リアルタイムPCRによる沿岸堆積物および定量16SのrRNA遺伝子と転写物からの同時DNA-RNA抽出

海洋沿岸堆積物から1 DNA＆RNA抽出リボヌクレアーゼ（RNアーゼ）フリー素材とワークスペースの準備 0.1％のジエチル（DEPC）で処理することにより無RNAse蒸留水（のdH 2 O）を準備し、37°CO / Nでインキュベートします。 121℃で15分間のdH 2 Oオートクレーブにより残留DEPCを削除します。使用DEPCは、すべてのソリューションを作るためのdH 2 Oを処理しました。 180°CO / Nですべてのガラス器具を焼きます。 、プラスチック製のふたとリムを取り外して2 M NaOHでO / Nの溶液中でそれらを浸し、使用前のdH 2 O DEPC処理でそれらを洗い流してください。 表1の通りCTABリン酸緩衝溶液を準備します。 表2のとおりPEG-のNaCl沈殿溶液を準備します。 開始する前に、RNAseを除染液を用いて、すべての作業面（ すなわち 、ベンチ、微量、ヒュームフード）とマイクロピペットを清掃してください。全体の手順の間に手袋を着用してください。 </li> サンプルのクロスコンタミネーションを回避するために、マイクロピペットフィルターチップと一緒に無RNAseプラスチック製品を使用してください。 環境サンプルの収集と保管トップ2.5センチメートルから滅菌50ミリリットルのファルコンチューブを使用して、干潮時に沿岸の堆積物を収集します。堆積物の15〜20グラム収集します。慎重にサンプル収集後蓋を閉じます。即時処理のために4℃でクーラー内の研究室にすぐに輸送。 2ミリリットルビーズビーティングチューブに湿潤重量堆積物の無菌へらや分量0.5グラムと混合することによって、サンプルをホモジナイズします。小分けし、追加の複製、液体窒素中に配置することにより、フラッシュ凍結。 -80℃で保存のアリコート。注意：液体窒素を扱うときは保護手袋及び安全ゴーグルを着用します。 注：現場は現場で2ミリリットル滅菌マイクロチューブに実験室、アリコート堆積物の0.5グラムの近くに配置されていない場合。すぐに李にそれらを置くことによって、チューブをフラッシュ凍結研究室に頭の良い窒素と輸送。処理まで-80℃で保存サンプル。 堆積物からのDNAとRNAの同時抽出注：以下のプロトコルは、グリフィス法6の修正版です。 クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）500μlのCTAB-リン酸緩衝液および500μlのフェノール追加2ミリリットルの堆積物の0.5グラムを含むビーズ溶解チューブを、サンプルを均質化するためにチューブを5〜10回転倒。 注意：すべての回で、適切な保護具（ すなわち 、実験室のコート、手袋、安全ゴーグル）を着用してヒュームフードでこの手順を実行します。 2.5分間フルスピードでボルテックス。 4℃で10分間、16,000×gで遠心分離します。 ヒュームフードでは上部の水層を抽出し、新しい1.5ミリリットル滅菌マイクロチューブに移します。氷冷クロロホルム500μlのを追加し、氷上でサンプルを維持する：イソアミルアルコール（24：1）。 エマルジョンがvisibになるまで数回転倒ル。 4℃で16,000×gで10分間遠心分離します。 ヒュームフードでは上部の水層を抽出し、新しい1.5ミリリットル滅菌チューブに入れてください。 30％PEG-NaCl溶液の2つのボリュームが追加することにより、核酸を沈殿させ、よく混ぜます。 2時間氷上でインキュベートまたは4°CO / Nでサンプルを残します。 4℃で20分間、16,000×gでのインキュベーション遠心分離機サンプルの終わりに。 注：ペレットは、チューブの底に見えるかもしれません。 静かにマイクロピペットを用いて上清を除去し、ペレットを乱さないようにしてください。チューブにPEG溶液の約10μlのままにしておき、氷冷70％エタノール1 mlを追加します。 4℃で16,000×gで20分間遠心分離します。ゆっくりペレットに触れないように注意しながらマイクロピペットでエタノールを除去。 5秒間遠心分離し、マイクロピペットを用いて、残留エタノールを除去。約5分間空気乾燥さペレットを残します。 50μlのDEPC処理中にペレットを再懸濁H 2 O. 1％アガロースゲル19に5μLを実行して、アガロースゲル電気泳動によりDNA / RNAの品質や収量を調べます。 、2つのアリコートに、DNAやRNAのために30μlの15μLを核酸を分割します。 必要になるまで-80℃でDNAを保管してください。次のセクションで説明するとおりにRNAを分離します。 DNAフリーのRNAのRNAと品質チェックの調製 DNAの消化 37℃で30分間インキュベートし、核酸の30μlのボリュームにDNアーゼIバッファーの3μlのおよびDNAse Iの1.5μlを添加します。 