تشكيل عملاق الحجم Polymersomes عن طريق الإماهة بمساعدة جل
Summary
We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.
Abstract
Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (> 4 µm) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (>4 µm) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (>100 µm).
Introduction
إنشاء خلية الحجم، الحويصلات unilamellar العملاقة الاصطناعية (GUVs) هو من اهتمام متزايد في إعادة الإعمار في المختبر من العمليات الخلوية المختلفة لبناء إطار للجيل لتشبه الخلايا النظام 1،2 الاصطناعي. في حين GUVs تتألف من الأغشية الدهنية هي يقلد ممتازة من الأغشية الطبيعية والبيولوجية، فهي غير مستقرة ضد التقلبات البيئية والحصول على حياة الرف قصيرة نسبيا. بسبب هذه القيود، وقد استخدمت بوليمرات كتلة محبة للجهتين كما يقلد الدهون لتكوين الحويصلات البوليمر، أو polymersomes. وفي هذا السياق، polymersomes هي مفيدة في تطوير نظم الخلايا الجزيئية الحيوية بسبب زيادة استقرارها 3 والكيميائية تعدد 4،5 والصفات الفيزيائية للتعديل 6-8.
الأساليب الحالية لتشكيل تشمل polymersomes عملاق الحجم electroformation 9 و قالب الإماهة 10، وكلاهما ثهيك هي مضيعة للوقت، معدات كثيفة العمالة، تتطلب المتخصصة وإنتاج محاصيل منخفضة من polymersomes العملاقة سليمة. وقد وضعت وبمساعدة هلام بسيط طريقة معالجة الجفاف مؤخرا لإنتاج GUVs الدهون 11. هنا، نحن تصف تطويع تقنية الإماهة بمساعدة هلام لخلق polymersomes العملاقة مع اختلاف التراكيب البوليمر، حجم تسيطر عليها، وفي مختلف التراكيب العازلة.
لفترة وجيزة، والمجففة 1٪ ث / ت هلام الحمض النووي الأفلام الكهربائي الاغاروز القياسية على ساترة الزجاج. ثم تنتشر حلول البوليمر أعدت في الكلوروفورم عبر فيلم الاغاروز المجففة والسماح للتتبخر. بعد إزالة المذيب كاملة، وممهى الأفلام البلاستيكية في المنطقة العازلة في الاختيار مع التدفئة معتدلة (40-70 درجة مئوية) والعملاق (> 4 ميكرون) تتشكل polymersomes الحجم في غضون 30 دقيقة. هذه الطريقة تنتج بسرعة مئات سليمة تماما، polymersomes بشكل جيد باستخدام معدات المختبرات القياسية وreagenنهاية الخبر بأقل التكاليف.
تتشكل الشكل 1. تخطيطي تصور طريقة معالجة الجفاف بمساعدة هلام. polymersomes العملاق يتكون من مجموعة من البوليمرات diblock بعد ~ 30 دقيقة من الإماهة. يرمز كتلة ماء في أرجواني ويرمز كتلة مسعور باللون الأخضر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبحوا استكشافها على نطاق واسع Polymersomes كما يقلد غشاء البيولوجية. خصائص قوية وتنوعا من البوليمرات جعلها جذابة على نطاق واسع للدراسات التي تتطلب functionalization الغشاء، طول العمر والقدرة على الاستجابة ضبطها. الطرق التقليدية لتشكيل polymersomes عملاق الحجم 9،10 (> 4 ميكرون) هي كثيفة العمالة وتتطلب معدات باهظة الثمن والمتخصصة. هنا، نقدم لأول مرة، وهي طريقة سريعة ومرنة وقوية لتشكيل polymersomes الحجم العملاق باستخدام معيار الكواشف المخبرية غير مكلفة والمعدات.
استخدام الإماهة بمساعدة هلام، polymersomes unilamellar يمكن تشكيلها بسرعة (<30 دقيقة)، في مجموعة متنوعة من حلول الإماهة (بما في ذلك وسائل الإعلام ثقافة الخلية) ومع مجموعة متنوعة من البوليمرات المختلفة (لا تظهر البيانات). لم يكن لوحظ تشكيل الحويصلات الصفاحات أو غير المتماثلة باستخدام هذه التقنية. طوال هذا العمل، كنا بولي (أكسيد الاثيلين) – بولي ب- (البيوتاديين) (بيو-PBD، EO 22 -BD 37) محايدة diblock من البوليمرات. العديد من المؤلفات البوليمر مختلفة (بما في ذلك بوليمرات diblock مشحونة) تعمل بشكل جيد باستخدام هذه الطريقة (لا يظهر). ومع ذلك، بعض بوليمرات triblock المتاحة تجاريا وارتفاع الجزيئية بوليمرات الوزن diblock (~> 5000 دالتون) لا تشكل polymersomes متميزة. لجميع من التجارب في هذا المخطوط، وقد مخدر على تركيز منخفض من الدهن المسمى في محاليل البوليمرات لأغراض التصور فقط. ويمكن أيضا أساليب أخرى لتصور، بما في ذلك البوليمرات functionalized مباشرة مع صبغة الفلورسنت يمكن استخدامها. يمكن أيضا Polymersomes يمكن تصوير مع المجهر مشرق الميدان، على الرغم من المجهري مضان توفر قدرا أكبر من القرار.
