の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em> ex vivoで</em>マウスの耳皮膚

これらの方法は、2匹のマウスは人道的に頸椎脱臼により安楽死させRW ら銀行に報告研究で使用しました。英国では、これは動物に記載されている1方法（科学的手続）法、1986年から欧州指令63分の2010 / EU法的に承認されたスケジュールです。この連邦法は、動物福祉およびすべての手順を承認した倫理審査委員会によって、アバディーン大学で局所的に適用されます。 ラベリング1.準備耳このようなLileyの（1956）5のように、標準的な生理食塩水を準備し、90％O 2/5％CO 2（カルボゲン）でそれを飽和。 （12）のNaHCO 3、KClの（4）、KH 2 PO 4（1）、塩化ナトリウム（138.8）のMgCl 2（1） の CaCl 2（2）及びグルコース（11）Lileyの生理食塩水（mm）です。注：この原稿の残りの部分で、「生理食塩水」は、完全にカルボゲンで飽和されている食塩水を参照します。 dissectio中、20分 – nが、準備ごとに15をカバーする生理食塩水をリフレッシュ。 人道的に頭蓋骨を損傷することなく、成体マウスを安楽死させます。注：私たちは、C57 / Bl6JとMF1マウスを使用しているが、任意のマウス系統を使用することができます。最も重要な側面は、大規模な成人（> 25 g）を使用しないことです。大きいマウスでのラベリングは、多くの場合、卵胞の小さな散乱グループに限定され、信頼性が低いです。 （50ミリメートルは通常便利である）だけ緻密なヘアラインの上、~25センチハサミでベースの近くに外部の耳（耳介）を削除して、シリコーンゴムでライニング文化/シャーレに生理食塩水に浸します。 位置耳介前部（凹）側を下にし、細かい虫ピンで定期的に、シリコーンにマージンをピン（〜6から8耳あたり、〜0.2ミリメートルの直径のピン）。 20分、または絶えず灌流風呂を使用 – 生理食塩水ごとに15を更新します。 慎重に最初に耳介のカットベースの上からアクセスし、鈍的切開によって、前部皮膚から後方皮をはがし厚い中央軟骨および体系的に薄い、軟骨無外部余白に向けて取り組んでいます。 これを行うには、無一対の後部皮膚のカットエッジの中心を保持します。 3鉗子。そして、顎と無の別のセットのポイントを配置、閉じました。皮膚とその下にある軟骨との間のギャップで3鉗子。 ゆっくり層を分離するために後方皮膚をバック剥離しながら、慎重に癒着を緩め、必要最小限の力を利用して、ギャップ内左右にから、閉じた鉗子のポイントを働きます。 後部の皮膚を除去した、位置の前方の皮膚を残します。 （上記、1.5ごとに）前方の皮膚の横に、最大事後皮膚、真皮側をピン。 次に、慎重かつ完全に1.6と同様の鈍的切開法により前方皮膚から皮膚層の間に挟まれた耳介軟骨を除去します。鉗子で穿刺穴をあけないでください。 そして、Fまたは両方の耳介皮膚の準備優しくピール、摘むと毛包の拠点をカバーする発泡ポリスチレンフォームを、似ている、結合組織の薄い層を離れてこします。注：最適なクリアリングを得ることが少し練習を取ることができます。あまりにも積極的に掻きする卵胞のベースであるニューラルネットワークを削除しながら、不十分な組織除去は、色素溶液のためおよびイメージングのための両方のアクセスを妨げます。 生理食塩水をリフレッシュします。 2.披針形ターミナルラベリング注：以下のプロトコルは、スチリルピリジニウム色素のために最適化されています。その他、化学的に類似し、スチリルピリジニウム色素は、おそらく濃度およびインキュベーション時間内にいくつかの調整後、動作するはずです。染料溶液を取り扱う際は手袋と白衣を着用してください。メーカーから直接10mMストック染料溶液を購入したり、グルコースを含まない生理食塩水で染料粉末を溶解させてストックを準備するのどちらか。アリコート（10μlのは、通常は便利ですが、大きなSCAのためにこれを調整しますル実験）とストアが-80℃-20℃で6ヶ月まで、または約1年のために凍結します。粉末は、少なくとも2年間は保存されます。染料溶液を繰り返し凍結/融解を避けます。これは急速に染料を変性させます。一度、解凍し、4℃で保存し、1週間以内に使用します。 