Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu
Summary
Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Abstract
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Introduction
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
mikroslayd difüzyon deneyi ve boya-salınım testi tespit ve daha önce tanımlanmamış, protein antimikrobiyal karakterize etmek için avantaj sağlamaktadır. Bu hızlı ve hassas yöntemler büyük araştırma bilgi yatırım önce yararlı enzimler tanımlanması için bir organizma kaynağı kütüphanelerin yüksek verimli tarama sağlar. üst düzey hedef enzim tanımlanır gibi, tespit deneylerinin varyasyonları enzimi hızla tespit etmek veya enzim biyokimyasal özelliklerini belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, bir çok basamaklı protein saflaştırma şemasının, mikroslayd difüzyon deneyi hızlı konusu enzimi ihtiva eden fraksiyonlar algılayabilir. Buna ek olarak, enzim reaksiyon Optima boya salım deneyinde Reaksiyon tampon ve kuluçkalama sıcaklıklarının değiştirilmesiyle belirlenebilir.
mikroslayd difüzyon testinde tespiti için gerekli enzim olan kütle aralığı enzim karakterize eden bir fonksiyonudurampüller. Deneyin tarama sınırlamalar genellikle, boya-salım analizi daha enzimin yüksek miktarlarda kullanılmasını gerektirir. Bu çalışmada, boya salım analizi (Şekil 4) mikroslayd difüzyon deneyi (Şekil 1) tespit limitleri karşılaştırması mikroslayd difüzyon deneyi boya salım deneyinde daha az hassas bir teknik olduğunu gösterilen. Enzim konsantrasyonu bir endişe olmadığı zaman, mikroslayd tahlil düşük işgücü ve ekipman talepleri hedef yüzeylerde karşı protein Antimikrobiyal maddelerin üretimi için kütüphanelerin hızlı başlangıç taranması için izin verir. daha fazla çaba ve ekipman gerektiren birlikte, boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için aynı ya da farklı enzimler, boya-salım deneyleri ile karşılaştırma yapmak kantitatif sonuçlar hasıl daha hassas ve tekrarlanabilir. iki yöntem kolayca çok özel enstrümantasyon gerek olmadan en mikrobiyolojik laboratuvarlarda yapılır. temsilcilerimiz içindemikroslayd difüzyon testinde tespit az miktarda 1 ug (veriler gösterilmemiştir) ise tive deneyler, kontrol enzimi, α-kimotripsin, boya salım deneyi kullanılarak 100 ng (Şekil 5) gibi düşük bir miktarda tespit edilmiştir.
Antimikrobiyal enzimler için kalitatif tespitinde olarak kullanıma sunan, difüzyon deneyi varyasyonları bir dizi 11,13 bildirilmiştir. Bu deneyleri incelerken, mikroslayd difüzyon deneyi ilk ekran olarak nispeten yüksek hassasiyet ve tepki gözetilmesi kolaylığı için geliştirilmiştir. Proteini ile de yayılır şekilde agaroz bindirmeleri Staphylococcus aureus suşları tarafından nükleazlara üretimini tespit etmek için kullanılan edildiği Lachica ve ark., 11 çalışması, değişikliğe uğratılmış mikroslayd difüzyon deneyi radyal immünodifüzyon yöntemi 14 ile benzer biçimde çalıştırılır agaroz alt tabaka ihtiva etmektedir. radyal immunodiffuSistem agaroz içinde yayılma antijen ve antikor arasındaki bir kompleks oluşumu denge ulaştığında yon yöntemi immünopresipitasyon bölgenin genişleme durur. Bunun aksine, mikroslayd difüzyon deneyinin alt-tabaka, ilk başta açıklanan çevreleyen liziz bir sürekli genişleyen bölgede yayılan bir protein antimikrobik ile sindirilmiştir. enzim aktivitesi, kaybeder ya da alt-tabaka bitene kadar bölge artan çapı devam eder. liziz bölgesinin üretim oranı enzim, saflık ve böylece belirli bir etkinlik olarak hızlandı veya enzim konsantrasyonu de artar ilave edildi.
