Enregistrement combiné de Mécaniquement Stimulé Afférent Sortie et Nerve Terminal Etiquetage Souris follicule pileux lancéolées Endings
Summary
A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Abstract
Une technique de dissection et l'enregistrement roman est décrit pour afférences de surveillance tir évoqué par déplacement mécanique des poils dans le pavillon de la souris. La technique est très rentable et facilement réalisé avec des matériaux rencontrés dans la plupart des laboratoires d'électrophysiologie, ou facilement achetés. La dissection est simple et rapide, avec le déplacement mécanique fournie par une plaquette électrocéramique générique contrôlée par un logiciel propriétaire. Le même logiciel enregistre et analyse également la sortie de electroneurogram. L'enregistrement de l'activité nerveuse évoquée est à travers un amplificateur différentiel commercial relié à microélectrodes en verre standard poli-feu. Conseils utiles sont donnés pour améliorer la qualité de la préparation, la stimulation et les conditions d'enregistrement pour optimiser la qualité d'enregistrement. Le système est adapté pour analyser les propriétés électrophysiologiques et optiques des terminaux lancéolées de terminaisons palissadiques des follicules pileux, ainsi que lales résultats de leur manipulation pharmacologique et / ou génétique. Un exemple de combiner l'enregistrement électrique avec la stimulation mécanique et l'étiquetage avec un colorant vital styryl pyridinium est donnée.
Introduction
Les bornes lancéolées des axones sensoriels innervant follicules pileux chez les mammifères forment autour des palissades de l'épithélium des cheveux arbre. Leur but est de détecter le déplacement mécanique des poils qu'ils entourent. Ils sont un mélange rapidement et lentement, en adaptant les terminaisons qui produisent de façon prédominante de courtes rafales d'activité en réponse au mouvement des cheveux. Activité cesse très rapidement lorsque le mouvement cesse, même en présence d'un déplacement continu. Ici, nous décrivons le développement de ce modèle de pinna murin pour les études corrélatives de la structure et la fonction dans les terminaux lancéolées. Le pavillon possède de nombreuses caractéristiques avantageuses pour l'étude de ces terminaisons. Tout d'abord, le pavillon est essentiellement deux couches de la peau apposés dos-à-dos, avec peu d'autres tissus entre interférer avec l'accès aux follicules et terminaux. La peau est très fine et facilement disséquée en raison de quantités minimes de tissu conjonctif dur. L'innervation est facilement accessible et identifiable. Alors que les cheveux follicles sont présents, ils sont relativement peu distribués, ce qui facilite la stimulation de groupes individuels ou en petits follicules mécaniquement. La mince couche dermique sous-jacente donne une bonne accessibilité aux terminaisons nerveuses avec des médicaments et des colorants pharmacologiques. Cela les rend particulièrement idéal pour des études d'imagerie par microscopie à fluorescence. L'imagerie peut être soit dans les terminaux vivants, ou après la fixation et le traitement ultérieur histologique.
Les réponses des neurones mécano innervant les follicules pileux ont traditionnellement été étudiés chez les rongeurs vibrisses 1,2 et, dans une moindre mesure, dans les préparations isolées de la peau 3,4. Ceux-ci nous ont beaucoup appris sur les principes généraux de la physiologie mécanosensorielle dans les terminaisons nerveuses entourant la tige du cheveu. La préparation vibrisse permet un contrôle exquis sur le mouvement d'un seul follicule pileux. Cependant, il peut être difficile de déchiffrer la sortie en raison de sa complexité, comme vibrissefollicules contiennent au moins 8 types de fin mécanosensorielle anatomiquement distincts 5 différents et l'adaptation de ces types morphologiques aux réponses électrophysiologiques spécifiques est encore un sujet de litige. La peau de la souris / saphène préparation de nerf est le plus souvent utilisé dans son état épilée pour enquêter sur les réponses tactiles et de la douleur. L'innervation des follicules pileux dans une telle préparation est moins complexe , mais la densité des follicules pileux, plus la présence de trois types de follicules différents (de garde, Poinçon / auchene et poils en zigzag) dans une telle proximité 6, signifie étudier les réponses spécifiques de un seul follicule ou d'un type unique de fin est à nouveau difficile. En outre, cette préparation implique une dissection complexe. Enfin, dans les deux vibrisse et d' autres préparations pour la peau, il est difficile de visualiser les terminaisons impliqués tandis que l'ex vivo des préparations sont encore en vie. Ainsi, le sectionnement des tissus est nécessaire même dans des lignées de souris exprimant la GFP. alternatiVely, il nécessite un traitement ultérieur histologique / immunologique telles que la fixation et / ou de l'anticorps d'incubation immunofluorescence.
