송곳니 X-연결된 근육 영양 실조에 칵테일 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 건너 뛰기 멀티 엑손

아래에 나열된 모든 프로토콜은 일본의 국립 신경 센터와 정신과 (NCNP)에 의해 규정 된 동물 관리 지침에 따라 있습니다. 모든 실험은 NCNP의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 안티센스 올리고 1. 디자인 , 45-47을 ESE 사이트 (44)를 검출하는 구조 ESE 및 ESEfinder 프로그램을 사용합니다. 대상이되어야한다 엑손에 안티센스있는 디자인 25 염기쌍 (bp의) 시퀀스. 대상 엑손 6 개 모델 (8) (그림 1). PMOS 30 bp의 시퀀스 (표 1) 또는 2'OMePS 25 bp의 – (25)를 사용합니다. 25 염기쌍 서열을 설계 대상 영역 내에있는 서열을 선택한다. 안정적인 시퀀스 (43)를 생성하는 이차 구조, 이종의 회피, 엑손 접합 증강 주제 및 GC 함량을 고려하십시오. 전술 한 강도로 식별 AONs는 ESE 사이트 중 적어도 하나를 대상으로해야tware. 미만 4 연속 'G의, 및 포함되지 않은 자체 상보적인 서열로, 미만 65 % 인 GC 함량이 선택 AONs. 오프 대상 어닐링 사이트 22,48,49를 예측하기 위해 NCBI 폭발 소프트웨어를 사용합니다. 적절한 AON 백본 화학을 선택합니다. 시험 관내 실험 2'O 메틸 올리고 뉴클레오티드 (2'OMePS) 또는 morpholinos를 사용합니다. 생체 실험을 위해, 2'OMePS, morpholinos 또는 vPMOs를 사용합니다. 3,19,48,50 생체 외 실험 2. (엑손 6, 8 CXMD 모델에 건너 뛰기) 개 근육 아세포의 2'OMePS 형질 6 웰 플레이트에서 성장 배지 3 ㎖ 문화 CXMD의 근육 아세포. 씨앗 1-5 × 103 세포 / cm 2 0.5 ㎖ / 근육 아세포에 대한 매체의 cm 2. 성장 배지를 들어, 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 %로 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)를 사용하여페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S) 40. 80 % 합류 – 60까지 37 ° C에서 품어. 이 약 12​​ ~ 24 시간이 걸립니다. (1 비율 트랜 에이전트 : AONs 예, 대 리포 펙틴 10㎕를 5 μg의 AONs 2) 감소 된 혈청 배지 100 μL의 총 양이온 리포좀 트랜 제를 희석. 45 분 – 혼합물을 30 동안 실온에서 방치한다. 감소 된 혈청 배지에서 100 μL의 최종 부피 AONs (2'OMePS 또는 morpholinos)을 희석. 희석 AONs로 희석 된 형질 에이전트를 결합하고 10 RT 부화 – 15 분. 트랜 에이전트 / AON 혼합물을 RT에 앉아있는 동안, 흡입을 통해 세포에서 이전 미디어를 제거하고 미디어 세포를 씻는다. 트랜 에이전트 / AON 혼합물에 0.8 ml의 미디어를 추가 한 다음 갓 씻어 세포에 전체 솔루션을 추가합니다. 37 ° C에서 3 시간 동안 품어. 배양 후, differentiat와 미디어를 교체이온 미디어 (DM); 분화 10 일까지 걸릴 수 있습니다. 주변에 일 3. 차별화 미디어에서 시작 분화가 발생했는지 여부를 확인하는 것은 2 % 말 혈청과 DMEM, 200 U / ㎖ 페니실린, 200 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 μg의 / ㎖ 인슐린이다. 