Комбинированная Запись Механически Вынужденное Афферентный Output и нервных окончаний в Labelling мыши фолликула волос ланцетные концовок
Summary
A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Abstract
Роман рассечение и записи методика описана для мониторинга афферентной стрельбы вызванной механическим перемещением волос в ушной раковины мыши. Этот метод является очень рентабельным и легко осуществляться с материалами, которые обычно можно найти в большинстве лабораторий электрофизиологии, или легко приобрести. Рассечение является простым и быстрым, с механическим перемещением, представленной общей электрокерамических пластины управляемой собственным программным обеспечением. То же самое программное обеспечение также записывает и анализирует выход электронейрография. Запись при вызванном нервной активности через коммерческий дифференциальный усилитель, подключенный к пожарам отполированы стандартных стеклянных микроэлектродов. Полезные советы приведены для улучшения качества препарата, стимуляции и условий записи, чтобы оптимизировать качество записи. Система пригодна для опробования электрофизиологические и оптические свойства ланцетовидными зажимах палисадная окончаний волосяных фолликулов, а такжерезультаты от их фармакологического и / или генетических манипуляций. Пример сочетания электрической записи с механической стимуляции и маркировки с стирильная пиридиния витальным красителем дается.
Introduction
В ланцетные терминалы сенсорных аксонов, иннервирующих фолликулы волос у млекопитающих образуют частоколы вокруг эпителия волос вала. Их цель состоит в том, чтобы обнаружить механическое перемещение волос они окружают. Они представляют собой смесь быстро и медленно приспосабливаясь окончаний, которые в основном производят короткие всплески активности в ответ на движение волос. Активность прекращается очень быстро, когда движение прекращается, даже при наличии непрерывного перемещения. Здесь мы опишем развитие этой мышиной модели ушной раковины для корреляционных исследований структуры и функции в ланцетными терминалах. Пина имеет много выгодных возможностей для изучения этих окончаний. Во-первых, ушной раковины, по существу, два слоя кожи обратно соединенный к спине, с небольшим количеством другой ткани между ними, чтобы препятствовать доступу к фолликулах и терминалов. Кожа очень тонкая и легко рассекают за счет минимальных количеств жесткой соединительной ткани. Иннервации легко доступен и идентифицировать. В то время как follicl волосэс присутствуют, они сравнительно редко распределены, что способствует стимуляции отдельных или небольших групп фолликулов механическим способом. Тонкий базовый слой кожи дает хороший доступ к нервных окончаний с фармакологическими препаратами и красителями. Это делает их особенно идеально подходит для исследований визуализации с использованием флуоресцентной микроскопии. Формирования изображения может быть либо в живых терминалах, или после фиксации и последующей гистологической обработки.
Реакции механосенсорных нейронов , иннервирующих волосяные фолликулы традиционно изучались в грызуна вибриссами 1,2 и, в меньшей степени, в изолированных препаратах кожи 3,4. Они научили нас много о общих принципах механосенсорных физиологии в нервных окончаний, окружающих стержень волоса. Vibrissal подготовка позволяет изысканный контроль над движением одного волосяного фолликула. Тем не менее, это может быть трудно расшифровать выход из-за его сложности, так как vibrissalфолликулы содержат по меньшей мере 8 различных типов анатомически отчетливым механосенсорных окончание 5 и согласование этих морфологических типов к конкретным электрофизиологических ответов по – прежнему является предметом спора. / Подкожная подготовка нерва кожи мыши чаще всего используется в депилированной состоянии исследовать сенсорные и болевые реакции. Иннервация волосяных фолликулов в таком препарате является менее сложным , но плотность волосяных фолликулов, а также наличие трех различных типов фолликула (сторожевых, шило / auchene и зигзагообразные волоски) в такой непосредственной близости 6, означает изучение конкретных ответы один фолликул или один тип окончание снова бросает вызов. Кроме того, этот препарат включает в себя сложное рассечение. И, наконец, в обоих vibrissal и других кожных препаратах, то трудно представить себе окончаний , участвующих в то время как экс виво препараты все еще живы. Таким образом, требуется ткани секционирования даже в GFP-экспрессирующих мышей линий. AlternatiVely, это требует дальнейшего гистологического / иммунологические обработки, такой как фиксации и / или инкубацией антител для иммунофлуоресценции.
