Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em> Pseudomonas aeruginosa</em

Nota: Os procedimentos de clonagem e transformação do plasmídeo purificado repórter c-di-GMP são discutidos noutro local 12. 1. Geração de GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain Inocular meio 5 ml de caldo lysogeny (LB) com uma única colónia de P. aeruginosa e incubar durante a noite a 37 ° C com agitação a 200 rpm. Transferência de 2 ml da cultura durante a noite em 200 ml de meio LB fresco num balão de 1 L e incubar a 37 ° C com agitação a 200 rpm. Monitorar a densidade óptica a 600 nm (OD 600) a cada 30 minutos, tomando uma amostra de 1 ml a partir do frasco e analisar usando um espectrofotómetro (como descrito anteriormente 12). Quando a DO600 atinge entre 0,3-0,5, colocar 40 ml da cultura para um tubo de centrífuga de 50 mL cónico. Agregar as células por centrifugação a 8000 rpm durante 10 min a 4 ° C, descartar o sobrenadante e re a suspender as células em 40 ml de solução 300 mM de sacarose arrefecido em gelo, estéril. Agregar as células uma segunda vez através de centrifugação, tal como descrito no passo 1.5 e re-suspensão em 20 ml de solução 300 mM de sacarose arrefecido em gelo, estéril. Agregar as células de um tempo final por centrifugação como descrito no passo 1.5 e re-suspensão em 400 ul de solução de sacarose 300 mM arrefecida em gelo, estéril. Nota: A densidade celular neste ponto deverá ser de aproximadamente 1 x 10 11 unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC / ml). Relaxar as células em gelo durante 30 min, após o que eles estão prontos para electroporação. Adicionar 1 ml de A / 12 ul solução de 0,2 ^ g de plasmídeo pCdrA :: GFP C a 40 ul de P. células eletro-competente aeruginosa preparado antes, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que foi pré-arrefecido em gelo. Misture a suspensão e transferir para um pré-gelada, folga entre os eléctrodos 2 mm, cuvete de electroporação. Nota: pCdrA :: GFP </em> C: pUCP22Not-P Cdra -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r r Gm, que dá uma leitura de fluorescência do nível intracelular de c-di-GMP em P. cepas aeruginosa, foi desenvolvido e validado por Rybtke et al. 12. Remover a humidade do lado de fora da cuvete com lenço de papel e colocar a tina para a câmara de amostra do electroporador. Pulso com uma tensão de 2,5 kV, 25 uF de capacitância e resistência de 200 Ω. Retirar a cuvete e adicionar 1 ml de meio LB. Em seguida, a transferência das células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril e incubar durante 2 horas a 37 ° C com agitação a 200 rpm. Espalhe 10 ul, 50 ul e 100 ul de aliquotas a cultura em placas de LB-agar suplementadas com ampicilina estéreis (a uma concentração de 100 ug / ml), e incubar as placas a 37 ° C durante a noite. Confirmar a expressão GFP (excitatiem pelo 485 nm, emissão a 520 nm), examinando a placa sob um microscópio de fluorescência com um canal de GFP padrão e escolher uma única colónia para inocular 5 ml LB. Incubar durante a noite, tal como descrito na etapa 1.1. Misturar 0,5 ml da cultura durante a noite, com 0,5 ml de glicerol a 50% em 2 ml de um parafuso tubo superior e armazenar a -80 ° C. 2. Preparação da cultura de arranque para uma inoculação Dois dias antes da tela, a chapa do P. estirpe aeruginosa (contendo o plasmídeo pCdrA :: GFP C) a partir do estoque de -80 ° C sobre uma placa de LB-agar (suplementado com ampicilina na concentração de 100 ug / ml), espalhando suavemente as bactérias através da placa utilizando uma inoculação estéril loop. Incubar a placa durante a noite a 37 ° C. A noite antes da exibição, inocular uma única colónia de P. aeruginosa a partir da placa em 10 ml de meio LB (suplementado com ampicilina na concentração de 100 ug / ml) em uma TUser e incubar durante a noite a pré-cultura a 37 ° C com agitação a 200 rpm. No dia da tela, preparar uma subcultura a partir da pré-cultura durante a noite diluindo-a em primeiro lugar com meio LB fresco a um OD600 de 1,0 e depois ainda diluição com 5% de LB para uma DO 600 de 0,04 (razão de 1:25) . Nota: O volume total do meio inoculado depende do número de placas a ser testado. 5% lb é feita através da diluição de 100% LB com salina tamponada com fosfato (PBS) até à concentração desejada. É importante ressaltar que os meios de comunicação (5% LB) permite a activação constitutiva do pCdrA :: C GFP em P. aeruginosa. Adicionar uma barra de agitação magnética estéril para dentro do recipiente e agita-se a cultura a uma velocidade mínima em um agitador magnético durante 30 min à temperatura ambiente, permitindo que as bactérias para aclimatar aos meios de comunicação, antes de serem dispensadas em placas de 384 poços. 