개 근육 아세포의 모르 폴리 노 형질 단계 2.1에 기재된 바와 같이 배양 CXMD 성장 배지 아세포. 차별화 매체 (DM)로 전환하고, 최종 농도 1 μM을 만들기 위해 각 웰에 0.1 mM의 스톡 모르 폴리 노를 추가합니다. 형질 전환 또는 주입하기 전에 10 분 동안 65 ° C에서 열 칵테일 morpholinos는 AON 응집을 방지 할 수 있습니다. 펩타이드 전달 39,51 시약을 첨가하고 3의 최종 농도로 조정 – 6 μM. 16 후 – 배양 48 시간, RNA 추출을위한 세포를 수집합니다. 접시에서 세포를 분리하는 세포에 1 ml의 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 – 페놀 – 클로로포름을 추가합니다. RNA의 extrac를 수행이 단계 이후 기. 대안 적으로, 모든 셀을 덮도록 트립신을 추가하고, 37 ℃에서 2 분간 배양한다. 참고 : 면역 화학을 수행 배양을위한 챔버 슬라이드 안경을 사용하려는 경우. 분화 후, 세포는 파라 포름 알데히드 (PFA) (10 분 동안 4 %)를 사용하여 고정 될 수있다. RNA 추출 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 세포가 myotubes로 분화되면, 중간 제거하고 1 ml의 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 – 페놀 – 클로로포름을 추가; 실온에서 10 분 동안 품어. 1.5 ml의 튜브에 전송합니다. 200 μl의 클로로포름과 결합하고 세 개의 층이 보일 때까지 2 분 동안 RT에서 배양한다. 위로부터 아래로 세 층이다 :는 RNA 층, DNA 층 및 단백질 층. 4 ℃에서 15 분 동안 12,000 × g에서 원심 분리기. 500 & #와 튜브의 상위 계층 상층 액과 장소를 제거(181), L의 이소프로판올 (여기 중지하는 경우, -80 ° C에서 뜨는을 저장). 원심 분리기 4 ° C에서 10 분 동안 12,000 × g에서 뜨는; 원심 분리 한 후, 생성 된 RNA 펠렛을 유지하고 상층 액을 버린다. 4 ° C에서 5 분 동안 8,000 XG에 에탄올과 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. 15 분 동안 튜브를 반전시켜 잔류 에탄올을 증발 한 후 추가 15 -의 RNase가없는 물을 30 μL. 260 nm에서 US / VIS 분광을 사용하여 총 RNA 농도를 정량화. 1.5 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머, 1 μL의의 dNTP, 5 ㎕의 한 단계 PCR 키트의 완충액, 0.7 ㎕의 RNA 분해 효소 억제제, 1 ㎕의 효소 혼합물로부터 액형, 1.5 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머는 RT-PCR 반응에 필요한 시약을 겸용 PCR 키트와 RNA의 200 NG 단계. 이러한 혼합 한 후, 25 μL의 최종 볼륨에 물을 추가합니다. 항온 자전거 타는 사람에 혼합물을 배치합니다. 50 ° C, 15 분에서 30 분주기를 실행0; 95 ° C에서 사이클 후 1 분 동안 94 ° C의 35주기, 1 분 동안 60 ℃, 1 분 동안 72 ° C. 마지막으로, 72 ° C에서 10 분주기를 실행. 4 ° C 또는 -20 ° C에서 냉장고에 보관 PCR 제품 보완 DNA (cDNA를) 시퀀싱 아가로 오스 겔 전기 영동을 사용하여 9 스킵 밴드 – 엑손 6을 확인합니다. 