在毛囊披针形结局生活神经末端标记的光学监测<em>离体</em>鼠耳皮肤

这些方法是在在银行报告的研究中，RW 等 2小鼠入道通过颈脱位安乐死使用。在英国，这是在动物（科学程序）中列出的经依法批准附表1法法案，1986年，欧盟指令六十三分之二千零十/ EU。该联邦立法在香港仔的动物福利大学和伦理审查委员会谁批准的所有程序在本地执行。 1.准备耳朵标签制备标准生理盐水，如Liley的（1956）5，并用90％ 的 O 2/5％CO 2（卡波金）饱和它。 Liley的盐水是（mM计）： 碳酸氢钠 （12），氯化钾（4），KH 2 PO 4（1），氯化钠（138.8），MgCl 2的（1）， 氯化钙 （2）和葡萄糖（11）。注：在这个手稿的其余部分，“盐”指的生理盐水是与卡波完全饱和。在dissectioN，刷新覆盖每15准备生理盐水 – 20分钟。 人道安乐死成年小鼠不会损坏头骨。注意：我们已经使用的C57 / BL6J和MF1小鼠，但可使用任何小鼠品系。最重要的方面是不使用大的成人（> 25克）。标签在较大的老鼠就是不可靠，往往只局限于毛囊的小而散团。 同〜25厘米剪刀取出外耳（耳廓）基地附近，只是头发浓密线以上，并在盐水淹没在硅橡胶衬里文化/培养皿（50毫米通常是方便）。 耳廓前部（凹）朝下位置，并用细昆虫针定期针边距以硅胶（〜6 – 8穗，0.2〜毫米直径针）。刷新盐水，每15 – 20分钟，或者使用一个不断灌注浴。 小心剥离由钝性分离前的皮肤后的皮肤，最初从耳廓上切基地访问厚厚的中央软骨和系统地对薄，无软骨的外部边缘工作。 要做到这一点，保持后皮肤的切割边缘的中心具有一对没有。 3钳。然后，用卡爪关闭，放置另一组没有的点。 3镊子在皮肤和底层软骨之间的差距。 轻轻地从一侧到另一侧的间隙内的封闭镊子的点，使用所需的最小力，小心松开粘连而剥离背面的后部皮肤分层。 随着后皮去掉，留在位置前的皮肤。针后皮肤，皮肤的一面朝上，前皮肤旁（按照1.5以上）。 其次，仔细，彻底去除夹在皮肤层之间由前皮肤由同一钝性分离技术，因为在1.6耳廓软骨。避免穿刺孔的镊子。 然后中，f或者两者耳廓皮肤准备轻轻剥离，勇气和擦远结缔组织的薄层，类似膨胀聚苯乙烯泡沫，覆盖毛囊基地。注：获得最佳的结算可以采取一些做法;组织去除不足妨碍访问，无论对于染料溶液及用于成像，而刮太大力删除神经网络，它们在毛囊的底部。 刷新生理盐水。 2.披针形末端标记注：以下协议是苯乙烯吡啶染料进行了优化。另外，化学性质类似，苯乙烯吡啶染料应该工作，也许在浓度和培养时间有些调整后。处理染料溶液时，戴上手套和白大褂。无论是直接从厂家购买了10毫米股票染料溶液或生理盐水染料粉末溶解不含葡萄糖准备库存。分装（10微升通常是方便，但这种调整对于大SCA勒实验），并存储冷冻在-20℃可达6个月或〜1年-80℃。粉将保存至少2年。避免反复冻融/染料溶液的解冻周期;这一快速的变性染料。一旦解冻，储存在4°C和1周内使用。 预加热的水浴中30℃，用一台〜3 – 第5毫米水表面以下。 新鲜制备10μM的苯乙烯基吡啶鎓染料溶液（10微升新鲜解冻的10mM苯乙烯吡啶鎓染料的10ml盐水），并在水浴平衡。 销在硅酮橡胶各制剂内衬在1浸没35毫米培养皿 – 盐水2毫米（典型体积，〜2毫升）中。每个耳廓皮肤准备将产生两种制剂，如果削减了一半，从先端具小剪刀立足（10 – 14厘米长），动物尽量少用。 将包含在30℃水浴中淹没平台上的盐水覆盖耳廓准备35毫米菜。确保水深度足以充分变暖，但在打开的盘不污染盐水。 细脚（0.5 – 1毫米外径）管与流O 2 / CO 2到每道菜不断气制剂的有机硅基地。也放入水浴100ml为了清洗/菜清爽无染料的生理盐水。用塞子塞紧瓶保持卡波饱和度和防止水体污染。 平衡在30℃30分钟，然后一切都更换过的盐水从100毫升塞的瓶中耳廓准备。孵育另外30分钟。注：此替代补偿盐水蒸发和烟气在线起泡造成的任何堆积体积损失。 倒掉无染料盐水到100ml废物烧杯中，然后快速并小心吸干远离其余周围用纸巾制备的任何液体，以减少接下来要加入的染料溶液稀释效应。注意不要碰（ <em>即损坏）暴露的深层真皮表面直接。 在30℃的C 3含10μM苯乙烯吡啶鎓染料进行40分钟，然后返回到R / T的程序的其余部分 – 孵育耳廓制剂2。 在三个阶段除去非内化染料，在R / T用的解决方案。注意：这些步骤在最小的环境光（遮光窗帘，红/橙低强度照明）表现最好，开始眼睛的暗适应成像。 