Summary

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

Published: April 04, 2016
doi:

Summary

ここでは、単離されたヒト血小板は私がロテノンを阻害複雑に応じて代謝適応を研究するためにアクセス可能なex vivoでのモデルとして使用できることを示します。このアプローチは、液体クロマトグラフィー – 質量分析法によって同位体トレースおよび相対的定量化を使用し、研究デザインの多様に適用することができます。

Abstract

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Introduction

機能不全のミトコンドリアの代謝は、神経変性、癌、および心血管疾患30を含む広範囲の疾患に関与しています。このように、多大な努力は、疾患の病因に寄与する代謝欠陥を特徴付ける上に置かれています。液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS / MS)は、複雑な生物学的マトリックスからの分析物の定量のためのゴールドスタンダードと考えられ、多くの場合、代謝研究の8のために使用されます。多くの場合、生物医学研究の場合のようにしかし、ヒトの疾患に関連するアクセスと明確に定義されたモデルを達成することが課題です。

多くの研究は、細胞の代謝7,9上の生体異物または遺伝的異常の影響をプロービングするための細胞モデルを変革採用します。癌細胞において起こる代謝再プログラミングは、交絡因子21を導入 、従って、理想的ではないことができます。これらの問題はcircumveすることができます代謝分析のために十分なバイオマスを得ることが困難な場合がありますが、一次電池モデルとnted。また、培養に用いられる抗生物質の多量の影響は、潜在的な交絡ミトコンドリア研究16として強調されています。

ヒト血小板は、代謝研究5,22,27,32のための十分なミトコンドリアのコンテンツを持つ一次細胞モデルを利用する機会を与えます。血液は、個々のドナーから、または血液銀行から大量に描画し、したがって外部要因を容易に制御することができるモデルを提供〜第血小板を容易に取得することができます。第二に、それらの小さいサイズのために、血小板は容易も最小限備え実験室5内の最小の準備作業で他の血液成分から単離することができます。注目すべきは、血小板は核を含有しないため、独立して転写調節の代謝に変化を研究するために使用することができます。ここでは、ことを示していますアシル – コエンザイムA(COA)チオエステルの相対的定量化に加えて、単離された血小板のシステムは、炭素代謝を調べるために使用することができます。具体的には、我々は重要な代謝産物のアセチルへの[13 C] -labelの取り込みを調べるために安定同位体(非放射性)標識された[13 C 6] -グルコースおよび[13 C 16]パルミチンで代謝標識の使用を報告しますCoAの糖または脂肪酸酸化を介し。これは、生化学的経路13,24におけるアシルCoA種の広範な関与と、このようなロテノン3,33との複合体Iの阻害などの他の変数を、テストするには、このシステムの扱い易に、強力な一般化、および汎用性の高いプラットフォームを提供します。以下のプロトコルで提供される情報に加えて、同位体標識のためとLC-MSベースの分析のために使用される方法の広範な説明はBasuさんとブレア4に記載されています。

Protocol

倫理文:ヒトサンプルの治療に関するすべてのプロトコルは、大学のペンシルベニア州の人間研究倫理委員会のガイドラインに従ってください。 緩衝液および100倍ストック溶液の調製ベースタイロード緩衝液1 Lを用意。 8.123グラムのNaClを組み合わせ、1.428グラムのNaHCO 3、0.466グラムの塩化カルシウム2∙2 H 2 O、0.224グラムのKCl、および0.095?…

Representative Results

我々は以前にロテノンへの暴露から生じる補償代謝適応を説明。の一般化を再現しており、この手法の有用性を実証するために、この知見は、以前に細胞培養モデルにおいて同定されたこの調査は、この代謝シフトはまた、無核および細胞培養と同様の実験アーティファクトする傾向はない血小板で発生するかどうかを試験することを目的としました。彼らは代謝活?…

Discussion

ここでは、摂動ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとして、単離された血小板の有用性を示しています。具体的には、ロテノンにより複合体Iの阻害に応答して、代謝適応を特徴としています。

本研究は、ヒト血小板の細胞株におけるロテノンによって複合体I阻害の役割に以前に報告の調査結果を拡張しました。重要なことに、これはロテノンはまた…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、NIHの助成金P30ES013508とT32ES019851のサポートを認めます。

Materials

Reagent
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 746398
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) Sigma-Aldrich 223506
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 208337
Glucose Sigma-Aldrich G8270
13C6-Glucose Sigma-Aldrich 389374
Palmitic acid Cayman 10006627
13C16-Palmitic Acid Sigma-Aldrich 605573
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Trichloro Acetic Acid Sigma-Aldrich T6399
5-Sulfosalicylic Acid Sigma-Aldrich 390275
Acetonitirle Fischer Scientific A996-4 (optima)
Water (H2O) Fischer Scientific W7-4 (optima)
Formic acid Fischer Scientific 85171 (optima)
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 472301
Ethanol Fischer Scientific 04-355-222
Methanol Fischer Scientific A454-4 (optima)
Ammonium Acetate Fischer Scientific A639-500
2 mL Eppendorf Tubes BioExpress C-3229-1
LC vials (plastic) Waters 186002640
10 mL Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns Waters WAT094225
Pastuer Pipets Fischer Scientific 13-678-200
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
CO2 Water-Jacketed Incubator Nuaire AutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass Spectrometer Thermo Scientific Finnigan TSQ Quantum
HPLC Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000
Source Thermo Scientific HESI II
HPLC Column Phenomenex Luna C18 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm

Riferimenti

  1. Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
  2. Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
  3. Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
  4. Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
  5. Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
  6. Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
  7. Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  8. Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
  9. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
  10. Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
  11. Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
  12. Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
  13. Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
  14. Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
  15. Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
  16. Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
  17. Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
  18. Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson’s disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
  19. Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
  20. Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
  21. Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
  22. Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
  23. Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
  24. Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
  25. Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
  26. Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
  27. Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
  28. Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
  29. Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
  30. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
  31. Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
  32. Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich’s ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
  33. Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
  34. Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).

Play Video

Citazione di questo articolo
Worth, A. J., Marchione, D. M., Parry, R. C., Wang, Q., Gillespie, K. P., Saillant, N. N., Sims, C., Mesaros, C., Snyder, N. W., Blair, I. A. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. J. Vis. Exp. (110), e53941, doi:10.3791/53941 (2016).

View Video