Une méthode de rendement efficace et haute pour l'isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

Les cellules dendritiques (DC) ont été découverts il y a près de quarante ans que la "grande étoilées (grec dendron) cellule" trouvé dans les organes lymphoïdes ^1. De nombreuses études ont montré que les DC sont les seules cellules présentatrices de l' antigène qui peut stimuler efficacement les lymphocytes T naïfs ^2. Une fonction majeure de ces cellules est l'absorption et la présentation des antigènes et de leur traitement efficace et le chargement de ces molécules sur présentatrices d'antigène. Dans la rate de la souris, les CD peuvent être séparés en plasmacytoïdes et des sous-ensembles classiques. Les CD plasmacytoïdes sont caractérisés par une faible expression de CD11c et des niveaux élevés de B220 et Gr-1. Ils sont également positifs pour le marqueur mPDCA1 de surface et sécrètent interféron de type I en réponse à péage comme récepteur 9 (TLR9) ligands. Les CD classiques sont élevés pour CD11c et classe l'expression du CMH II. Ils peuvent être divisés en trois sous-ensembles distincts basés sur l'expression de surface des marqueurs phénotypiques tels que CD4, CD8a, DEC205, CD11b et cellules dendritiques récepteur inhibiteur 2 (DCIR2, reconnu par l'anticorps 33D1) protéines ^3,4. Les CD8a ^Pos DC sont également connus comme CDC1, sont positifs pour DEC205, mais négatif pour les marqueurs myéloïdes tels que CD11b et 33D1. Le CD8a ^Neg DC, aussi appelé cdc2, sont positifs pour 33D1, CD11b et CD4 mais manquent DEC205. Le sous – ensemble double négation (ie, négatif à la fois CD4 et CD8a) est relativement rare, et est négative pour DEC205 et 33D1. Il est le sous – ensemble moins caractérisée et peut – être une forme moins différenciée de CD8a ^Neg DC.

Les différences phénotypiques dans les différents sous – ensembles DC étendent aussi leurs fonctions in vivo. Le CD8a ^Neg DC sont très phagocytaire et sont pensés pour présenter l' antigène exogène principalement par le CMH de classe II à des cellules T CD4 ^3. En revanche, les CD8a ^Pos DCs sont spécialisés pour la présentation d' un antigène protéique soluble dans le CMH de classe Idans un mécanisme appelé présentation croisée. Le résultat de la présentation croisée dépend de l'état d'activation de ces PED ^5, et peut conduire soit à l' expansion des cellules T cytotoxiques (CTL) ou le développement de cellules T régulatrices ^{6 2,7.} Le ciblage de l' antigène à CD8a ^Pos DC en utilisant les résultats de la livraison anti-DEC205-anticorps médiée en grande partie dans la suppression des cellules T ^8, alors que la présentation des antigènes dérivés de cellules apoptotiques infectées induit une réponse CTL forte ^9.

En plus de la reconnaissance des antigènes peptidiques, le système immunitaire des mammifères a évolué pour reconnaître les antigènes de lipides et glycolipides. Ces antigènes sont présentés par des molécules CD1, qui sont du CMH de classe de protéines de surface cellulaire I-like qui existent dans de multiples formes liées à divers mammifères. Chez la souris, un seul type de molécule CD1 hautement conservée appelée CD1 est responsable de la présentation des antigènes glycolipidiques ^10. Le principal une population de cellules T qui reconnaissent des complexes CD1d / glycolipides est appelé cellules NKT invariantes (cellules iNKT). Ces cellules expriment un récepteur de cellules T invariantes demi-(TCR) composé d'une chaîne TCRa invariante qui est associée à des chaînes qui ont TCRβ diversité ¹¹ limitées. Contrairement aux cellules T conventionnelles qui doivent proliférer et se différencier en cellules T effectrices activées, les cellules iNKT existent sous la forme d' une population effectrice et commencer à intervenir rapidement après l' administration de ¹² glycolipides. L'identification des cellules présentatrices d'antigène lipidique physiologiquement pertinente est un domaine actif de recherche, ainsi que plusieurs types de cellules distinctes telles que des cellules B, les macrophages et les DC ont été proposées pour effectuer cette fonction. Cependant, il a été démontré que le sous – ensemble ^Pos CD8a de DC est la cellule primaire médiation absorption et la présentation des antigènes aux cellules lipidiques iNKT de souris ¹³ et des glycolipides à médiation par contre-amorçage des cellules T CD8 ^14.

ove_content "> Pour comparer l'efficacité de la présentation de l'antigène par différentes cellules présentant l'antigène, une approche directe consiste à transférer différents types de TTB purifiées puisées avec des quantités équivalentes de l'antigène dans des hôtes naïfs. expériences de transfert de cellules de ce type sont souvent effectuées pour des études immunologiques. Cependant, la réalisation d' études de transfert avec des DC antigène ex vivo traité est difficile, étant donné que ces cellules existent populations comme rares dans les organes lymphoïdes où ils représentent moins de 2% des cellules totales ^15. Il est donc nécessaire de renforcer le développement de ces cellules chez les animaux donneurs d'augmenter l'efficacité des protocoles d'isolement.

Il est connu que le lymphoïde commun et progéniteurs myéloïdes communs, qui sont nécessaires pour la production de pDC, CD8 ^Pos et des sous – ensembles CD8 ^Neg DC, express liés fms-récepteur tyrosine kinase 3 (Flt-3). Une fois in vivo Flt-3 ligand (Flt-3L) l' administration, emigration de Flt-3 exprimant des cellules progénitrices de la moelle osseuse est augmentée, ce qui entraîne une augmentation de l'ensemencement des organes lymphoïdes périphériques et l'expansion de leur descendance ¹⁶ dendritiques matures. L'expression de Flt-3 est perdue lors de l'engagement du B, T ou NK voies de différenciation cellulaire. Par conséquent, seules des modifications minimes sont observées dans ces cellules lors de l'administration Flt-3L. Expansion similaire dans les populations DC est observée chez les souris portant des tumeurs générées par l' implantation d'une lignée de cellules B16-mélanome sécrétant murin Flt-3L, qui fournit une méthode simple et économique pour fournir des niveaux systémiques soutenus de Flt-3L ^17,18. En utilisant cette approche, nous avons mis au point un protocole basé sur l'implantation de cellules B16-mélanome sécrétant Flt-3L pour stimuler l'expansion de tous les sous-ensembles DC normaux dans la rate de la souris, ce qui augmente considérablement les rendements de ces cellules qui peuvent être isolées pour des expériences ultérieures . Nous constatons régulièrement que dans les 10 – 14 jours après im sous-cutanéela plantation de la tumeur sécrétant Flt-3, les souris développent une splénomégalie avec un enrichissement notable de DCs pour constituer 40-60% des cellules de rate totales. A partir de ces rates, différents sous-ensembles DC peuvent être isolés avec une grande pureté en utilisant le standard disponibles dans le commerce des kits de purification de cellules qui emploient des marqueurs phénotypiques spécifiques sous-ensemble.