30秒間ボルテックスすることによってDNアーゼ不活性化試薬を混ぜます。サンプルへの溶液の4.8μLを加えます。時折溶液を混合するためにチューブの底をタップし、室温で5分間インキュベートします。 RTで90秒間万×gで遠心し、新しいチューブに上清（RNA）を転送、下流の反応を阻害することができ、沈殿物を転送しないように注意しながら。 </李> RNAの品質チェック 1:10に希釈し、滅菌無RNAseのdH 2 Oの18μlに、RNAの2μLを加えます。 別々のPCR反応では、滅菌0.5ミリリットルのPCRチューブにそのまま、またはRNAの1:10希釈の1μlを添加します。 。 表3のとおり、16S rRNA遺伝子を増幅するためのPCR反応成分を加える「陽性」（ 例えば 、純粋な細菌培養物から抽出したDNA）、「PCR阻害剤」コントロールを含める（ すなわち 、正の純粋培養のDNA1μlのと1ニート抽出したRNAのμl）を、滅菌し無RNAseのdH 2 Oの「負」のコントロール次の増幅パラメータでサーモサイクラーを設定：95℃5分、（95℃30秒、57℃30秒、72℃1分）を35サイクル、72℃10分xは。 40分間85 Vで1％アガロースゲル上でPCR産物の10％を実行します。 PCR産物は、環境RNに形成されている場合のDNAse I処理を繰り返しますサンプル。 RNAからの第一鎖cDNAの3世代 RNアーゼ/ DNアーゼフリーの0.2ミリリットルのPCRチューブに、表4に従って試薬を追加します。 65℃5分でサンプルをインキュベートします。少なくとも1分間氷上に置き、その後10分間25℃でインキュベートします。 同じチューブに、表5に列挙した試薬を追加します。 50分間55℃でサンプルをインキュベートします。 10分間72℃で反応を不活性化します。 使用するまで-20℃で保存するcDNA。 4.定量PCR 定量PCRのためのDNA標準の生成 Q-PCRプライマー（1369F＆1492R 21）との純粋培養から抽出したゲノムDNAからの細菌の16S rRNA配列20（または関心の任意の他の配列）を増幅。 製造業者の説明書に従って市販のキットを用いてPCR産物を精製します。 精製したPCRクローンを作成製造元の指示に従ってベクター系をクローニング3'-Tオーバーハングに製品。 PCRは、製造業者の説明書に従って大腸菌 JM109コンピテント細胞に挿入を含むベクターを形質転換します。 プレートアンピシリン（100μg/ ml）、X-galを（20μgの/ ml）およびIPTGへの転換50μlの（0.5 mM）のルリアベルターニプレート（トリプトン10グラム/ L、酵母エキス5グラム/ L、NaClを10グラム寒天/ L、寒天15gの/ Lの）。 37℃でO / Nインキュベートします。 プレートから単一の正の白色形質転換体を選択します。 100μg/ mlのアンピシリンを含有する50 mlのLBブロス中で陽性の形質転換体を接種し、37℃でO / Nで250 rpmで振とうインキュベートします。 O / N培養物から、製造業者の説明書に従って市販のキットを用いてプラスミドを単離し、精製します。 一度（ 例えば 、のEcoRI）プラスミドを切断することのできる適切な制限酵素を用いてプラスミドを線状化。 <li >吸収比260 / A 280 19を測定することにより、プラスミドの純度を分析します。比が1.8未満であると、フェノール-クロロホルム19プラスミドを再抽出します。注：純粋なDNAは、1.8比を有します。 分光光度計19を用いて、260 nmでの吸光度によってプラスミドDNAの濃度を決定します。 注：また、定量の精度は蛍光計と組み合わせて使用​​される蛍光DNA結合色素を使用することによって改善することができます。 シーケンスプラスミドを拠点に、ターゲットの大きさを確認するために挿入します。プラスミドのインサートDNAの量（ すなわち 、パーセンテージ）を計算する（ 例えば 、3,000 bpのベクターにおいて、123 bpのDNA断片は、全DNAの3.9％である）、および4.1.10で得られた濃度を掛け、決定します対象のDNA濃度（挿入）。 1μl当たりターゲットのコピーを計算するには、次の式を使用します。 ロード/ 54067 / 54067eq1.jpg "/> 二本鎖DNA（dsDNAを、塩基対当たり660ダルトン）の平均分子量により、標的DNAの塩基対の数を乗算することにより、ターゲット分子量（TMW）を計算します。 DNAの2μlをし、無菌のdH 2 O18μlのを使用して10 10 10から2コピーの範囲の標的DNAを希釈各希釈ウェルを混合し、次の希釈を行う前に、簡単にスピンダウン。 