倒掉从菜品的标签解决方案进入废物烧杯中，在快速连续无染料生理盐水三个转变迅速冲洗。这消除了残留苯乙烯吡啶染料溶液秉承的筹备工作，很容易从裸露膜departitions任何染料。 在无染料盐水的终改变孵育另外30分钟，以从表面的膜departition最多剩余染料， 即染料不是由终端内化。 删除持久染料卡住Ť直径：通过用磺化-b-环糊精衍生物螯合暴露的膜的外小叶（Advasep-7，1毫米，5分钟- 见表1）。因此，所有剩余的染料将在组织内。 在成像新鲜的无染料生理盐水将擦干的菜之外用纸巾彻底。 注：该终端现在已经准备好进行成像。要知道，披针形的结局是活的，因此，再慢慢释放的内吞苯乙烯吡啶染料是很重要的。尽管这将在R / T慢，它在成像期间以最小化/之前的延迟是重要的。如果实验需要多个制剂的标签，初始维持它们全部在30℃下未标记。它们将是可行的数小时。然后间隔依次标记，通过标记第二制剂（步骤2.7 – 2.8.3），而成像第一。 3.与成像披针形结局。 注：观察员应暗适应以下成像步骤。增加视力这提供意味着较低的激发光水平是必需的，以找到用于成像的卵泡。这是用于最小化光毒性，而不是减少漂白的不便最重要的。通过全亮度照明产生的自由基能迅速（60秒内）杀死活神经末梢（GS比伊克，S和法杜勒WJ贝茨，未发表意见）。 成像之前，请检查解剖立体显微镜下的准备，小心地取出任何表面的碎屑。这防止自动荧光污染图像。 安装一个标准的荧光过滤器设置在一个直立的落射荧光显微镜阶段的菜（480 – 488 nm激发，500 – 520 nm发射的苯乙烯吡啶染料）。 减弱与中性密度滤镜的激发光强度，直至恰好足以从容定位终端秒。 通过观察低标定位毛囊（3.5倍 – 4倍干燥目标），然后逐渐提高（10倍20倍和水浸泡的目的）的放大倍率的目标。 通过对低功耗和高放大倍率20倍水浸泡的目标10X干客观捕捉标记披针形端子的图像。尽量减少光照强度和照射时间（0.5的一体化摄像机的时间 – 1秒建议）。 一个标准的数码相机拍摄图像和使用专有软件保存计算机硬盘驱动器上的图像。注意：一个典型的例子示于图1。 图片〜从各个准备20披针形的结局。在开始从切割边缘在耳廓皮肤和工作沿着这缘成像依次在每个毛囊底部的保证金最远。在稍微重叠的领域平行切割边缘，小心不要像同一毛囊加倍努力跨越任何被明显破坏。注意：再是典型的太多披针形终端形象它们都显著自发去染色发生之前。因此，我们建议您使用以下协议系统抽样人口。 在完成边缘带之后，将一个场宽度朝向耳廓的基础上，并在相反方向重复该过程。 像所有的终端遇到的，除了偶尔的人显然很导向更倾斜于光学平面，不大可能标准环形分析ROI内完全符合（见第4节）。不排除比周围端子，除非它们是明显损坏或背景强度特别高，指示局部组织损伤异常亮或更暗lanceolates。 丢弃准备如果皮肤面积的10％以上/终端损坏/不可用。注意：作为lanceolates随时间脱色，完成成像洗涤的端部的20分钟内的每个制剂。 一世F使用一个以上的准备，确保强度的比较都是有效的通过时间匹配的准备工作。要做到这一点，抵消〜30分钟染色各项准备，确保脱色斑次可比性计时。 为了监测脱色斑（胞吐），图像在同一终端在5或10分钟的间隔。与实践中，它是可能的图象最多在任一制备每个时间点3个独立的端子。 4.分析披针形标记结局。 注：以下步骤是分析终端强度的快速的方法。 使感兴趣区域（ROI）的一个环形区域在毛囊的底部（ 图2）为中心在毛发杆的尖端。设置环状的ROI足够大，以避免在任何毛囊毛干自发荧光的内周进行分析，但仍包括所有终端荧光。确保外周大到足以包围最大TERMIN人可能遇到的是面向靠近主要的光/卵泡轴。 作背景的ROI面积大致等于目标环形（正方形或圆形，典型地〜400微米2），以确定在所分析的终端附近的本地染色强度。 注意：这些两个ROI的大小被设定在分析的开始和用来分析在所有的准备工作的所有后续卵泡/披端子中的任何一项实验。所以，在开始时小心以设置它们的参数是重要的。 将背景的投资回报率足够接近毛囊代表背后的终端，没有毛囊之间的低强度皮肤皮脂腺当地背景，但要小心，不要包括任何末端区域。 记录使用“措施”或“分析投资回报率的软件和数据传输到电子表格函数的两个ROI的平均亮度。在电子表格中，对于每个单独的毛囊从减去平均本地背景强度的环形，得到净强度。这种调整对本地化背景大大降低了毛囊间差异。