Поэтому мы разработали препарат PINNA и использовали его, чтобы сделать электрические записи с ограниченным населения волосяной фолликул афферентов и показать, что езда на велосипеде мембраны происходит в этих ланцетными окончаний, о чем свидетельствует поглощение стирильная пиридиния красителей. Наконец, мы показали, что краситель не мешает механической чувствительности, что указывает на его не блокирует механотрансдукция каналов. Результаты простых стимуляции и анализа протоколов проиллюстрированы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы разработали сравнительно простую препарат, который может быть быстро рассекают, имеет низкую плотность волосяного фолликула и позволяет относительно селективным механической стимуляции небольшого количества волосяных фолликулов. Он легко доступен для электрофизиологические записи и флуоресцентных изображений живых клеток, в том числе ответы на окрашивают приложение для визуализации механически стимулированных волосяные фолликулы, то есть фолликулы визуализации с определенными электрофизиологических ответов. В то время как мы еще не сделали этого, эта система также кажется, легко поддается подразделяя сенсорную нерва для одной единицы (одного сенсорной аксонов) записи и использованием целевых GFP-выражения для визуализации сенсорной морфологии терминала завершено.
Мы использовали препарат уха кожи для того чтобы исследовать характеристики интернализации и высвобождения флуоресцентного мембраны стириловых pridinium красителей 7, метод , первоначально разработанный для изучения локализованную ВесичМембрана утилизацию ле в синаптических окончаний 8. В синапсах, визуализация также легко сочетается с одновременной электрофизиологические записи ответов в определенных терминалов 8,9. Именно в этих ранних исследованиях , которые мы впервые отметили красители были усвоены механосенсорных окончаний 10. Для сенсорных нейронов в культуре , так и в волосковых клетках улитки, большая часть маркировки с помощью стирильная пиридиния красителей , кажется, вовлекает красители , проходящие через механосенсорных каналы, которые они затем блокируют 11,12. Красители затем маркировать внутриклеточных мембран, и эта маркировка является необратимым. Тем не менее, в клетках волос, которые механически не стимулируется 13,14 и в полностью дифференцированных первичных сенсорных нервных окончаний на месте, таких как Ia окончаний мышечных веретен 15, а в ланцетными окончаний здесь 7, маркировка стирильная краситель , кажется, отражает мембранный эндоцитоз, так как маркировка является обратимым и не блокирует механосенсорных Резponses 7,15,16. Хотя некоторые интернализации красителя канала просачивания в этих окончаний не может быть исключена полностью, как видно из дальнейшего обжига во время инкубации с красителем и обратимости маркировки , что подавляющее большинство маркировки в дифференцированных терминалов на месте является интернализации с пузырьком рециркуляции мембрана. Таким образом, этот простой метод легко использовать для комбинированного электрического и оптического мониторинга диапазона механосенсорных терминальных функций в естественных условиях бывших тканей.
Как и в большинстве практических методов, воспроизводимости потребует повторения и практики. Некоторые из ключевых моментов стоит особое внимание теперь будет описано. На протяжении рассечение и записи сессии, максимально жизнеспособности тканей и выживания за счет обеспечения подготовки постоянно озарен физиологическим раствором полностью насыщенной 95% O 2/5% CO 2. Убедитесь, что волосяные фолликулы не смещаются во время этого процесса, ВГIch будет стимулировать сенсорную окончание стрельбы. Либо использовать непрерывную систему ламинарного потока перфузионного или тщательно пузырьковой газа через ванночку с тонкой трубкой на расстоянии от препарата, или тщательно обновлять каждые 20-30 Solutions мин, поддерживая препарат ниже соляного поверхности во все времена. записи всасывания электроды изготовлены путем модификации острых электродов боросиликатного пипеток, обычно используемых для внутриклеточной регистрации. Во-первых, тщательно прекращаться острые кончики с # 3 щипцами, чтобы дать соответствующий внутренний диаметр, чтобы соответствовать нервы и огневую полировку очень короткой (<1 сек) воздействия пламени горелки Бунзена (см 2.4 и 2.5). Для того, чтобы получить хорошее отношение сигнал-шум при записи, то важно, чтобы электрическое сопротивление (сопротивление) в этих двух электродов и максимальна и равна. Сделайте это, обращая внимание на следующее в двух электродов. Для записи электрода, обеспечивает внутренний диаметр