부하 20 분 후, 120 V 5 1.5 % 아가로 스겔의 웰에 각 샘플 μL, 5 분 동안 겔을 통해 135 V를 실행. 다음에, 30 분 동안 RT에서 DNA 겔 염색에서 겔을 배양한다. 이미지 소프트웨어를 이용하여 밴드를 시각화. 겔 추출 키트를 사용하여 관심있는 밴드를 절제. DNA 단편을 절제 200 μL의 NTI / 100 mg의 겔을 사용하는 겔 슬라이스를 용해. 이 50 ° C의 물을 욕조에 5 분 ~ 10 동안 앉아 보자. 그리고 막 튜브를 대 실리카에 전송합니다. 30 초 동안 11,000 XG에 원심 분리기. 가전​​ 전에 700 ㎕를 NT3 버퍼로 두 번 세척30 초 동안 11,000 XG에 다시 ntrifuging. 1 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리하여 실리카 막을 건조. 30 μL의 NE 버퍼가 1 분 동안 실온에서 앉을 수 – 15를 추가합니다. 그런 다음, 1 분 동안 11,000 XG에 원심 분리기. 실리카 겔을 분리하여 튜브의 내용을 유지한다. 제조사의 프로토콜에 따른 시퀀스를 결정하기 위해 시퀀싱 키트를 사용한다. 3. 근육 주사 또는 Open 근육 생검 생존 수술시 무균 조건의 유지 관리를 위해 수술 사이트 (뒷다리)를 주변 지역에 가위를 사용하여 머리를 제거합니다. 살균제로 Iodophors, 소 디움 하이포 클로 또는 클로로 헥를 사용합니다. 배치하고 전체 동물과 운영 식탁을 확보하여 수술 부위에 대한 멸균 커튼을 사용합니다. 수술실 52, 53 클린 스크럽, 얼굴 마스크, 헤드 커버, 멸균 장갑, 특수 신발을 착용하십시오. </ OL> 20 mg을 가진 CXMD 개를 주사 / 티 오펜 탈 나트륨 kg 그들을 마취합니다. 건조에서 눈을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 전신 마취 (그림 3)를 유지하기 위해 3 %의 이소 플루 란 흡입 – 2를 사용합니다. 근육의 반사 신경을 확인하고 심장을 모니터링하고 속도를 호흡하는 것은 마취의 깊이를 평가하기 위해. RR : 다음과 같이 전신 마취하에 정상적인 호흡 속도 (RR), 심박수 (HR) 및 SPO 2는 10-20 호흡 / 분; SPO 2 : 95~100%, HR : 80 – 분 (BPM) 당 120 비트. 메스를 사용하여, 또한 전 경골근 (TA)로 알려진 뇌 경골 (CT)을 통해 피부를 잘라 내고 (젊은 성인 개) 약 5cm 길이 방향으로 하나의 컷을합니다. 사출 사이트를 표시하려면, 수술 바늘과 수술 스레드를 사용하여 깊은 근막 스티치와 2cm 간격으로 두 개의 스티치 마커를 확인합니다. 27 G 바늘로 근육에 AONs의 원하는 농도를 주입한다. 원하는 concentration은 처리 조건 사이에 다릅니다. CT의 경우, 칵테일 PMOS 1.2 mg의 총 (0.4 mg을 각각 PMO) 또는 칵테일 vPMOs 0.4 밀리그램 (0.13 mg의 각 vPMO)에 대해, 1 ml의 볼륨 각각이 주사를 제공합니다. 신근 수근 척골 쪽 손목 펴짐 근 (ECU) 앞다리 근육의 경우, 칵테일 PMOS 1.2 mg의 총 (0.4 mg을 각각 PMO) 또는 칵테일 vPMOs 0.4 밀리그램 (0.13 mg의 각 vPMO) 0.5 ml를 각각 두 개의 볼륨을 주입. 1 분 동안 바늘에 둡니다. 칵테일 각 AON의 동일한 양을 사용합니다. 수술 용 메스를 사용하여 CT 근육에서 근육 조직의 조각을 길이 약 2cm를 제거하여 오픈 근육 조직 검사를 수행합니다. 근육 샘플 준비를 위해 6.5 단계로 이동합니다. 바늘을 사용하여 전신 마취에서 각성하기 전에 / kg 프레 노르 핀 염산염 0.02 mg을 근육 주사를 관리 할 수​​ 있습니다. 