Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l'isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Le cellule dendritiche (DC) sono stati scoperti quasi quarant'anni fa come il "grande stellate (dendron greco) cella" trovata negli organi linfoidi ^1. Molti studi hanno dimostrato che le cellule dendritiche sono le uniche cellule che presentano l'antigene in grado di stimolare efficacemente le cellule T naive ^2. Una delle principali funzioni di queste cellule è l'assorbimento e la presentazione di antigeni e la loro elaborazione efficiente e carico di questi su molecole presentanti l'antigene. In milza del mouse, DC può essere separato in plasmacitoidi e sottoinsiemi convenzionali. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono caratterizzati da una bassa espressione di CD11c e alti livelli di B220 e Gr-1. Essi sono anche positivo per il marcatore mPDCA1 superficie ed interferone di tipo I in risposta a pedaggio like receptor 9 (TLR9) ligandi secernono. I DC convenzionali sono alti per CD11c e MHC di classe II espressione. Essi possono essere suddivisi in tre sottogruppi distinti in base alla superficie espressione di marcatori fenotipici quali CD4, CD8α, DEC205, CD11b e delle cellule dendritiche del recettore inibitorio 2 (DCIR2, riconosciuto dal anticorpo 33D1) proteine ^​​3,4. I CD8α ^Pos DC sono noti anche come CDC1, sono positivi per DEC205, ma negativo per i marcatori mieloidi, come CD11b e 33D1. Il CD8α ^Neg DC, chiamato anche CDC2, sono positivi per 33D1, CD11b e CD4, ma mancano DEC205. Il sottoinsieme negativo doppio (vale a dire, negativo sia per CD4 e CD8α) è relativamente rara, ed è negativo per DEC205 e 33D1. È il sottoinsieme almeno caratterizzati e può essere una forma meno differenziata di CD8α ^Neg DC.

Differenze fenotipiche nei diversi sottoinsiemi DC estendono anche alle loro funzioni in vivo. Il CD8α ^Neg DC sono altamente fagocitosi e si pensa di presentare l'antigene esogeno principalmente attraverso MHC di classe II a cellule T CD4 ^3. Al contrario, i CD8α ^Pos DC sono specializzati per la presentazione dell'antigene proteina solubile in MHC di classe Iin un meccanismo chiamato cross-presentazione. Il risultato di cross-presentazione dipende dallo stato di attivazione di queste cellule dendritiche ^5, e può sia portare alla espansione delle cellule T citotossiche (CTL) o lo sviluppo di cellule T regolatorie ^{6 2,7.} Targeting di antigene di CD8α ^Pos DC utilizzando i risultati di consegna anti-DEC205-mediata da anticorpi in gran parte nella eliminazione delle cellule T ^8, mentre la presentazione di antigeni derivati ​​da cellule apoptotiche infettate induce una forte risposta CTL ^9.

Oltre al riconoscimento di antigeni peptidici, il sistema immunitario dei mammiferi è evoluto per riconoscere lipidico e antigeni glicolipidi. Questi antigeni sono presentati da molecole CD1, che sono MHC di classe proteine ​​di superficie cellulare i-like che esistono in molteplici forme legate in vari mammiferi. Nei topi, un unico tipo di molecola altamente conservata CD1 chiamato CD1d è responsabile per la presentazione di antigeni glicolipidi ^10. Il sindaco popolazione di cellule T che riconoscono CD1d / complessi glicolipidici è chiamato cellule NKT invarianti (cellule iNKT). Queste cellule esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T (TCR) composto da una catena TCRα invariante che è associato con catene TCRβ che hanno limitato la diversità ^11. A differenza delle cellule T convenzionali che hanno bisogno di proliferare e differenziarsi per diventare cellule T effettrici attivate, le cellule iNKT esistono come una popolazione effettrici e iniziano a reagire rapidamente dopo la somministrazione glycolipid ^12. L'identificazione di cellule che presentano l'antigene fisiologicamente rilevanti dei lipidi è un'area attiva di ricerca, e di diversi tipi di cellule distinte, come B cellule, i macrofagi e le cellule dendritiche sono state proposte per svolgere questa funzione. Tuttavia, è stato dimostrato che il sottoinsieme CD8α ^Pos delle DC è la cellula primaria mediazione captazione e presentazione di antigeni lipidici alle cellule del mouse iNKT ¹³ e glycolipid mediata cross-priming di cellule T CD8 ^14.

ove_content "> Per confrontare l'efficienza di presentazione dell'antigene da diverse cellule presentanti l'antigene, un approccio semplice è quello di trasferire diversi tipi di APC purificate pulsate con quantità equivalenti di antigene in host naive. esperimenti di trasferimento cellulare di questo tipo sono spesso eseguite per studi immunologici. Tuttavia, l'esecuzione di studi trasferimento con ex vivo antigene trattata DC è impegnativo, poiché queste cellule esistono popolazioni come rare in organi linfoidi in cui costituiscono meno del 2% delle cellule totali ^15. è pertanto necessario migliorare lo sviluppo di queste cellule in animali donatori per aumentare l'efficienza di protocolli di isolamento.

E 'noto che il linfoide comune e progenitori mieloidi comuni, che sono necessari per la generazione di PDC CD8 ^Pos e sottoinsiemi CD8 ^Neg DC, fms legati espresso recettore tirosin-chinasi 3 (Flt-3). Al momento in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) amministrazione, emigratione di Flt-3 che esprimono cellule progenitrici del midollo osseo è aumentato, con conseguente aumento della semina organi linfoidi periferici e l'espansione della loro progenie matura DC ^16. L'espressione di Flt-3 è perso durante impegno per la B, i percorsi di differenziazione delle cellule T o NK. Pertanto, solo alterazioni minime sono osservati in queste cellule con la somministrazione Flt-3L. Espansione simile nelle popolazioni DC è osservata in topi portatori di tumori generati da impianto di una linea di cellule di melanoma B16-secernenti murino Flt-3L, che fornisce un metodo semplice ed economico per fornire livelli sistemici sostenuti di Flt-3L ^17,18. Usando questo approccio, abbiamo sviluppato un protocollo basato su l'impianto di cellule B16-melanoma secernenti Flt-3L per stimolare l'espansione di tutte le normali sottoinsiemi DC nella milza del mouse, quindi aumentando notevolmente le rese di queste cellule che possono essere isolate per esperimenti successivi . Abbiamo costantemente troviamo che entro 10 – 14 giorni dopo im sottocutaneopiantagione del tumore secernente Flt-3, i topi sviluppano splenomegalia con marcata arricchimento delle DC per costituire 40 – 60% delle cellule totali milza. Da queste milza, diversi sottoinsiemi DC possono essere isolati con elevata purezza utilizzando standard di kit di purificazione delle cellule disponibili in commercio che utilizzano marcatori fenotipici specifici sottoinsieme.