معظم التعديلات الطفيفة على بروتوكول عادة لا تغير النتائج. على سبيل المثال، الفروق الصغيرة في تركيز المحلول البوليمر نشر على لل coverslips لا تغير من تشكيل البوليمر وILM تشكيلها. في حين لم يحدد مدى التركيز الكامل، وتشكيل polymersome تحدث بنجاح مع طائفة واسعة من تركيزات فيلم البوليمر (على سبيل المثال، 1-10 ملغ / مل). ومع ذلك، هناك بعض التعديلات البروتوكول الذي لا يؤثر سلبا على تشكيل polymersome. أبرزها هو أن coverslips الزجاج الجولة (بدلا من مربع) نتيجة في تشكيل سيئة للغاية من polymersomes. ونحن نعزو ذلك إلى معطف حتى للغاية من الاغاروز على الزجاج مما يعيق فعلا تشكيل polymersomes.
واحدة من أبرز التحديات لهذه التقنية هو القدرة على استرداد polymersomes من السطح مع ارتفاع العائد. وهناك بعض الحالات التي إزالة polymersomes من السطح الأصلي يمكن أن يكون مفيدا. ويرجع ذلك إلى ارتفاع مضان خلفية من فيلم البوليمر المجففة، وإزالة polymersomes الفرد والانضمام لهم لتنظيف coverslips وزيادة جودة التصوير وتوصيف (حزبcularly خلال تحليل FRAP). للقيام بذلك، pipetting لطيف مع طرف ماصة التي تم خفض نهاية قبالة سوف يلتفظ وpolymersomes من على سطح الأرض (على الرغم من أن عدد الحويصلات تعافى هو أقل بكثير من تلك التي تكونت في الأصل). ويمكن بعد ذلك Polymersomes توضع على الأسطح ساترة تعديل، والسماح للpolymersome للتفاعل مع ساترة جديدة. عادة، على الحياد polymersomes بيو-PBD، coverslips تعامل مع الأوزون لمدة 15 دقيقة تسمح polymersomes لتسقط على السطح للتصوير. مطلوب تعديل سطح مختلفة للتركيبات polymersome مختلفة (على سبيل المثال، سلبا أو إيجابا اتهم البوليمرات).
معظم المواد المستخدمة في هذا البروتوكول بنجاح تخزينها واستخدامها لعدة أيام إلى أسابيع. والاغاروز طدت يمكن reboiled وإعادة استخدامها حتى يبدأ الاغاروز أن يكون الركام حتى بعد الغليان، أو الاغاروز طدت يبدأ لتجف. Coverslips مع الأفلام الأغاروس المجففة ويمكن تخزين واستخدامد إلى أجل غير مسمى (على سبيل المثال، أشهر). البوليمر يذوب في الكلوروفورم ويمكن تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أشهر. مرة واحدة يتم تجفيفها فيلم البوليمر على الأفلام الأغاروس، ومع ذلك، تحتاج الأفلام ليتم تخزينها في ظل فراغ المنزل واستخدامها في غضون أسبوعين (لم يتحدد التخزين على المدى الطويل بشكل مباشر، ولكن هناك اختلافات ملحوظة في polymersomes تشكلت من الأفلام البلاستيكية ومضى عليها أكثر من اثنين أسابيع).
باستخدام بروتوكول الإماهة بمساعدة هلام المعروضة هنا، تتشكل مئات polymersomes شكل موحد-بسرعة مع مجرد بضع ساعات من العمل باستخدام المعدات القياسية والكواشف المخبرية وغير مكلفة. وعلاوة على ذلك، polymersomes يمكن تشكيلها في مجموعة متنوعة من المحاليل الفيزيولوجية ومن المؤلفات البوليمر مختلفة (لا يظهر). تغيرات طفيفة على طريقة لا يغير سلبا على تشكيل polymersomes، مما يجعل بمساعدة هلام الإماهة تقنية متعددة ومتاحة للعلماء متفاوتة البريد الفنيxpertise.
القدرة على خلق بسهولة polymersomes العملاقة على نطاق وحجم الخلايا ضرورية لبناء نظم تشبه الخلايا الاصطناعية. سهولة الاستخدام وتعدد الإماهة بمساعدة هلام لجعل هذه polymersomes تقدم تقدما كبيرا في مجال بيوميمتيك لإنشاء يقلد غشاء الخلية قوية. على سبيل المثال، باستخدام هذه التقنية، واستراتيجيات لتغليف مكونات الخلايا المختلفة، functionalization من البوليمر مع بروتينات غشاء الخلية وإدراج البروتينات النقل غشاء، على سبيل المثال لا الحصر، يمكن أن تكون مصممة لبناء خلايا اصطناعية على أساس polymersome.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).
Materials
| 125 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
| 18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
| 25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
| Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
| Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
| Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
| Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9mL capacity, case of 144 |
| Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
| poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
| Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |
Riferimenti
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments. Nanoscale. , (2015).
- Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a., Bates, F. S., Discher, D. E. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability. Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).
- Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups. Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).
- Egli, S., et al. Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes. J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).
- Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers. Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).
- Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors. Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).
- Henderson, I. M., Paxton, W. F. Salt, shake, fuse – Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).
- Discher, B. M. Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Howse, J. R., et al. Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions. Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).