3. A inoculação e incubação das placas com 384 cavidades que continhamMoléculas pequenas Nota: Esterilidade e boas técnicas de assepsia são fundamentais para as etapas seguintes. Para preparar o controlo positivo (100% de inibição), adiciona-se 20 ul de sulfato de tobramicina (25 mg / ml) a 10 ml (adequado para até 12 placas) da subcultura, preparada na etapa 2.3 e misturar suavemente. Pipetar 40 ul da cultura de controlo positivo em poços A23 – P23 (Figura 2). Para preparar o controlo negativo (0% de inibição), adicionar 30 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 ml (adequado para até 12 placas) da subcultura, preparada na etapa 2.3 e misturar suavemente. Pipetar 40 ul da cultura de controlo negativo em poços A24 – P24 (Figura 2). Para cada uma das placas estampadas com as pequenas moléculas, inocular um volume de 40 ul das culturas durante a noite diluídas (descritos no Passo 2.3) para os poços A1 – P22 (Figura 2). Nota: Isto pode ser conseguido utilizando um rob manipulador de líquidosot. Devido às propriedades heterogéneas de culturas bacterianas, é importante manter uma agitação contínua e moderada para manter as bactérias de forma consistente distribuídos nos meios de comunicação durante a dosagem. Para fazer isso, manter a agitação a cultura aclimatada a partir do passo 2.4 magneticamente durante a distribuição. Selar as placas com uma vedação da tampa permeável ao ar, e incuba-se durante 6 h a 37 ° C. Nota: O selo permeável ao ar é fundamental para manter condições imutáveis ​​em todos os 384 poços e para contornar o potencial desenvolvimento de gradientes de oxigênio ao longo da placa. 4. Medição do crescimento (OD600) e intracelulares de c-di-GMP Nível (GFP) Aproximadamente 30 minutos antes da medição espectrofotométrica, pré-aquecer o leitor de placas a 37 ° C para evitar a condensação. Remova cuidadosamente a vedação da tampa permeável ao ar antes da leitura. Medir a densidade óptica a um comprimento de onda de 600 nm com um ajuste de 10 flashes por poço eum tempo de sedimentação de 0,2 seg. Antes da medição de fluorescência, fazer um ganho automático e ajuste focal com base no bem A24 (controle negativo) e defina o valor-alvo de ganho em 75% (Figura 2). A partir do software de controle leitor de placas, clique na medição de início e clique no botão '' Focus e Ajuste de Ganho / placa IDs 'tab'. Selecione '' Ajuste de foco '' e '' Canal A '' à direita na janela. Selecione '' Ajuste de Ganho '' e '' Selected bem '', e digite '' 75 '' como o '' valor Target ''. Finalmente, escolher bem A24 no layout da placa antes de clicar em '' iniciar o ajuste ''. Uma vez que o ajustamento a efectuar, clique em '' Inicie a medição ''. Medir a fluorescência do repórter GFP numa máximos de excitação / emissão de 485/520 nm com um ajuste de 10 flashes por poço e uma settlitempo ng de 0,2 seg. Coletar dados de todas as placas examinadas. Nota: As leituras de dados são salvos automaticamente como padrão pelo software de controle leitor de placas. Veja as leituras, clicando no ícone "Mars" dentro do software de controle para abrir o pacote de análise estatística. Recuperar dados por "duplo clique" sobre o número da placa de interesse para acessar os dados para análise. Análise 5. Os dados Avaliar a uniformidade e reprodutibilidade do ensaio usando análise robusta z ', que é a métrica de qualidade mais comuns relatados para telas de alto rendimento. Calcule z robusta "utilizando a fórmula: Onde MAD (mediana desvio absoluto) é uma estimativa do desvio padrão, p é o controlo positivo (100% de inibição) e o símbolo n representa o controlo negativo (0% de inibição) para a OD 600 e GFP valores. Nota: Um ensaio com um valor robusto Z '(calculado para ambos DO600 e os dados em bruto GFP) maior do que ou igual a 0,5 é considerada como uma excelente ensaio. Calcular a% de inibição de crescimento utilizando a fórmula: Onde Xi é o valor DO600 DO600 iterado de cada poço de amostra. % Inibição DO600> 0, inibidor de crescimento; % Inibição DO600 <0, promotor de crescimento. Avaliar a% de inibição do nível intracelular de c-di-GMP utilizando a fórmula (a mudança em unidades de fluorescência arbitrárias de intensidade são corrigidos para a variação da densidade celular): Onde Xi é o valor GFP GFP iterado de cada poço de amostra. % Inibição GFP> 0, inibidor de c-di-GMP; % &# 160; Inibição GFP <0, promotor de c-di-GMP. Definir um limite para detecção de ocorrências em 3 MAD da mediana (média ± 3 MAD), calculado a partir da amostra bem ler-outs de cada placa, assumindo uma distribuição normal dos pontos de dados. Nota: No entanto, uma ± 50% de inibição de corte podem ser seleccionados para os ensaios de resposta à dose mais reprodutível e preciso, se necessário.