마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록
Summary
A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Abstract
신규 해부 및 녹화 기술은 마우스 날개에 머리카락의 기계적인 변위에 의해 유발 모니터링 구 심성 발사에 대해 설명한다. 이 기술은 매우 경제적이고 용이 가장 흔히 전기 생리학 실험실에서 발견 또는 쉽게 구입할 재료로 수행된다. 해부는 독점 소프트웨어에 의해 제어되는 일반 electroceramic 웨이퍼에서 제공하는 기계적인 변위, 간단하고 빠르다. 동일한 소프트웨어는 또한 기록하고 electroneurogram 출력을 분석한다. 유발 된 신경 활동의 기록은, 화재 연마 표준 유리 미소 전극에 접속 된 상용 차동 증폭기 통해서이다. 유용한 정보는 제조, 자극과 기록 품질을 최적화하기위한 촬영 조건의 품질을 개선하기 위해 주어진다. 시스템은 물론 모낭의 방어벽 엔딩 피침 단자의 전기 생리 학적 및 광학적 특성을 분석에 적합자신의 약리 및 / 또는 유전자 조작의 결과. 스티 릴 피리 디늄 중요한 염료 기계적 자극 및 라벨과 전기적으로 기록을 조합의 예를 설명한다.
Introduction
감각 축삭의 피침 형 단자는 포유 동물의 모낭은 머리카락 샤프트 상피 주위 벼랑을 형성 지배하는. 그 목적은 서라운드 모발의 기계적 변위를 검출하는 것이다. 그들은 빠른 속도로 천천히 주로 머리의 움직임에 반응하여 활동의 짧은 버스트를 생성 엔딩 적응의 혼합이다. 이동도 계속 변위의 존재 멈출 때 활동 매우 빨리 중단. 여기에서 우리는 구조의 상관 관계 연구를위한이 쥐의 날개 모델의 개발을 설명하고 피침 형 단말기에서 작동합니다. 귓바퀴는이 엔딩 연구를위한 많은 유리한 기능을 가지고 있습니다. 첫째, 날개는 모공과 터미널에 대한 접근을 방해하는 사이에 피부 기본적으로 두 개의 층이 조금 다른 조직으로, 백투백 나란히 놓이는이다. 피부 때문에 힘든 결합 조직의 최소한의 금액에 매우 얇고 쉽게 해부하다. 신경 분포가 쉽게 접근하고 식별 할 수 있습니다. 머리 follicl 동안ES는 상대적으로 드문 드문 기계적으로 모공의 개인 또는 소규모 그룹의 자극을 용이하게 분산되어 존재한다. 얇은 기본 피부 층은 약리학 적 약물 및 염료와 신경 단자에 좋은 접근성을 제공합니다. 이것은 형광 현미경을 이용하여 촬영 연구에 특히 적합한다. 이미징은 어느 생활 터미널에서, 또는 고정 및 추가 조직 학적 처리 후이 될 수 있습니다.
mechanosensory 뉴런의 반응은 모낭은 전통적으로 고립 된 피부 준비 3,4에, 조금 적게, 1, 2 코털 (vibrissae) 설치류에서 공부 한 지배하는. 다음은 모발 주변의 신경 말단에서 mechanosensory 생리학의 일반 원칙에 대해 우리가 많이 가르쳤다. vibrissal 준비는 단일 모낭의 움직임을 통해 정교한 제어 할 수 있습니다. 그러나 vibrissal 같이 복잡성으로 인해 출력을 해독하기가 어려울 수있다여포는 해부학 적으로 별개의 mechanosensory 결말 (5)의 적어도 8 가지 유형을 포함하고 특정 전기 생리 반응에 이러한 형태 학적 유형의 일치는 여전히 논쟁의 문제이다. 마우스 피부 / 복재 신경 제제는 주로 터치 통증 반응을 조사하기 위해 면도 한 상태에서 사용된다. 이러한 준비 모낭의 신경 분포는 덜 복잡하지만 모낭의 밀도, 플러스 등의 근접 6 세 가지 뿌리 유형 (가드, 송곳 / auchene 및 지그재그 머리카락)의 존재는, 특정 응답을 공부 의미 단일 모낭이나 결말의 하나의 유형은 다시 도전하고있다. 또한,이 제제는 복잡한 해부을 포함한다. 마지막 vibrissal 및 기타 피부 제제 모두에서, 제제는 아직 살아있는 생체 상태 관련된 결말을 시각화하기 어렵다. 따라서, 조직 절편은 GFP 발현 마우스 라인도 필요합니다. 교류 직류vely, 이러한 면역에 대한 고정 및 / 또는 항체 배양 등의 추가 면역 학적 / 조직 학적 처리가 필요합니다.