подогнаны под нерва, а максимальная длина пеRVE втягивается в записи электрода. Попробуйте использовать соединительную ткань, окружающую нерв, чтобы эффективно герметизировать кончик электрода. В качестве альтернативы, или в дополнение, рисовать узкий конец подходящего размера, сужающейся части жировой ткани в вдоль нерва. Затем подключаем кончик электрода с применением сильного всасывания в течение ~ 1 мин с 50 мл шприца, прикрепленной к трубке. Для хорошо уплотненной наконечника, применяя сильное всасывание будет просто повысить эффективность пробки и не втягивать больше жидкости или нерва. Во избежание повреждения нерва, однако, убедитесь, что соединительная ткань смягчаются нерва от сжатия на окружающем материале и EAM хряща. Индифферентный электрод должен имитировать сопротивление / импеданс электрода записи настолько близко, насколько это возможно. Этому способствует тщательно Спиртовая кончик к как малые апертуры, как это возможно без фактического герметизации его. Если дальнейшее сопротивление необходимо, а затем вставьте конец индифферентного электрода с ADIPOС.Е. соединительной ткани, как было описано выше для записи электрода.
Электрокерамических дает изысканный контроль над механическим перемещением, как в пространстве и во времени. Тем не менее, заботиться делая электрические соединения – высокие температуры уничтожают их, так что не используйте горячую припой. Используйте металлическую загруженным эпоксидный клей, или использовать специализированную насаживаемая розетку, рекомендованный поставщиком. Это и надежно удерживают и установить электрическое соединение. Прикрепите стекло стимулирующее зонд к электрокерамических со стандартной эпоксидной смолой. Противопожарные польский конец стандартного 10 см х 1,5 мм боросиликатного диаметр стеклянной капиллярной трубки, используемый для изготовления патч или острые электроды для электрофизиологические записи, чтобы свести к минимуму риск повреждения тканей. Если требуется один волос стимуляции фолликул, пожарно-польский кончик, чтобы соответствовать один волос, и поместите зонд с одним волос внутри открытой диафрагме. Это дает изысканный контроль над одной волос. Для стирилового Dyе маркировки, то, как правило, более однородны в тканях от молодых животных. Не совсем понятно, почему, но это, вероятно, отражает меньшую механическую травму и более эффективное удаление глубоких тканей из молодых тканей. Будьте внимательны при удалении пенистый слой напоминающее пенополистирола, залегающего волосяных фолликулов основания. Тем не менее, во избежание слишком энергично, так как это риск удаления нервных сплетений слоя и связанных с ними ланцетовидные терминалы. Если есть мало или нет электрический ответ на движение волосяного фолликула, а также применение стирильная красителя приводит к преимущественному маркировке сальных желез (желтый / белый), с отчетливым автофлюоресценции основания стержня волоса, а не ланцетными окончаний (оранжевый / желтый), чрезмерно восторженный зазор повредил прилежащие ткани. И, наконец, с помощью агента красителя хелаты до обработки изображений значительно повышает контрастность изображения и качество конечных изображений.
Этот метод может быть полезен в ряде дальнейших исследований. Это сотрудничествоULD включают в себя, например, скрининг на механосенсорных канала (ов), ответственного за натяжных вызвали ответы, путем инкубирования препарат с фармакологическими лигандами селективными для кандидатов каналов или скрининга линий мышей с такими каналами генетически удалены. Последнее может быть в сочетании с оценкой флуоресценции каких – либо изменений в терминальной морфологии из – за генетических манипуляций в линиях мыши, например , с помощью Npy2r-связанного выражения 17 GFP. Последним примером может быть изучение роли синаптических типа везикул (КРН) 7 в этих ланцетными терминалов путем изучения влияния модуляторов оборота SLV (Ca, Mg, latrotoxin, лиганды рецептора глутамата) на натяжных вызвали ответы и поглощения стирильная красителя /выпуск. Таким образом, эта новая технология открывает целый ряд потенциально интересных направлений исследований в mechansensory нейробиологии.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
Riferimenti
- Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).
- Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
- Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).
- Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).
- Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).
- Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3 (1), 1 (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
