אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

הערה: פרוטוקול זה מתאר העיבוד בו הזמני של דגימות באמצעות מערכת MiSeq NGS אבל יכול להיות מותאם עבור מכשיר מכונת הגנום האישי (PGM). עבור קלט DNA המינימלי המומלץ של 400 עותקים תבנית amplifiable, assay הוא מסוגל לייצר לפחות כיסוי החציוני 3,000x עבור כל אחד 96 דגימות לכל בטווח NGS, ועומק כיסוי שווה ערך ל -24 דגימות באמצעות PGM על שבב 318. השיטה גם מחייב שימוש של מכשיר PCR בזמן אמת. כימות 1. DNA פונקציונלית ובקרת איכות (QC) ריאגנטים הפשרה: מיקס מאסטר 2x, מערבבי Probe פריימר, מערבבי Probe פריימר עיכוב, 6-carboxy-X-rhodamine (רוקס), ממס, וארבעה סטנדרטים עקומי כיול DNA האנושי גנומית (תקן ה- DNA (50 ng / μl), DNA רגיל (10 ng / μl), תקן ה- DNA (2 ng / μl), ו- DNA רגיל (0.4 ng / μl)) (טבלה 1). וורטקס כל ריאגנטים עבור 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן.שמור את תערובת מאסטר 2x על הקרח. הכן כמות מספקת של תערובת אב המספר הכולל של דגימות להיבדק וכולל 10% יותר נפח כדי להימנע ממחסור בשל pipetting. מכינים את תערובת מאסטר בצינור microcentrifuge באמצעות הכרכים הבאים לדגימה: 5 μl מיקס מאסטר 2x, 0.5 μl פריימר Probe Mix, 0.5 μl עיכוב פריימר Probe Mix, 0.05 רוקס μl ו 2.95 הממס μl. וורטקס למשך 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. להוסיף תערובת אמן 9 μl לתוך הבארות של צלחת 96-היטב. הוסף 1 μl של תקני ה- DNA בשני עותקים כדי ליצור עקומת כיול. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה 5 פעמים. ודא מדגם חומצות הגרעין הוא מעורב היטב לפני השימוש. הוסף 1 מדגם μl לתערובת מאסטר ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. חותם את הצלחת, מערבולת עבור 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. מניחים את הצלחת לתוך מערכת ה- PCR. קצה הוא FAM (כימות תפקודית) וויק (עיכוב תפקודי) גלאי עבור כל דגימה על פי הוראות היצרן. בצעו מחזורי PCR של 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ו -40 מחזורים (15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 1 דקות ב 60 מעלות צלזיוס). לנתח את הנתונים qPCR על ידי יצירת העלילה רגרסיה ליניארית עבור כל הסטנדרטים DNA משוכפל באמצעות פרוטוקולים תוכנה. מגרש את יומן 10 של מספר עותק עבור כל תקן ה- DNA על ציר ה- x לבין הערך q המקביל FAM C על ציר ה- y. אשר שהתוצאות מנפילת מדגם חומצות הגרעין בתוך הטווח הדינמי של עקומת כיול תקני ה- DNA, ולאחר מכן לחשב את הריכוז של ה- DNA הידוע מספר עותק "פונקציונליים" או amplifiable לכל μl מהעמדה המתאימה לו על עקומת סטנדרט התייחסות. איור 1 מציג דוגמאות של עקומות כיול שעברו ונכשלו. </ Li> קבע אם הגברה התרחשה כל תגובה על ידי בדיקת הנוכחות של amplicon היעד הלא-האנושי בערוץ VIC. הערה: כביקורת חיובית, פריימר העיכוב Probe Mix מכיל פריימרים ספציפיים עבור מטרה לא אנושית אקסוגניים ואת התבנית המקבילה. מיקס Probe פריימר העיכוב הוא מרכיב של מיקס מאסטר אשר מתווסף כל תגובה, כולל הבקרה לא-תבנית (NTC). בהיעדרו של מעכב, המוצר PCR עבור היעד שאינם בני אדם תמיד צריך להתגלות בערוץ VIC. Q "מבלי שיבחין" C למדגם בערוץ VIC מעיד על קיומו של מעכבי ה- PCR שעשוי להפיק תועלת לנקות הבא של המדגם לפני עיבוד נוסף. 2. הכנת הספרייה: ג'ין-ספציפי (GS) PCR הכן כמות מספקת של תערובת אב המספר