التصوير الفيديو وخرائط الزمانية المكانية لتحليل الجهاز الهضمي على الحركة في الفئران
Summary
This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Abstract
الجهاز العصبي المعوي (ENS) يلعب دورا هاما في تنظيم الجهاز الهضمي (GI) الحركة ويمكن أن تعمل بشكل مستقل عن الجهاز العصبي المركزي. تغييرات في وظائف ENS هي سبب رئيسي من الأعراض المعدية المعوية والأمراض، ويمكن أن تسهم في الأعراض المعدية المعوية التي أعلن عنها في الاضطرابات العصبية والنفسية بما في ذلك مرض التوحد. ومن الثابت أن قطاعات القولون معزولة تولد عفوية، الانقباضات الإيقاعية المعروفة باسم القولون ترحيل موتور مجمعات (CMMCs). إجراء لتحليل التنظيم العصبي المعوي من CMMCs في خارج الحي الاستعدادات القولون الماوس يوصف. يتم تشريح القولون من الحيوان ومسح لإزالة محتوى البراز قبل أن يتم مقنى في حمام الجهاز. يتم الحصول على البيانات عن طريق كاميرا فيديو وضعه فوق حمام الجهاز وتحويلها إلى عالية الدقة خرائط الزمانية المكانية عن طريق مجموعة من البرامج في المنزل. باستخدام هذه التقنية، وأنماط مقلص الأساسية والتأثيرات الدوائية على وظيفة ENS في القولون الصورةegments يمكن مقارنة مدى 3-4 ساعة. وبالإضافة إلى ذلك، طول انتشار وسرعة CMMCs يمكن تسجيلها وكذلك التغيرات في قطر الأمعاء وتيرة الانكماش. هذه التقنية مفيدة لتمييز أنماط حركية الجهاز الهضمي في نماذج الفئران المعدلة وراثيا (وفي الأنواع الأخرى بما في ذلك الفئران والخنازير الغينية). وبهذه الطريقة، يتم تسجيل التغيرات التي يسببها دواء في CMMCs في الفئران نوع البرية وفي R451C نموذج الفأر Neuroligin 3 من التوحد. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه التقنية على مناطق أخرى من الجهاز الهضمي بما في ذلك العفج، الصائم واللفائفي وفي سن تنموية مختلفة في الفئران.
Introduction
الجهاز العصبي المعوي (ENS) هي شبكة الخلايا العصبية الذاتية في الجهاز الهضمي وينظم وظائف مختلفة مثل هضم محتوى الأمعاء، وامتصاص المواد الغذائية وإفراز واستيعاب السائل. تقع الخلايا العصبية في ENS في عضلي معوي وتحت المخاطية الضفائر. الضفيرة العضلية المعوية تلعب دورا رئيسيا في تنظيم حركية الجهاز الهضمي 1 في حين الضفيرة تحت المخاطية هي المعنية في المقام الأول في السيطرة على إفراز 2،3. يقع الضفيرة العضلية المعوية بين طبقات العضلات الطولية والدائرية للجدار المعدة والأمعاء. النشاط مقلص من طبقات العضلات الملساء في جدار الأمعاء ويسهل المهام الرئيسية في الجهاز الهضمي عن طريق خلط ودفع محتويات الأمعاء على طول الأمعاء 3. على الرغم من أن أعصاب خارجي إلى الجهاز الهضمي من الجهاز العصبي المركزي يساهم في وظيفة الجهاز الهضمي في الجسم الحيوENS قادر على تنظيم وظيفة الجهاز الهضمي بشكل مستقل. هذه الخاصية الفريدة تتيح التحقيق وظيفية للدوائر العصبية المعوية ومساهمتها في حركية الجهاز الهضمي خارج الحي.
القولون المجمعات السيارات المهاجرة (CMMCs) هي عفوية، والأحداث العصبية التي هي نمط المحرك السائد لوحظت في القولون الماوس معزولة في غياب الكريات البرازية 4-9. وتعرف CMMCs كما الانقباضات الإيقاعية التي تنتشر على طول المسافة الأفقية التي هي على الأقل نصف ويبلغ طول القولون (أي من الأعور إلى المستقيم) 10. وبعد أن يثبت وجود علاقة بين CMMCs وأنماط مقلص التي تدفع الكريات البراز بشكل واضح، وقد تم الإبلاغ عن ولكن بعض الاختلافات الدوائية 11. ومع ذلك، فإن قدرة ENS على العمل بشكل مستقل عن الجهاز العصبي المركزي ووجود أنماط محرك بوساطة العصبية في غيريوفر القولون olated نظام الفحص المثالي لدراسة اضطرابات في الحركة الناتجة عن خلل وظيفي ENS الأساسي. العفوية من أنماط محرك الجهاز الهضمي تسمح تغييرات وظيفية في الاستجابة للمؤثرات الدوائية التي يتم تقييمها.