Nous avons donc mis au point la préparation de penne et l'a utilisé pour faire des enregistrements électriques à partir d'une population restreinte de cheveux afférences du follicule et de montrer que le cyclisme de la membrane se produit dans ces terminaisons lancéolées, comme en témoigne l'absorption de colorants styryl pyridinium. Enfin, nous avons montré que le colorant ne pas interférer avec la sensibilité mécanique, ce qui indique qu'il ne bloque pas les canaux de mécanotransduction. Les résultats des protocoles de stimulation et d'analyse simples sont illustrés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons mis au point une préparation relativement simple qui peut être disséqué rapidement, a une faible densité des follicules pileux et permet une stimulation mécanique relativement sélective d'un petit nombre de follicules pileux. Il est facilement accessible pour l' enregistrement électrophysiologique et des cellules vivantes imagerie de fluorescence, y compris les réponses à teindre l' application pour visualiser les follicules pileux stimulées mécaniquement, à savoir les follicules d'imagerie avec des réponses électrophysiologiques définies. Bien que nous ayons pas fait, ce système semble aussi facilement prête à sous-division du nerf sensitif pour une seule unité (axone sensorielle unique) l'enregistrement et l'utilisation de la GFP-expression ciblée pour la visualisation sensorielle terminale se terminant la morphologie.
Nous avons utilisé la préparation de la peau de l' oreille pour étudier les caractéristiques de l'intériorisation et la libération de la fluorescence styryle membrane pridinium colorants 7, une technique développée à l' origine pour étudier Vesic localiséele recyclage dans la membrane 8 terminaisons synaptiques. En synapses, l' imagerie est également facilement combiné avec enregistrement électrophysiologique simultanée des réponses dans les terminaux identifiés 8,9. Ce fut dans ces premières études que nous avons d' abord noté les colorants ont également été internalisés par les terminaisons mécanosensoriels 10. Pour les neurones sensoriels dans la culture et dans les cellules ciliées de la cochlée, une grande partie de l'étiquetage par des colorants styryle pyridinium semble impliquer des colorants qui passent à travers les canaux mécanosensoriels, qu'ils ont ensuite bloquent 11,12. Les colorants étiquettent ensuite les membranes intracellulaires, et cet étiquetage est irréversible. Cependant, dans les cellules ciliées qui ne sont pas mécaniquement stimulée 13,14 et primaires terminaux complètement différenciées sensorielles nerveuses in situ, comme les terminaisons Ia dans les fuseaux neuromusculaires 15 et dans les terminaisons lancéolées ici 7, l' étiquetage styryle de colorant semble refléter l' endocytose de la membrane, puisque l'étiquetage est réversible et ne bloque pas les res mécanosensorielsponses 7,15,16. Alors que certains intériorisation de colorant par canal perméation dans ces terminaisons ne peut pas être totalement écartée, il est clair à partir de la mise à feu continu pendant colorant incubation et la réversibilité de l'étiquetage que la grande majorité de l'étiquetage dans les terminaux différenciés in situ est par intériorisation avec recyclage vésiculaire membrane. Ainsi, cette technique simple est facilement utilisé pour la surveillance électrique et optique combinés d'une gamme de fonctions terminales mécanosensoriels ex vivo dans les tissus.