qPCRのためのRNA標準曲線の生成ステップ4.1.5からは、ターゲット・リバースプライマー（ すなわち 、R1492）と前方ベクタープラスミドプライマーM13Fを用いたコロニーPCR 19によって白色コロニー（約5）の数をスクリーニングします。 注：プライマーのこの組合せは、上流のT7プロモーター部位で正しいセンス方向でクローニングされた挿入物を増幅します。 製造業者の指示に従って市販のキットを用いてPCR産物を精製します。精製されたPCR Pを定量化します分光光度計を用いて260nmでroduct。 インビトロ転写反応のための各リボヌクレオチド、1 T7反応バッファーと1 T7ポリメラーゼ酵素の7.5 mmの20μlの最終容量でPCR産物200ngのを加えます。 37℃で4時間反応をインキュベートします。 Iは、DNA鋳型を除去するために37℃で15分間インキュベートし、反応をRNaseフリーのDNaseの1単位を加えます。 エタノール沈殿19によるin vitroで転写されたRNAを回収し、260 nmで蛍光計または吸光度によってを使用して、RNA収量を定量化します。 RNAの1μl当たり転写物数を計算します。 T7プロモーター（153塩基）の長さに標的RNA（ 例えば 、123塩基）で塩基対の数を追加し、RNAの平均分子量は、塩基当たり340ダルトンを掛けます。 シリアル部3に概説されるように使用するための4.1.13に概説されたcDNAを希釈し、逆転写酵素（RT）反応を定量化し、標的RNAの500ngのを追加標準曲線として。 リアルタイムPCR 氷の上で環境DNA / cDNAサンプル、標準および定量PCR試薬を解凍します。光から蛍光プローブを保護します。 4.1.14に概説された標準曲線の標準を希釈します。 /ニートから10 -3に対するcDNA無菌のdH 2 Oを18μlに2μlのサンプルを追加することにより、環境DNAの1:10希釈液を作ります 6（プライマーおよびプローブ） 表に従って、総反応数+ 10％のためのマスターミックス反応を行い、 表7（反応ミックス）。十分に混合し、短時間遠心。 96ウェルの光学定量PCRプレートの各ウェルにマスターミックス19μlのテンプレートの1μlの（標​​準、負の制御のための環境試料や水）を追加します。三重に各反応（標準、環境試料および陰性対照）を実行します。 Q-PCR光学カバーで96ウェルプレートをカバーしています。簡単にプレートを遠心。ロード定量PCR機の加熱ブロックにプレートと蓋を閉じます。 定量PCRマネージャソフトウェアを開きます。 「プロトコル」タブをクリックし、「新規作成する」をクリックし、以下の増幅条件を追加：3分95℃、（10秒95℃、30秒60℃）を40サイクルxは。 20μlにサンプルボリュームを設定し、「OK」をクリックし、プロトコルを保存します。 「プレート」タブをクリックします。 「選択編集」の下で、「フルオロフォアを選択」をクリックし、適切なプローブ、 例えば 、フルオレセインのレポート染料を追加します。 「OK」をクリックします。 「サンプルタイプ」メニューから「標準」を選択し、基準を含むウェルを強調表示します。変更3に「サイズを複製」、「適用」をクリックして "シリーズを複製」をクリックします。 、標準的な1のための計算された開始濃度を追加するために「希釈系列」をクリックしてください標準曲線を加えた希釈係数（10）、を選択し、「減少」またはオーダーに応じて「増加」を示しますプレートに。 「適用」をクリックします。 よく未知のサンプルを含む位置を強調表示し、「サンプルタイプ」ドロップダウンメニューから「不明」を選択します。 」シリーズを複製する」をクリックし、「適用」3.に「サイズを複製する」に変更します。 「サンプル名」の下にサンプル名を編集します。テンプレートなしのコントロール（NTC）のウェルのための手順を繰り返し。 プレートエディタボックスで「OK」をクリックし、ファイルを保存します。 「実行を開始」をクリックします。 実行が完了すると、データ解析ウィンドウが開きます。標準曲線、標準曲線記述子（ 表8）および増幅プロットを表示するには、「定量化」タブをクリックします。 Cp値については、「定量データ」タブをクリックして、未知のサンプルの遺伝子の出発量（SQ）に対応します。表計算ソフトにエクスポートテーブル必要な場合。 土砂extracの量、希釈係数によって、未知のサンプルからの遺伝子の存在量を掛けテッド全量核酸は湿重量の堆積物のグラム当たりの遺伝子のコピーを入手するには溶出しました。 注：50μl中堆積物の0.5グラムから溶出DNA、1/10に希釈し、Q-PCR反応にテンプレートとして1μlを添加します。遺伝子コピーをDNAのx希釈第X因子溶出量×2μlの：乗じて遺伝子コピーのグラム-1土砂を計算します。