وتم تطوير استخدام التصوير الفيديو والخرائط الزمانية المكانية الأولى التي تفحص كميا التمعج الأمعاء الصغيرة في خنازير غينيا (12). هنا، يتم وصف أسلوب خارج الحي الذي يتيح دراسة الماوس أنماط حركية القولون باستخدام التصوير الفيديو وتحليل هذه التسجيلات لبناء عالية الدقة (~ 100 ميكرون، 33 ميللي ثانية) خرائط قطر القولون بوصفها وظيفة من موقف على طول القولون ومن الزمن (خرائط الزمانية المكانية). استخدام البرمجيات في المنزل الكشف عن الحافة (Analyse2، حسب الطلب)، تتم معالجة البيانات من كامل طول شرائح القولون التعاقد في الوقت الحقيقي لتوليد خرائط الزمانية المكانية لكل تجربة. في هذه الخطوة، وملفات الفيديو (AVI) هي الخلاصهrized بين وتحويلها إلى خرائط الزمانية المكانية باستخدام Analyse2. خرائط الزمانية المكانية (الشكل 2) تصور انقباض مع مرور الوقت وتمكن من قياس المعلمات متعددة بما في ذلك سرعة انتشار وحجمها وطولها ومدتها. وسجلت قطر الأمعاء أيضا طوال مدة التجربة كمقياس للانقباض العام للقطاع النسيج. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لتحديد الاختلافات في وجهة الشروع في المجمعات مقلص التي يمكن أن تشير إلى تغير الاتصال العصبي المعوي.
وتم الإبلاغ عن بروتوكول التصوير الفيديو مماثلة تهدف إلى تقييم بيليه الدفع في خنازير غينيا 13 ولكن نحن هنا الخطوط العريضة لتطبيق نهج التصوير الفيديو لتقدير حجم الحركة القولون عفوية (أي في غياب الكريات). ونحن نقدم أيضا معلومات مفصلة للمساعدة في تشريح وإعداد أنسجة الجهاز الهضمي للنهج التصوير الفيديو. هذاوينص البروتوكول الباحثين بأداة الوصول إليها وتكرارها بسهولة لتحليل التحكم العصبي المعوي وظيفة الجهاز الهضمي في النماذج الحيوانية من الأمراض بما في ذلك نماذج الماوس الوراثية.
تقنية التصوير الفيديو تتيح تحليل حركية القولون في استجابة لمختلف وكلاء الدوائية. العقاقير يمكن أن تدار عن طريق تجويف الأمعاء أو الحمام هيئة خارجية لإعداد القولون. مناطق مختلفة من الجهاز الهضمي الماوس المعرض أنماط حركية محددة مثل تجزئة وCMMCs الأمعاء الصغيرة في القولون.
وقد استخدمت هذه التقنية لتحديد الاختلافات السلالة في وظيفة الأمعاء الصغيرة؛ وقد لوحظت حساسية التفاضلية ل5-HT 3 و 5-HT 4 الخصوم في الصائم من BALB / ج و C57 / BL6 الفئران نظرا لطبيعة متعددة الأشكال من الجين tph2 أعرب في اثنين من سلالات 6. تأثير تثبيط 5-HT على الحركة لا يزال يخدعموضع خلاف، كما تم الإبلاغ عن بيانات متضاربة حول أهمية الذاتية 5-HT على التمعج القولون وCMMCs 14،15. ويمكن أيضا إجراء تعديلات في مرحلة ما قبل الحركة وبعد الولادة خلال تطوير 7، وآثار الطفرات الجينية على حركية الجهاز الهضمي في النماذج الحيوانية للمرض 10 أن تدرس من خلال الاستفادة من التصوير الفيديو. نحن هنا توضيح استخدام طريقة لدراسة حركية القولون في نموذج الفأر NL3 R451C من مرض التوحد، الذي يعبر عن طفرة مغلطة في الجين Nlgn3 ترميز البروتين التصاق متشابك Neuroligin-3 16. وقد حددت هذه الطفرة الأولى في المرضى الذين شخصت مع اضطراب التوحد الطيف (ASD) 17، والذي يرتبط بقوة مع ضعف الجهاز الهضمي 18-22. ونحن التحقيق ما إذا كانت الطفرة متشابك NL3 R451C تؤثر مخرجات العصبية في ENS باستخدام تقنية التصوير الفيديو. نقدم البيانات التي تميز CMMCs في الأساس وردا على 5H هرمون السيروتونينتي 3/4 مستقبلات تروبيسترون في نموذج الفأر NL3 R451C من مرض التوحد.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام هذه التقنية التصوير الفيديو، وقد تم قياس CMMC تردد كمؤشر على حركية القولون في نوع البرية والفئران NL3 R451C، نموذج الفأر من اضطراب طيف التوحد (17). نتائجنا تشير إلى انخفاض في عدد CMMCs في الفئران NL3 R451C متحولة مقارنة مع الفئران نوع البرية في وجود 5HT 3…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعمت JCB وELH-Y وزارة الخارجية الأمريكية من برنامج أبحاث التوحد CDMRP الدفاع (AR11034). NHMRC (1047674) لELH-Y.The مايو ستيوارت المنح الدراسية-جامعة ملبورن الثقة بتمويل منحة دراسية لمرض التصلب العصبي المتعدد. نشكر علي طاهر، فاطمة Ramalhosa وجراسيا سيغر لمساهمات فنية.
Materials
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
| 4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
| 3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
Riferimenti
- Powell, A. K., O’Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung’s disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung’s disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung’s disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?. Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