따라서 우리는 날개 준비를 개발하고 모낭의 구 심성의 제한된 인구에서 전기 녹음을 만들기 위해 그것을 사용하고 막 사이클링 스티 릴 피리 디늄 염료의 흡수에 의해 입증이 피침 엔딩에서 발생 보여왔다. 마지막으로, 염료는 mechanotransduction 채널을 차단하지 나타내는 기계적 감성을 방해하지 않는 것으로 나타났다. 간단한 자극 프로토콜 분석의 결과가 도시되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 빠르게 절개 할 수있는 비교적 간단한 제제를 개발 낮은 모발 밀도 모낭 소수의 비교적 선택적 기계적 자극을 허용한다. 그것은 기계적 자극 모낭, 정의 된 전기 생리 반응으로, 즉 영상 여포를 시각화 응용 프로그램을 염색 할 수있는 응답을 포함하여 전기 생리 레코딩 및 라이브 셀 형광 이미징을위한 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 우리가하지 않은 반면,이 시스템은 하나의 단위 (하나의 감각 축삭) 기록에 대한 감각 신경을 하위 분할 및 감각 터미널 끝나는 형태를 시각화 대상 GFP 표현을 사용하여 쉽게 의무 보인다.
우리는 내재화를 형광 막 스티 pridinium 염료 (7)의 방출 특성을 조사하기 위해 귀 피부 제제를 사용하고, 기술은 원래 국소 vesic을 연구 개발시냅스 터미널 8 르 막 재활용. 시냅스에서, 영상도 쉽게 식별 단말기 8,9의 응답을 동시에 전기 생리 녹화와 결합된다. 우리가 먼저 염료는 mechanosensory 엔딩 (10)에 의해 내면화 된 기록이 초기 연구했다. 문화 및 달팽이관의 유모 세포의 감각 뉴런를 들어, 스티 릴 피리 디늄 염료에 의한 표시의 대부분은 다음 11, 12를 차단하려면 mechanosensory 채널을 통과하는 염료를 포함하는 것으로 보인다. 염료는 세포 내 세포막을 라벨,이 라벨은 되돌릴 수 없습니다. 그러나, 유모 세포에 기계적으로 13,14 자극되지 않은 완전히 차별화 된 차 감각 신경 근육 스핀들 (15)의 IA 엔딩으로 현장에서 단말기, 여기에 7 피침 엔딩에,에 스티 릴 염료 라벨은 막 세포 내 이입을 반영하는 것으로 보인다 라벨은 가역적이며, mechanosensory 입술을 차단하지 않기 때문에7,15,16을 ponses. 이 엔딩에 채널을 투과하여 일부 염료 국제화가 완전히 배제 할 수는 없지만, 현장에서 차별화 된 터미널에서 라벨의 대다수는 재활용 소포와 국제화에 의해이라고 염료 배양 동안 계속 발사와 라벨의 가역성에서 분명하다 막. 따라서, 이러한 간단한 방법은 용이하게 생체 조직에서 mechanosensory 단말의 다양한 기능의 조합 전기적 및 광학적 모니터링을 위해 사용된다.
가장 실용적인 기술과 마찬가지로, 재현성 반복과 연습이 필요합니다. 요점 일부 가치가 특별한주의를 설명한다. 해부 기록 세션을 통해, 제조가 계속 완전히 95 % O 2 / 5 % CO 2로 포화 식염수로 관류하도록하여 조직 생존 및 생존을 극대화. 어, 모공이 과정에서 변위되지 않는 머리를 확인무형 문화 유산은 감각 엔딩 발사를 자극 할 것이다. 어느 제제로부터 떨어진 미세 튜브와 기관 욕 통해 연속 층류 관류 시스템 또는 신중 버블 가스를 사용하거나 신중 항상 식염수 표면 아래 제조 유지 솔루션마다 20-30 분 리프레시. 흡입 기록 전극은 일반적으로 세포 내 기록에 사용되는 날카로운 전극 붕규산 피펫을 수정함으로써 제조된다. 첫째, 신중하게 분젠 버너 화염에 아주 짧은 (<1 초) 노출에 의해 신경 및 화재 – 폴란드어에 맞게 적절한 내부 직경을주는 #로 3 집게를 날카로운 팁을 끊다 (2.4 및 2.5 참조). 기록 좋은 신호대 잡음비를 얻기 위해서는, 이들 두 전극의 온 저항 (내성)을 최대화하고 균등 쌍방 것이 필수적이다. 상기 두 전극에 다음에 주목하여이 작업을 수행합니다. 기록 전극의 경우, 내부 직경은 신경을위한 꼭 맞는 및 NE의 최대 길이를 확보RVE는 기록 전극로 흡입된다. 효과적으로 전극의 끝 부분을 밀봉하는 신경 주위의 결합 조직을 사용하려고합니다. 대안 적으로 또는 부가 적으로, 신경 옆에서 지방 조직의 적절한 크기, 테이퍼 부분의 좁은 끝을 그린다. 이어서, 튜브에 부착 된 50 mL의 주사기와 ~ 1 분 동안 강력한 흡입을인가함으로써 전극 팁 플러그. 잘 밀봉 된 팁의 경우, 강한 흡입을 적용하는 것은 단순히 플러그의 효율성을 강화하고 더 많은 액체 또는 신경에 그릴 수 없습니다. 신경 손상을 방지하기 위해, 그러나, 결합 조직이 주변의 재료와 EAM 연골에 압축에서 신경 쿠션되어 있는지 확인합니다. 무관심 전극 최대한 가깝게 기록 전극의 저항 / 임피던스를 모방한다. 이 심하게 불 연마 실제로 실링없이 가능한 한 작은 구멍에 팁의 도움된다. 상기 저항이 필요한 경우, adipo와 무관 전극의 단부를 연결SE 결합 조직, 기록 전극 전술 한 바와 같이.