水面下の5ミリメートル – プラットフォーム〜3で、30℃に水浴を事前に加熱します。 新たに10μMスチリルピリジニウム色素溶液（10mLの生理食塩水で新鮮に解凍し、10mMのスチリルピリジニウム色素を10μl）を調製し、水浴中で平衡化します。 生理食塩水の2ミリメートル（典型的なボリューム、〜2ミリリットル） – ピンは、シリコーンゴムの各製剤は、1に沈め35mm培養皿を並びます。動物の使用を最小限に抑えるために、 – （15cmの長さ10）頂部から半分に切断した場合の各耳介皮膚製剤は、小さなはさみでベースに2つの調製物が得られます。 30°Cの水浴に沈めたプラットフォーム上で、生理食塩水で覆われた耳介の準備を含む35mm皿を置きます。確保水の深さは、適切な温暖化のために十分であるが、オープン皿に生理食塩水を汚染しません。 ピン罰金-継続的に準備をガスに各皿のシリコーンベースにO 2 / CO 2を流しながら（0.5 1ミリメートル外径）チューブ。また、水槽に洗濯/皿のさわやか用色素フリーの生理食塩水100ミリリットルを配置します。カルボゲン飽和を維持し、水の汚染を防止するために密栓ボトルを使用してください。 ボトルを栓100ミリリットルから耳介の製剤より生理食塩水を交換し、その後30分間30℃ですべてを平衡化します。さらに30分インキュベートします。注：この置換は、生理食塩水の蒸発やガスラインの泡立ちに起因する任意のかさ体積の損失を補償します。 その後、迅速かつ慎重に、次の追加する染料溶液に希釈効果を最小化するためにティッシュペーパーと準備の周りに残っている任意の液体を離れてしみ、100ミリリットル廃棄物のビーカーに無染料の生理食塩水を離れて注ぎます。 （触れないように注意してください<em>つまり、損傷）に直接さらさ深い真皮面。 その後、30℃で40分間、10μMスチリルピリジニウム色素の3ミリリットル手順の残りのためのR / Tに戻る – 2に耳介の準備をインキュベートします。 R / Tでのソリューションを使用して、3段階で非内在化色素を除去。注：これらの手順は、最高のイメージングのために目の暗適応を開始するために、最小限の環境光（ブラックアウトブラインド、赤/オレンジ低強度の照明）で行われています。 廃棄物のビーカーに皿から標識溶液を離れて注ぎ、すぐに立て続けに無染料の生理食塩水を3回交換ですすぎます。これは準備に付着した残留スチリルピリジニウム色素溶液と簡単にさらさ膜からdepartitions任意の色素を除去します。 表面膜から最も残りの染料をDEPARTITIONするさらに30分間、無染料の生理食塩水、 すなわち最終的な変化でインキュベートし、端末によって内在化されない染料。 永続的な色素を除去トンを立ち往生スルホン化β-シクロデキストリン誘導体とキレート化することによって露出した膜の外部リーフレットO（Advasep-7、1 mMのは、5分- 表1を参照します）。このように、残りのすべての染料は、組織内であろう。 イメージングのための新鮮な無染料の生理食塩水に入れて、徹底的にティッシュペーパーで皿の外側を乾燥させます。 注：端末は今イメージングのための準備が整いました。披針形の語尾がゆっくりと再びエンドサイトーシススチリルピリジニウム色素を放出するので、生きているとことを認識することが重要です。これは、R / Tで遅くなりますが、撮像中/前に遅延を最小限に抑えることが重要です。実験は、複数の製剤のラベリングを必要とする場合は、最初に30℃で、それらすべてが標識されていない維持します。彼らは、数時間生存可能であろう。最初に画像化しながら、 – その後、第2の調製（2.8.3 2.7ステップ）を標識することにより、間隔で順次ラベルを付けます。 披針形エンディング標識3.イメージング。 注：オブザーバー次の画像形成工程のために暗順応でなければなりません。これがもたらす増加した視力が低い励起光レベルはイメージングのための卵胞を見つけるために必要とされていることを意味します。これは、光毒性を最小限に抑えるのではなく、光退色の不便を軽減するために最も重要です。完全な強度の光照射によって生成されたフリーラジカルは速やかに（60秒以内）に住ん神経終末（GSビューイック、S. FadulとWJベッツ、未発表の観察）を死滅させることができます。 