הכולל של דגימות להיבדק וכולל 10% יותר נפח כדי להימנע ממחסור בשל pipetting. מכינים את תערובת מאסטר PCR GS בצינור microcentrifuge באמצעות הכרכים הבאים לדגימה: 5 μl מיקס מאסטר הגברה 2x (טבלה 1) ו 1 μl פאן לוח פריימר סרטן (טבלה 1). מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה, מערבולת עבור 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. Aliquot מיקס מאסטר 6 μl GS PCR לתוך הבארות של צלחת 96-היטב. הוסף 4 μl של כל דגימת חומצות גרעין לתוך בארות בודדות. כדי בארות אחרים, להוסיף 4 μl של הפיקוח FFPE (טבלה 1), 4 μl של שליטה רב-Variant (טבלה 1), ו -4 μl מים nuclease חינם למשך NTC פרוצדורליים. לכל תוספת, ומערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה 5 פעמים. חותם את הצלחת, מערבולת עבור 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. מניחים את הצלחת thermocycler עבור מחזורי PCR הבאים: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס,2 מחזורים (15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 4 דק 'ב 60 ° C), 23 מחזורים (15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 4 דק' ב 72 ° C), ותוסף סופי של 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. החזק על 4 מעלות צלזיוס. הערה: לאחר השלים שלב 2.4, הצלחת תיקרא כמו צלחת PCR GS. הכנה הספרייה 3.: תגית PCR ריאגנטים ההפשרה: מיקס מאסטר אינדקס 2x (טבלה 1) וקודים אינדקס (טבלה 1). וורטקס למשך 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. הערה: קודי מדד הם premixed לספק מערך ייחודי של מדדי pairwise (ברקוד) עבור כל דגימה. צלחת 96-היטב, להוסיף 7.5 μl של מיקס מאסטר אינדקס 2x ו -5.5 μl של קוד מפתח שצוין גם ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. בזהירות לפתוח את צלחת ה- PCR GS, ולהוסיף 2 μL GS PCR מוצר לצלחת החדשה עם מיקס מאסטר. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה 5 פעמים. עבור כל דגימה, להקליט את מזהה לדוגמא ואת קודי אינדקס pairwise המקבילים. חותם את הצלחת, מערבולת עבור 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. מניחים את הצלחת thermocycler ו- PCR במשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 10 מחזורים (30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 55 מעלות צלזיוס, 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס), ותוסף סופי של 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. החזק על 4 מעלות צלזיוס. הערה: לאחר השלים שלב 3.4, הצלחת תיקרא כמו צלחת PCR תג. טיהור ספריית 4. בחירת גודל הסר את חרוזים מגנטיים טהור הכנה הספרייה (טבלה 1) ו הצפת elution (טבלה 1) 2-8 מעלות צלזיוס ולאפשר לאזן RT למשך 30 דקות. להוסיף 9.6 מ"ל 100% אתנול למאגר לשטוף (טבלה 1) מיכל, כובע ומערבבים על ידי היפוך הבקבוק כמה פעמים. וורטקס חרוזים מגנטיים עבור 10 שניות ומוסיפים 11 μl לתוך בארות נפרדות של 96-גם צלחת. פתח את צלחת תג PCR ולהוסיף 10 μl של מוצר תג PCR לתערובת חרוזים pipet 5 פעמים. דגירה את התערובת במשך 4 דקות ב RT. מניחים את צלחת 96-גם על מעמד מגנטי (טבלה 1) למשך 4 דקות. עם צלחת 96-היטב עדיין על דוכן העדים, להסיר ולסלק את supernatant עם טפטפת. הסר את הצלחת 96-היטב מהדוכן המגנטי ולהוסיף 100 המכיל אתנול μl הצפתי לשטוף היטב כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. דגירה