Kantitatif ısı ile öldürülmüş B'ye karşı protein antimikrobik enzimatik aktivitesini değerlendirmek için subtilis boya salınım testi seçildi. Remazol parlak mavi R boyası (RBB) kullanılarak kolorimetrik analizler yüzeyler protein antimikrobiyal eylemlerinde çok yönlü ve hassas değerlendirilmesine imkan -etiketlity. hali hazırda 595 nm'de bir spektrofotometre ile ölçülebilir çözünebilen, mavi ürünlerin açıklamasında RBB-etiketli Substrat enzimatik hidrolizi. diğer protein antimikrobik enzimler karakterize etmek için geliştirilmiş RBB boya salım deneyinde çeşitli varyasyonları, diğer substratlar ile uygulama için, bu deneyde esnekliğini göstermektedir. Örneğin, bir bakteriyolitik lysostaphin etkisini belirlemede, Zhou ve ark., RBB-boyalı stafılokok hücreleri ve alt tabakalar 12 olarak stafilokokal peptidoglikan kullanılarak bir boya salım deneyi bildirilmiştir. Bu RBB boya salım deneyinde uygulanmasının bir modifikasyonunda, RBB-etiketli Micrococcus luteus alt-tabaka, örneğin bakteriyel enfeksiyon ve habis karsinom varlığında gibi hastalıkların teşhis etmek için bir hızlı ve hassas bir araç olarak kullanımı ve ekran için önerilmiştir hangi olabilir kan serumunda 15 insan lizozim ekspresyon düzeyleri ile korele edilebilir. Buna ek olarak, RBB-etiketli bakteriyel hücre substratları olduğu birLSO lizozim 16 tespit edilmesi için bir zimogram yöntemi kullanılmıştır.
Bu enzim üretimi için hızlı bir arşiv taraması için izin boya salım deneyinde alçaltılmış saptama limiti, kolaylık ve tekrarlanabilirlik göstermektedir. Deneyin değişiklikler sıcaklık, pH, tuzluluk etkilerinin yanı sıra antimikrobiyal proteinlerin 6 aktivitesi diğer proteolitik enzimlerin etkilerini de dahil olmak üzere alt niceliksel biyokimyasal karakterizasyonu deneyleri, izin verir. Buna ek olarak, sayısal boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için çok sayıda enzimlerin aktivitelerini karşılaştırmak için kullanılabilir. RBB boya salma tahlili karakterizasyonu ve protein antimikrobik maddelerin tespitine ek olarak, polisakaritler karşı aktivitesi olan enzimler için yardımcı bildirmiştir. Pettersson ve Eriksson selüloz, ksilan, manan ve pusula amorf, RBB-boyanmış polisakarid boncuklar kullanılarak endoglycanase aktivitesi tespit etmek için bir deney rapor17'sinde. Bu bulgular, bir genleşme Bacillus thuringiensis Bt-107 tarafından üretilen kitinaz enzimlerin saptanması için hassas bir yöntem RBB 18 ile etiketlenmiş kolloidal kitin kullanılarak geliştirilmiştir. Bu ve diğer çalışmalardan, RBB-boyanmış substratlar Ticari kaynaklar keratin, amilopektin, amiloz, glikojen, Laminarin, D-ksilan, azo-arpa glukan ve nişasta karşı da dahil olmak üzere glikolitik aktivitesi, saptanmasında kullanım için ortaya çıkmıştır.
Bu çalışmada, kolorimetrik bir sonuç elde etmek için gereken RBB-etiketli substrat ve enzim hacmini azaltır, bir mikroplaka formatında boya salım deneyinde yararını göstermektedir. Şekil 4 ve Şekil 5 'de gösterildiği üzere, mikro boya salma tahlili enzimatik etkinlik algılaması için mikroslayd difüzyon deneyi daha düşük bir belirleme sınırına içerir. yorumlama hızlı kullanımı ile ilgili olarak, emeğin korunması ve kolaylığı ile, mikrofonroslide difüzyon deneyi, antimikrobiyal aktivitenin varlığı hem de alt baş protein izolasyon ve arıtma aşamalarında antimikrobiyal proteinin varlığının gösterilmesi için başlangıç, yüksek verimli taramalara bir fayda sağlar. Bu iki testin kombinasyonu yeni protein antimikrobik ilk tarama ve son karakterizasyonu birbirini tamamlayan
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
Materials
| 48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
| 96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
| agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
| α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
| Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| cork borer | Humboldt | H-9661 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
| microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
| nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
| peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
| phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
| Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
| Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
| Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution | |||
| agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
| nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
|||
| 250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
|||
| 200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |
Riferimenti
- Anand, T. P., et al. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India. Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).
- Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Riley, M. A., Gordon, D. M. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).
- Tenover, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med. 119, S3-S10 (2006).
- Farris, M. H., Steinberg, A. D. Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete. Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).
- Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 61, 2811 (1995).
- Srivastava, K. K., Siddique, I. H. Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes. Infect Immun. 7, 700-703 (1973).
- Heilmann, H. D. On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa. Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).
- Schumann, P., Rainey, F., Oren, A. . Taxonomy of Prokaryotes. 38, (2011).
- Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity. Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).
- Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).
- Osserman, E. F., Lawlor, D. P. Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. J Exp Med. 124, 921-952 (1966).
- Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).
- Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate. Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).
- Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions. Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).
- Pettersson, B., Eriksson, K. E. A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides. Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).
- Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases. J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).
