超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化

インビトロ条件下での海馬神経細胞を成長させることは、観察し、 生体内で他の方法では不可能な、これらのニューロンの実験的操作を可能にします。この実験的なアプローチは、広く成長、極性、神経突起の仕様、輸送およびタンパク質の細胞内局在、シナプス形成および機能的成熟¹の神経メカニズムを明らかにするために使用されます。後期胚期から採取するとき、これらのインビトロ培養海馬ニューロンは、錐体の形態²の比較的純粋な（> 90％）グルタミン酸細胞です。ニューロンがインビトロ条件下で2-D表面で増殖させたため、この方法は、単一の焦点面³を介して染色ライブイメージングまたは免疫細胞化学（ICC）のように、容易に観察できます。または、そのような薬物治療やトランスフェクション^3-6のような操作、。高い密度で増殖させた場合、ニューロンがあるため、より高い共同の生存率が高い傾向にあります増殖培地から栄養支持に加えて、またために、神経突起接触依存性機構⁷の分泌された成長因子のncentrations。しかし、低密度海馬ニューロンは、個々のニューロンは、その全体が撮像されたまたはICC分析のために染色することができる形態学的研究のために望ましいです。低密度ニューロンが原因パラクリンサポートの欠如に培養中で維持するのは難しいですので、多くの場合、前の神経細胞培養の²に用意する必要があるグリア（典型的には皮質アストロサイト）フィーダー層からの栄養サポートを必要とします。時共培養グリア細胞フィーダー層を有する、低密度ニューロンをカバーガラス上で増殖させ、かつ低密度ニューロンおよびグリアが互いに対向するように、その後グリア層の上に反転されます。グリア細胞と神経細胞の間に小さな限られた空間は、「サンドイッチ」レイアウト^2,8,9を作成^するため、カバースリップの隅にパラフィンワックスのドットを配置することによって作成されます。低密度ニューロンはワット成長しますニューロンとグリアによって分泌された濃厚な要因と寛容な微小環境を作成し、グリア細胞とカバーガラスの間の限られた空間を、ithin。このアプローチは、したがって、ICC標識やライブイメージング研究を促進する、合理的に離れている低密度、完全に発達神経細胞が得られます。

ニューロン – グリア共培養の見かけ上の欠点は、脇に時間がかかり、面倒であることから、それはニューロン特異的、または細胞自律的、機構の研究を防ぐことです。このシステムははるかに複雑なin vivoでの神経組織よりもですが、分泌され、未完全に定義された要素を介してニューロンの発生にグリアの影響は実験^10を混乱することができます。したがって、ニューロン特異的なメカニズムの研究、血清およびグリア支持層が必要で除去定義培養条件を必要とする実験です。以前の研究では、目を使用して（〜9000細胞/ cm ^2）のニューロンの低濃度を培養することに成功しましたREE次元ヒドロゲルマトリクス^11。比較的純粋な神経細胞集団は、グリアサポートなしで無血清条件下で高密度に培養することができるので、我々は、海馬神経細胞の超低密度で、高密度ニューロンでそれらを共培養することによって、無血清規定された培養培地中で増殖させることができるという仮説を立て従来採用ニューロン – グリア共培養に類似した方法。実際、「サンドイッチ」構成で高密度海馬ニューロン培養物は、最近、特殊な大細胞内分泌ニューロン¹²の小さな数をサポートするために使用されています。

したがって、高密度の神経細胞との共培養は、低密度ニューロンが長期生存を可能にするのに十分である栄養因子のサポートを受けることを可能にします。超低密度ニューロンを培養するこのプロトコルは、このように配合し、検証しました。プロトコルは、高密度を調製することにより、単一の実験内で実施することができる（〜250,000細胞/ ml）をDISsociated海馬ニューロンは、最初に、その後密度〜万ニューロンを得るために希釈を行う/ mLの（〜3,000の神経細胞/カバースリップ、または〜2,000の神経細胞/ cm ^2）で大部分が低密度培養物を報告したよりもはるかに低い^{、2,3,9 、11,13。}この培養条件は緩く「超低密度」培養と呼ばれ、「低密度」相互交換可能で使用されています。高密度ニューロンをポリ-D-リジンコートした24ウェルプレート上にプレーティングされます。低密度ニューロンをポリ-D-リシン被覆した12mmのガラスカバースリップ上に播種され、一方、別の24ウェルプレートの内側に配置されます。ニューロンが下降し、カバーグラスに添付された後に低密度ニューロンを付着させるとカバーガラスを2時間後に高密度ニューロンの上に反転しています。また、代わりに高密度ニューロン層、上記カバーガラスを上昇させるためにパラフィンワックスのドットを使用する、18 Gの注射針は、二つの平行なストライプで24ウェルプレートの底部をエッチングするために使用しました。その結果displプラスチックはガラスカバースリップのための高められたサポートを提供する隣接、出し抜か。このスペースは、一貫して濃縮された栄養因子との微小環境を提供しながら、十分な酸素と培地交換を可能にする150〜200ミクロンで測定されます。この状態で、低密度ニューロンが広範囲に成長し、培養3ヶ月を超えて生き残ることができます。これらのニューロンは、培養3週間後にGFPプラスミドでトランスフェクトされる場合には、樹状突起は、やたらと樹状突起棘がちりばめられています。原理の証明として、データは、この共培養系は、神経細胞が細胞の調査を容易にすることができるautaptic接続を形成し、ポリ-D-リジン「マイクロアイランド '上に播種した海馬神経細胞の超低密度培養物をサポートすることを示すために提示されています-autonomous、ネットワークに依存しないメカニズム。