electroceramic는 공간적 시간적, 기계적인 변위를 통해 정교한 제어 할 수 있습니다. 높은 온도는 그들을 파괴, 너무 뜨거워 솔더를 사용하지 않는 – 그러나, 전기 연결을주의하십시오. 금속로드 에폭시 접착제를 사용하거나 공급 업체에서 권장하는 전문가 푸시 맞는 소켓을 사용합니다. 이 모두를 단단히 잡고 전기 연결을 설정합니다. 표준 에폭시 수지와의 electroceramic에 유리 자극 프로브를 연결합니다. 불 닦으 표준 10cm의 끝이 조직 손상의 위험을 최소화하기 위해 전기 생리 학적 기록 패치 나 날카로운 전극 제조에 사용되는 1.5 mm 직경의 보로 실리케이트 유리 모세관 튜브를 X. 단일 모낭의 자극이 필요한 경우, 화재 – 폴란드어 팁은 하나의 머리에 맞게, 그리고 개방 조리개 내부에 하나의 머리를 가진 프로브를 배치합니다. 이것은 하나의 머리 위에 정교한 제어 할 수 있습니다. 스티 DY에 대한전자 표시는, 그것이 어린 동물 조직에서 일반적으로 더 균일하다. 그것은 왜 완전히 명확하지 않다, 그러나 이것은 가능성이 젊은 조직에서 적은 기계적 외상 및보다 효과적인 깊은 조직 제거를 반영한다. 모낭의 기초 위에 놓인 거품 층 닮은 발포 폴리스티렌 제거에 철저해야합니다. 이것은 신경 얼기 층과 연관된 피침 단말기 위험을 제거하지만, 너무 격렬 피하기. 거의 또는 전혀 전기 모낭의 움직임에 응답하고, 스티 릴 염료 프로그램이있는 경우 (오렌지색 / 노란색) 대신 피침 말단보다 모발의베이스의 구별자가 형광과, (황색 / 백색) 피지선의 주된 표시 리드 오버 열정적 인 여유는 기본 조직을 손상했다. 마지막으로, 이미징 전에 염료 킬레이트 제를 사용하는 것은 매우 최종 이미지의 이미지 콘트라스트과 품질을 향상시킵니다.
이 기술은 추가 연구의 범위에서 유용 할 수있다. 이 공동자민련 후보 채널에 대한 선택적 약물 리간드와 준비를 배양하거나 유전자 삭제 등의 채널을 마우스 선을 선별하여, 스트레치 유발 반응에 대한 책임이있는 mechanosensory 채널 (들)에 대한 심사, 예를 들어, 등이 있습니다. 후자 인해 Npy2r 링크 GFP 발현 17 예, 마우스 라인에서 유전자 조작에 터미널 형태의 변경의 형광 평가와 결합 될 수있다. 마지막 예는 SLV 매출의 조절의 효과를 검사하여 이러한 피침 터미널에서 시냅스 같은 소포의 역할 (SLV는) 7을 조사 할 수있다 (칼슘, 마그네슘을, latrotoxin, 글루타메이트 수용체 리간드) 스트레치 유발 반응과 스티 릴 염료 흡수에 /해제. 따라서,이 새로운 기술은 mechansensory 신경 과학 연구의 잠재적 흥미로운 도로의 범위를 엽니 다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
Riferimenti
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