Comme avec la plupart des techniques pratiques, la reproductibilité nécessitera la répétition et la pratique. Certains des points clés mérite une attention particulière sera maintenant décrite. Tout au long de la session de dissection et d' enregistrement, de maximiser la viabilité des tissus et de la survie en assurant en permanence la préparation est perfusée avec une solution saline totalement saturé avec 95% O 2/5% CO 2. Assurez-vous les cheveux follicules ne sont pas déplacées pendant ce processus, which stimuleront sensorielle fin tir. Soit utiliser, un système continu d'écoulement laminaire de perfusion, ou bien le gaz de bulles dans le bain d'organe avec des tubes bien à distance de la préparation, ou rafraîchissez soigneusement solutions toutes les 20-30 minutes, en gardant la préparation sous la surface de la solution saline à tout moment. électrodes d'enregistrement d'aspiration sont réalisées en modifiant tranchants pipettes électrode de borosilicate normalement utilisées pour l'enregistrement intracellulaire. Tout d'abord, soigneusement rompre les bouts pointus avec # 3 pinces pour donner le diamètre interne approprié pour tenir les nerfs et le feu-polonais par une très brève (<1 sec) exposition à la flamme du brûleur Bunsen (voir 2.4 et 2.5). Pour obtenir un bon rapport signal-bruit lors de l'enregistrement, il est essentiel que l'impédance électrique (résistance) dans ces deux électrodes est à la fois optimisée et égale. Pour ce faire, en faisant attention à ce qui suit dans les deux électrodes. Pour l'électrode d'enregistrement, vérifiez que le diamètre interne est un ajustement serré pour le nerf, et la longueur maximale de nerve est aspiré dans l'électrode d'enregistrement. Essayez d'utiliser le tissu conjonctif entourant le nerf pour sceller efficacement la pointe de l'électrode. En variante, ou en outre, attirer l'extrémité étroite, une pièce conique de taille appropriée du tissu adipeux dans le long du nerf. Ensuite, branchez la pointe d'électrode en appliquant une forte aspiration pour ~ 1 min avec une seringue de 50 ml fixée à la tubulure. Pour une pointe bien étanche, en appliquant une forte aspiration simplement renforcer l'efficacité de la prise et ne sera pas attirer plus de liquide ou d'un nerf. Pour éviter des lésions nerveuses, cependant, veiller à ce que le tissu conjonctif amortit le nerf de la compression sur le matériau environnant et EAM cartilage. L'électrode indifférente devrait mimer la résistance / d'impédance de l'électrode d'enregistrement le plus près possible. Ceci est facilité par précaution la pointe comme petite une ouverture possible sans réellement sceller polissage-le-feu. Si plus de résistance est nécessaire, puis branchez l'extrémité de l'électrode indifférente avec adiposoi tissu conjonctif, tel que décrit ci-dessus pour l'électrode d'enregistrement.
Le électrocéramique donne un contrôle exquis sur déplacement mécanique, à la fois spatialement et temporellement. Cependant, prendre soin des connexions électriques – températures élevées détruisent, il ne faut pas utiliser la soudure à chaud. Utilisez la colle époxy chargée de métal, ou utilisez une prise emmanchement spécialiste recommandé par le fournisseur. Ce sera à la fois tenir fermement et établir la connectivité électrique. Attacher la sonde de stimulation de verre à l'électrocéramique avec une résine époxy standard. Fire-polish la fin d'une norme de 10 cm x 1,5 mm de diamètre borosilicate tube capillaire de verre utilisé pour la fabrication de patch ou électrodes pointues pour l'enregistrement électrophysiologique pour réduire au minimum le risque de dommages aux tissus. Si la stimulation du follicule pileux unique est nécessaire, le feu-polish la pointe pour adapter un seul cheveu, et positionner la sonde avec un seul cheveu à l'intérieur de l'ouverture ouverte. Cela donne un contrôle exquis sur un seul cheveu. Pour styryle dye étiquetage, il est généralement plus uniforme dans les tissus des animaux plus jeunes. Il est pas très bien pourquoi, mais cela reflète probablement moins un traumatisme mécanique et l'élimination des tissus profonds plus efficace des tissus plus jeunes. Être complet en enlevant la couche mousseuse ressemblant à du polystyrène expansé recouvrant la base des follicules pileux. Toutefois, éviter d'être trop vigoureuse, car cela risque d'élimination de la couche nerf du plexus et des terminaux lancéolées associés. S'il y a peu ou pas de réponse électrique pour un mouvement de follicules pileux, et l'application styryle de colorant conduit à l'étiquetage prédominante des glandes sébacées (jaune / blanc), avec une autofluorescence distincte de la base de la tige du cheveu plutôt que de fins lancéolées (jaune orange /), jeu trop enthousiaste a endommagé les tissus sous-jacents. Enfin, l'utilisation d'un agent chélateur formateur de colorant avant l'imagerie améliore considérablement le contraste d'image et de la qualité des images finales.
Cette technique pourrait être utile dans une gamme d'autres études. Ces coULD comprennent, par exemple, le criblage de la chaîne mécanosensorielle (s) responsable des réponses évoquées par étirage, par incubation de la préparation avec des ligands sélectifs pour les canaux pharmacologiques candidats ou le criblage des lignées de souris génétiquement avec ces canaux supprimés. Ce dernier pourrait être combiné avec l' évaluation de la fluorescence de tout changement dans la morphologie terminale due à la manipulation génétique des lignées de souris, par exemple avec l' expression de la GFP Npy2r liée 17. Un dernier exemple peut être étudier le rôle des vésicules synaptiques-like (SLV) 7 dans ces terminaux lancéolées en examinant l'effet de modulateurs de chiffre d'affaires SLV (Ca, Mg, latrotoxine, des ligands de récepteurs de glutamate) sur les réponses d'étirement évoqués et l' absorption styryle de colorant /Libération. Ainsi, cette nouvelle technique ouvre un éventail de pistes potentiellement intéressantes de la recherche en neurosciences mechansensory.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
Riferimenti
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