של 2 דקות. מניחים את צלחת 96-גם על מעמד מגנטי למשך 2 דקות, ולאחר מכן הסר וזורקים supernatant עם טפטפת. חזור על שלב 4.5, עבור סכום כולל של 2 שוטף אתנול, הסרת פתרון לשטוף כמה שיותר לאחר לשטוף את השני. עם צלחת 96-היטב על המעמד המגנטי, לייבש את החרוזים עבור 2 דקות ב RT, ולאחר מכן להסיר את הצלחת מהדוכן. Resuspend את החרוזים על ידי הוספת 20 μl הצפת elution לכל well ו pipet מעלה ומטה 5 פעמים. דגירה של 2 דקות ב RT. מניחים את צלחת 96-גם חזרה על מעמד מגנטי למשך 4 דקות, ובזהירות להסיר ולהעביר 18 μl של supernatant ברור באר חדשה. הערה: ההליך עשוי להיפסק בבטחה בשלב זה ודוגמאות לאחסן ב -15 עד -30 °. כדי להפעיל מחדש, להפשיר דגימות קפואות על קרח לפני שתמשיך. 5. כימות הספרייה ריאגנטים ההפשרה הספרייה קוואנט (LQ): מיקס מאסטר 2x LQ, פריימר LQ / Probe Mix, LQ רגיל, בקרה חיובית LQ, LQ הממס, ו LQ רוקס (טבלה 1). וורטקס למשך 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. שימוש במוצרי ספרייה מטוהר, לבצע דילול סדרה של כל דגימה בודדת LQ ממס. הוסף 2 μl (מוצר מטוהרים הספרייה) 198 μl LQ הממס ומערבבים עד ומטה עם pipet 10 פעמים. הוסף 2 μl (1: 100 דילול) עד ​​198 μl LQ הממס ומערבבים עד ומטה עם pipet 10 פעמים. הכן כמות מספקת של תערובת אמן LQ עבור המספר הכולל של דגימות להיבדק וכולל 10% יותר נפח כדי להימנע ממחסור בשל pipetting. הכן את מיקס מאסטר LQ בצינור microcentrifuge באמצעות הכרכים הבאים לדגימה: 5 μl 2X LQ מיקס מאסטר, 2 μl LQ פריימר / Probe Mix, 0.5 μl LQ Standard ו- 0.5 μl LQ רוקס. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה, מערבולת עבור 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. להוסיף תערובת אמן LQ 8 μl אל באר של צלחת 96-היטב אופטית. בבארות נפרדות, להוסיף 2 μl ספרייה מדולל, 2 μl LQ הבקרה חיובית 2 μl ממיס LQ (NTC) ומערבב על ידי pipetting מעלה ומטה 5 פעמים. חותם את הצלחת עם סרט דבק אופטי, מערבולת עבור 10 שניות ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. קצה הוא FAM וויק detectors עבור כל דגימה. בצע הגברת PCR באמצעות תנאי אופניים של 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ו -40 מחזורים (15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 1 דקות ב 60 מעלות צלזיוס). קבע את הריכוז של כל דגימה (ננומטר) בשיטת q C ההשוואתית. חישוב ההפרש של LQ הרגילה (VIC C q) הידוע לספרייה הידועה (FAM q C). ריכוז המדגם המדולל (PM) מחושב באמצעות המשוואה הבאה: [Lib Conc] ננומטר = 12.5 x 2 Δ Cq אם באמצעות גורם לדילול למעט 10,000, לחשב את היחס בין הגורם לדילול היעד ל -10,000, ולהתרבות גורם זה על פי מבחן התוצאה של המשוואה ב 5.7. 6. נורמליזציה הספרייה איגום לדוגמא קבע את הריכוז החציוני (ננומטר), מעבר לכל הדוגמאות (שכל אחת מהן מכילה מדד pairwise ייחודי) כדי להיות ונקווה. קבע את volum המדגם הבודדדואר (μl) כדי הבריכה על ידי הכפלת הריכוז החציוני מעבר לכל הדוגמאות ידי 5, אז חלוקת ידי ריכוז הפרט שלה (ננומטר). סיבוב הערך שהתקבל למספר השלם הקרוב ביותר. כרכים עגולים עם ערכים של <2 μl 2 μl, ואמצעי אחסון> 15 μl 15 μl. מוסיפים את נפח מנורמל (μl) עבור כל דגימה לצינור microcentrifuge יחיד כדי ליצור את הבריכה המדגם. חשבתי את הריכוז החדש עבור כל דגימה באמצעות ערכים שלמים מעוגלים ולהקליט את התוצאות. כדי לקבוע את