의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em> Coxiella burnetii의</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella의 burnetii는 Q 열병을 일으키는 원인이되는 에이전트는 의무적 세포 내 세균이다. PCR 기초 진단 분석법 C. 검출을 위해 개발되어왔다 세포 배양 및 임상 시료에서 burnetii DNA. PCR은 특수 장비와 다양한 최종 사용자 교육을 필요로하며, 따라서, 특히 자원이 제한된 지역에서 일상적인 작업에 적합하지 않습니다. 우리는 C.의 존재를 검출하는, 루프 – 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석법을 개발 환자 샘플에서 burnetii. 이 메소드는 수조 또는 히팅 블록에 60 ° C의 주위에 하나의 온도에서 수행된다. 이 LAMP 분석의 감도는 반응 당 25 카피의 검출 한계 PCR 매우 유사하다. 이 보고서는 동결 건조 된 시약 및 hydroxynaphthol 청색 (HNB) 또는 반응 인터 형광 염료와 UV 램프를 사용하여 결과를 시각화하여 반응의 제조를 설명한다. 램프 시약은 lyophili했다평탄화 및 검출 감도의 손실없이 한달 동안 실온 (RT)에 저장된다. 반응 혼합물을 준비 복잡한 단계를 포함하지 않기 때문에이 LAMP 분석법이 특히 강하다. 이 방법은 Q 열병이 발병 자원 제한 설정에서 사용하기에 이상적이다.
Introduction
작은 그람 음성 박테리아 Coxiella burnetii는 전 세계적으로 인수 공통 전염병 인 Q 열병의 원인 물질이다. 때문에 Q 열병의 전세계 유통 및 C의 높은 감염에 burnetii는 해외 배치 미군과 민간인은 발병 지역에서 감염 될 위험이 있습니다.
급성 및 만성 감염 : Q 열병은 두 가지 형태로 나타난다. Q-급성 발열 독감 유사 증상, 간염, 폐렴 자체를 제공하고, 일반적으로 낮은 사망률 자기 한정 질환이다. 만성 Q-열이 덜 유행하면서, 자주 1,2 방치하면 훨씬 더 높은 사망률을 가지고 심내막염, 발생합니다. 따라서 조기 진단 적절한 치료가 환자 치료에 중요 안내합니다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 및 실시간 정량 PCR (qPCR에) 분석법 C. 검출을 위해 개발되어왔다 세포 배양 및 임상 샘플 3-5 <에 burnetii DNA/ SUP>. PCR 및 qPCR에 모두 비용과 일상적인 작업을위한 자원이 제한된 지역에서 자주 쉽게 사용할 수 없습니다.
원래 Notomi 6 설명, 루프 – 매개 등온 증폭 (LAMP)는 다른 DNA 증폭 방법을 제공합니다. LAMP은 표적 유전자의 적어도 6 독립 영역을 인식 특별히 설계된 프라이머 세트와 함께 나선 치환 DNA 합성 BST DNA 중합 효소를 사용한다. LAMP의 가장 중요한 장점은 증폭 등온 조건에서 발생한다는 것이다. 따라서, 단지 수욕 가열 블록 또는 인큐베이터가 필요하다. 이 방법은 여러 리케차 7-9 병원균을 검출하기 위해 사용되어왔다. 겔 전기 영동에 의해 증폭 된 DNA 제품의 시각화에 의한 비특이적 증폭 오탐 (false positive)에서 진정한 양성을 차별화 할 수있는 가장 정확한 방법입니다. 그러나 겔 전기 영동에 관련된 절차 리소스 제한 AR위한 실용적이지 않다EAS. 몇몇 다른 방법이 반응 생성물을 검출하기 위해 개발되었다. 피로 인산 마그네슘을 형성 (10) 또는 인터 형광 염료를 사용하여 유도 된 탁도 11,12 UV 광 하에서 가시화 될 수 등이 대안은 겔을 실행하는 것보다 더 유리하다. Q 열병이 발병 13 곳 열대 및 아열대 국가에서 주위 온도가있는, 25 ° C, 37 ° C에서 보관하면 램프 시약은 1 개월 안정적이었다.
램프와 분석은 C.의 존재를 검출하기 위해 실험실에서 개발 된 플라즈마 샘플 14 burnetii. 여기서 우리는 동결 건조 된 시약의 LAMP 반응 혼합물의 제조를위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 실온에서 저장 될 때 동결 건조 된 시약은 1 개월 안정하다. 쉽게 시각화 방법과 결합 될 때, 이는 C. 검출에 사용하는 이상적인 방법은 자원 제한 설정에서 burnetii.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전에, 우리는 삽입 요소 IS1111a (14) 대상으로 민감하고 특정 LAMP 분석을 개발했다. 그것은 매우 C.의 다른 균주 사이에서 보존되어 있기 때문에 IS1111 소자 선택한 burnetii와 박테리아의 사본의 높은 번호 (110-7) (클레 2006). 우리의 결과는 LAMP가 Coxiella DNA의 적은 하나 염색체 사본에 상관 관계가있다 IS1111 요소의 약 25 복사본을 감지 할 수있는 것으로 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 해군 의료 연구 센터, 연구 작업 단위 6000.RAD1.J.A0310에 의해 지원되었다. 이 문서에 표현 된 의견은 저자의 것이며, 반드시 해군, 국방부, 또는 미국 정부의 부서의 공식적인 정책이나 입장을 반영하지 않습니다. 웨이 메이 칭은 미국 정부의 직원이다. 이 작품은 그녀의 공무의 일환으로 제조 하였다. 제목 17 USC §105은 '이 제목에서 저작권 보호는 미국 정부의 모든 작업에 사용할 수 없습니다.'고 제공 제목 17 USC §101은 그 사람의 공무의 일환으로 병역 구성원 또는 미국 정부의 직원에 의해 제조 된 작품으로 미국 정부의 작업을 정의합니다.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
Riferimenti
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