撮影前に、解剖実体顕微鏡下準備を確認し、慎重に任意の表面の破片を除去します。これは、画像を汚染する自家蛍光を防ぐことができます。 標準フルオレセインフィルターセットを持つ直立落射蛍光顕微鏡のステージ上に皿をマウント（480から488 nm励起、500 – スチリルピリジニウム色素のための520 nmの発光）。 快適に、端末を特定するためにちょうど十分なまでNDフィルターで励起光強度を減衰させます秒。 低で観察することにより標識した卵胞を見つけて – その後、次第に高い（10倍と20倍の水浸対物レンズ）倍率の目標を（3.5倍乾燥対物レンズ4倍）。 低消費電力と高倍率用の20倍の水浸対物レンズ用の10倍のドライ対物レンズを通してラベルされた披針形端子の画像をキャプチャします。光強度と露光時間を最小限（0.5のカメラ積分時間 – 1秒が提案されています）。 標準的なデジタルカメラの画像をキャプチャし、独自のソフトウェアを使用して、コンピュータのハードドライブに画像を保存します。注：典型的な例は、図1に示されています。 各調製物からの画像〜20披針形の語尾。このマージンイメージング順番にそれぞれの卵胞に沿っ耳介皮膚や仕事のベースにカットエッジからマージン遠いで起動します。ない画像に明らかに破損している同じ卵胞二回といずれかを注意しながら、カットエッジに平行に若干の重複分野にまたがって動作。注記：再は、典型的には、それらをすべての重要な自発的な脱色が起こる前の画像にあまりにも多くの披針形端子です。したがって、我々は体系的に以下のプロトコルを使用して人口をサンプリングすることをお勧めします。 マージナルストリップを完了した後、耳介の付け根に向かって一つのフィールド幅を移動し、逆方向に処理を繰り返します。 画像すべての端末が明らかに非常にはるか斜め光学面に標準環状分析ROI内に完全にフィットしにくい指向時折ものを除いて、遭遇する（セクション4を参照）。彼らは明らかに破損しているか、バックグラウンド強度は、ローカライズされた組織の損傷を示し、特に高くない限り、周囲の端末に比べて異常に明るくしたり、調光器lanceolatesを除外しないでください。 皮膚領域の10％以上が/端子が/使用不能に破損している場合の準備を捨てます。注：時間とともに脱色lanceolatesとして、完全なイメージング洗浄の最後の20分以内に各製剤。 私F複数の調製物を用いて、強度の比較は、時間整合調製物による有効であることを確認します。これを行うには、脱染色時間の比較可能性を確保するために、30分〜により各製剤を染色のタイミングオフセット。 5または10分間隔で脱染色（エキソサイトーシス）、画像同じ端末を監視します。実践では、いずれか1つの製剤中の各時点での3つの別々の端子まで画像化することが可能です。 披針形エンディング標識4.分析。 注：次の手順では、端末の強度を分析するための迅速な方法です。 関心領域（ROI）の環状領域を作る毛包の基部（ 図2）で毛シャフトの先端を中心に。分析されるべき任意の卵胞に毛幹の自家蛍光を回避するのに十分な大きさの環状のROIの内周を設定するが、それでも全ての端末蛍光を包含する。外周最大terminを同封するのに十分な大きさであることを確認してください主光/卵胞軸に近い向く遭遇するアル可能性が高いです。 分析中のターミナルの近くに地元の染色強度を決定するために、ターゲット環形（正方形または円形、通常、〜400ミクロン2）の領域でほぼ等しい背景ROIを行います。 注：これらの2つのROIの大きさは、分析の開始時に設定され、いずれかの実験ですべての製剤全体のすべての後続の卵胞/披針形端子を分析するために使用されます。だから、初めに注意してそのパラメータを設定することが重要です。 端子、毛包間のない低強度の皮膚の基礎となる皮脂腺内のローカルバックグラウンドを表すために卵胞に十分近い背景ROIを配置したが、いずれかの末端領域を含めるしないように注意してください。 「メジャー」またはスプレッドシートへのソフトウェアおよび転送データの「分析ROI」機能を使用して2つのROIの平均強度を記録します。スプレッドシートでは、各個々の卵胞のネット強度を与えるために線維輪のものから平均局所バックグラウンド強度を差し引きます。ローカライズされた背景のこの調整は、大幅間、卵胞のばらつきを低減します。