הריכוז של הברכה המדגמת, לחשב את הסכום של כל ריכוזי הפרט ולהקליט את הערך המתקבל (ננומטר). לדלל את הבריכה מדגם 1.25 ננומטר באמצעות רצף הממס (טבלה 1). הערה: ההליך עשוי להיפסק בבטחה בשלב זה ודוגמאות לאחסן ב -15 עד -30 °. כדי להפעיל מחדש, להפשיר דגימות קפואות על קרח לפני שתמשיך. רצף 7. Denatיור הבריכה מדגם בנוכחות v3 בקרה PhiX (טבלה 1) על ידי הוספת את הדברים הבאים: 15 μl של בריכת לדוגמא 1.25 ננומטר, 3 μl של 0.5 ננומטר PhiX ו -2 μl של 1 N NaOH. וורטקס ואחריו בקצרה על ידי צנטריפוגה קצר דגירה במשך 5 דקות ב RT. מניח את ברכת המדגם המפוגלת על קרח. הוסף 8 μl של הספרייה מפוגל כדי 992 μl של חיץ מראש צונן HT1-היב לצינור microcentrifuge. וורטקס בקצרה לערבב, ואחריו צנטריפוגה קצר לאסוף תוכן. שמור על הקרח. להוסיף 600 μl של הספרייה המפוגלת ומדוללת למקם 17 # של המחסנית המגיבה. Primers רצף ההפשרה 1 קרא (טבלה 1), Primers רצף קרא אינדקס (טבלה 1), וכן קרא Primers רצף 2 (טבלה 1). צינורות microcentrifuge, בנפרד לדלל 4 Primers רצף μl עם 636 חיץ μl HT1-היב. הערה: חיץ HT1-היב הוא שנינות הניתניםh בערכה מגיב רצף (טבלה 1). מערבבים על ידי vortexing למשך 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לאסוף תוכן. להוסיף 600 μl של פריימרים רצף מדולל 1 קרא למצב # 18 של מחסנית מגיב רצף, 600 μl של פריימרים בדילול מדד קרא למקם 19 #, ו -600 μl של פריימרים רצף בדילול קרא 2 למקם 20 #. טען את ריאגנטים על המכשיר NGS (טבלה 1) ורצף פי הוראות היצרן. בצע ריצת רצף מחזור 2 לזווג סוף x 150. ניתוח 8. נתונים הערה: תוכנת כלי NGS ממירה תמונות אשכול לקריאות בסיס ועשרות איכות, demultiplexes מדדי pairwise ליצור FASTQ gzip דחוס פרט (* .fastq.gz) קבצים עבור כל דגימה. לפני ניתוח קבצי demultiplexed, הקורא חייב להוריד ולהתקין את התוכנה ביואינפורמטיקה קשורה (לוח1). התוכנה יכולה להיות מותקנת על מחשב Windows כיתת צרכן ואינו דורשת חומרת מחשוב מיוחדת או חיבור לאינטרנט כדי לבצע את ניתוח הנתונים. לחץ לחיצה כפולה על סמל שולחן העבודה תוכנה. התחבר למערכת באמצעות שם המשתמש והסיסמה שסופק במדריך התוכנה. פתח את מרכז השליטה של ​​הפרויקט, ולחץ על "פרויקט חדש". שם הפרויקט לספק תיאור פרויקט אופציונאלי. בחר את סוג לוח NGS מיקוד וסוגי כלי NGS. לחץ על "שמור והמשך". העלה את קבצי FASTQ הדחוסים עבור קדימה לאחור קורא. אל תעלה את FASTQs "לא המסומן", אשר מכיל קורא שלא הצליח demultiplex. לחץ על "שמור והמשך". הזן את מספר עותקי קלט הפונקציונליים להכין כל ספרייה כפי שנקבע על ידי assay הכימות פונקציונלי DNA (ראה שלב 1 לעיל). הוספה ידנית של ערכים או עותק וערכים הדבקה מתוך התפשטותגיליון לטבלת הביאור. לחץ על "שמור והמשך". סקור את הספריות המבוארות נטענות לניתוח ולחץ על "שלח ניתוח" ליזום את הניתוח. מעקב אחר ההתקדמות של הניתוח מוצג דרך מרכז השליטה של ​​הפרויקט. הערה: אינדיקצית מעמד ניתוח מלאה מוצגת כאשר התוצאות מוכנות לבדיקה. סקור את התוצאות נותחו על מדדי מדגם QC כולל כיסוי מוחלט לכל ספרייה, אחוז קורא מסננים חולפים, עומק כיסוי amplicon ואחידות. סקור את הגרסה קוראה לכל ספרייה רצף עם dbSNP, COSMIC, 1,000 הגנום ומקורות אחרים של ביאור ברמה פונקציונלי ואוכלוסייה. לייצא את תוצאות גלם טבלאות גיליון אלקטרוניים לסיכום, * קבצי .bam ו * קבצים .vcf עבור אחסון לטווח ארוך או ניתוח המשך בעלי כלי אינפורמטיקה משלימה.