incubeer de voorkweek nacht bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm. Op de dag van het scherm, stelt een subcultuur van de nacht voorkweek door eerst te verdunnen met vers LB-medium tot een OD 600 van 1,0 en verdunning met 5% LB tot een OD 600 van 0,04 (01:25 verhouding) . Opmerking: Het totaalvolume van het geënte medium afhankelijk van het aantal platen te testen. 5% LB gemaakt door verdunning 100% LB met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot de gewenste concentratie. Belangrijk is dat de media (5% LB) maakt constitutieve activering van pCdrA :: GFP C in P. aeruginosa. Voeg een steriele magnetische roerstaaf in de houder en roer de kweek in minimale snelheid op een magnetische roerder gedurende 30 min bij kamertemperatuur, waardoor de bacteriën te acclimatiseren aan de media voordat ze worden gedispergeerd in 384 putjes. 3. Inoculatie en incubatie van de 384-well platen bevattendekleine Molecules Opmerking: steriliteit en een goede aseptische technieken zijn van cruciaal belang voor de volgende stappen. De positieve controle (100% remming) te bereiden, voeg 20 ul tobramycine sulfaat (25 mg / ml) tot 10 ml (voldoende voor maximaal 12 platen) van de subcultuur bereid in Stap 2,3 en meng voorzichtig. Pipetteer 40 ul van de positieve controlecultuur in putten A23 – P23 (figuur 2). Met de negatieve controle (0% remming) te bereiden, voeg 30 pl dimethylsulfoxide (DMSO) tot 10 ml (voldoende voor maximaal 12 platen) van de subcultuur bereid in Stap 2,3 en meng voorzichtig. Pipetteer 40 ul van de negatieve controlecultuur in putten A24 – P24 (figuur 2). Voor elk van de platen voorzien van de kleine moleculen, enten een volume van 40 ui van het verdunde overnachtcultures (in stap 2.3) in de putjes A1 – P22 (figuur 2). Opmerking: Dit kan worden bereikt door een vloeistofmanipulator robot. Door de heterogene eigenschappen van bacteriële culturen, is het belangrijk om een ​​continue en matig roeren bacteriën consequent verdeeld in de media, terwijl afgifte behouden blijven. Om dit te doen, blijf roeren de geacclimatiseerd cultuur uit stap 2.4 magnetisch tijdens het afgeven. Dicht de platen met een luchtdoorlatend de afdichting en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C. Opmerking: De luchtdoorlatende zegel is van cruciaal belang voor onveranderlijk voorwaarden in alle 384 waterputten te handhaven en de mogelijke ontwikkeling van zuurstof gradiënten te omzeilen over de plaat. 4. Meting van groei (OD 600) en intracellulaire c-di-GMP niveau (GFP) Ongeveer 30 minuten voor spectrofotometrische meting vooraf verwarmen de plaat lezer 37 ° C om condensatie te voorkomen. Verwijder voorzichtig de luchtdoorlatende afdekplaatafdichting voor het lezen. Meet de optische dichtheid bij een golflengte van 600 nm met een instelling van 10 flitsen per putje eneen afwikkeling van de tijd van 0,2 sec. Voorafgaand aan het meten van fluorescentie, maakt een automatische gain en focale correctie gebaseerd op goed A24 (negatieve controle) en stel de gain streefwaarde bij 75% (figuur 2). Van de plaat lezer control software, klikt u op start de meting en klik op de '' Focus en Gain Adjustment / Plate ID's 'tab'. Selecteer '' Focus Adjustment '' en '' Kanaal A '' aan de rechterkant op het raam. Selecteer '' Gain Adjustment '' en '' goed gekozen '', en typ in '' 75 '' als de '' Target waarde ''. Tot slot, kies goed A24 in de plaat lay-out alvorens te klikken op '' Start Adjustment ''. Zodra de aanpassing wordt uitgevoerd, klikt u op '' Start meting ''. Meet de fluorescentie van de GFP reporter bij een excitatie / emissie maxima van 485/520 nm met een instelling van 10 flitsen per put en een settling tijd van 0,2 sec. Verzamel gegevens van alle platen onderzocht. Opmerking: Gegevens metingen worden automatisch opgeslagen als standaard door de plaat lezer besturingssoftware. Bekijk lezingen door te klikken op het pictogram "Mars" binnen de besturingssoftware voor de statistische analyse pakket te openen. Ophalen van gegevens door "dubbelklikken" op de nummerplaat van belang zijn voor toegang tot de gegevens voor de analyse. 5. Data Analysis Evalueer de uniformiteit en reproduceerbaarheid van de test met gebruik robuuste z 'analyse, dat is de meest voorkomende metrics vermeld voor high-throughput screens. Bereken robuuste z 'met de formule: Wanneer MAD (mediaan absolute afwijking) is een schatting van de standaarddeviatie p de positieve controle (100% remming) en n is de negatieve controle (0% remming) voor zowel OD 600 en GFP vaarden. Opmerking: Een test met een robuuste z "waarde (berekend voor zowel OD 600 en GFP ruwe gegevens) groter dan of gelijk aan 0,5 wordt beschouwd als een uitstekende test. Bereken% remming van groei volgens de formule: Waar Xi OD600 is de geïtereerde OD 600 waarde van elk monster ook. % Remming OD600> 0, groeiremmer; % Remming OD600 <0, groeibevorderende. Beoordeel de% remming van het intracellulaire niveau van c-di-GMP met de formule (de verandering in fluorescentie-intensiteit arbitraire eenheden worden gecorrigeerd voor de wijziging in celdichtheid): Waar Xi GFP is de geïtereerde GFP waarde van elk monster ook. % Remming GFP> 0, c-di-GMP inhibitor; % &# 160; Remming GFP <0, c-di-GMP promoter. Stel een drempelwaarde voor een hit detectie bij 3 MAD van de mediaan (mediaan ± 3 MAD), berekend uit de steekproef belezen-outs van elke plaat, uitgaande van een normale verdeling van de data-punten. Opmerking: echter, kan een ± 50% remming cut-off geselecteerd als meer reproduceerbare en accurate dosering respons assays indien nodig.