다시 근육을 통해 근육의 근막과 피부를 놓고 근육의 근막과 피부 폐쇄, respectiv의 3-0 흡수 실 및 3-0 나일론 실을 사용하여 이러한 스티치엘리. 입이 열려 채, 개그 반사 반환 여부를 확인; 개그 반사가 반환 될 때, 개를 extubate. 감염을 방지하기 위해 정맥 또는 근육 주사를 통해 15 밀리그램 / 최대 3 일 동안 kg 세파 졸린 또는 세팔 렉신 (항생제) 30를 관리 할 수​​ 있습니다. 7 일 이내에 봉합사를 제거합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복하고 완전히 회복이 될 때까지 개는 다른 동물과 상호 작용하는 것을 허용하지 않습니다 때까지 개를 방치하지 마십시오. 가능한 한 오랫동안 장소에서 기관 내 튜브를 유지하고 동물이 씹거나 삼키기 시작하면 제거합니다. 그들이 안정적이고 정상 범위 내에 있는지 확인하기 위해 동물의 심장 박동, 호흡, 그리고 수화를 모니터링합니다. 수술 후 케어, 조용하고 어두운 휴식 장소, 적절한 상처와 붕대 유지 보수, 부드러운 포함 삼일 (예, 부 프레 노르 핀 0.01 ㎎ / ㎏) 및 간호 지원을 위해 진통제를 제공휴식 표면, 경구 또는 비경 유체와 수분 보충, 매우 맛 식품이나 취급의 사용을 통해 일반 공급에 반환. 어떤 동물이 추가 약물이 필요한 경우, 통증 증상에 따라 부토 르파 놀 타르트 레이트 0.3 ㎎ / ㎏의 근육 내 주사를 제공합니다. 참고 : 고통 개, 물린 상처, 또는 고통스러운 지역을 보호하고 취급하면, 비정상적으로 우려 또는 공격적이 될 수도있다. 또한, 하나 사지에 통증은 일반적으로 파행하거나 사용하려는 시도에 영향을받는 사지의 유지 업을 초래한다. 8 시간 – 이러한 상황에서, 부 프레 노르 핀 염산염 0.02 ㎎ / ㎏ 매일 6의 근육 내 주사를 준다. 4. 전신 주사 참고 :이 절차는 주 원하는 번호를 매주 또는 격주로 반복 될 수있다. 누워 개를 받고 수동으로 부드럽게 개를 억제하고 t에 걸쳐 장소에서 개를 잡아 어깨와 엉덩이 위에 팔을 드레이프그 절차. AONs을 주입; 120-240 ㎎ / ㎏ 칵테일 PMOS – (A 두부 또는 복재 정맥라고도 함) 다리 정맥에 정맥 유치 바늘을 사용하여 (40 80 mg의 각 AON). 주입 AON 량은 실험 조건에 의존한다. 칵테일 각 AON의 동일한 양을 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라, 20 분 동안 / 분 2.5 ML의 속도로 50 ml의 총을 주입하는 주입 펌프 또는 주사기 드라이버를 사용하십시오. 격주로 매주 또는 반복 주사 디스트로핀 표현이 반복 주사로 축적되므로 (매 2 주) 이상 5 배. 독성을 조사하기 위해 매주 혈액 검사를 수행합니다. 완전한 혈액 카운트 (CBC) 0.5 mL 및 다른 사람을 위해 2.5 ml의 – – 전면 또는 사지의 피하 정맥 중 하나에서 바늘을 사용하여, 혈액의 3 ㎖를 수집합니다. CBC, 감마 글루 타밀 트랜스퍼 라제 (GGT), 아스 파르 테이트 아미노 트랜스퍼 라 아제 (AST), 혈액 요소 질소 (BUN)를 포함 알라닌 aminotransferase (ALT), 크레아틴 키나제 (CK), 및 크레아티닌 평가 혈액 검사 키트에서 제조업체의 지침에 따라, 수집 된 혈액을 테스트. 40,54 개 5. 임상 등급 비디오 카메라 및 녹화 개 행동과 걸음 걸이를 설정합니다. 개를 채점 할 때이 기준 역할을 같이 개 전체 만남을 기록; 이 각각의 비디오는 강아지의 능력과 의지에 따라 다른 길이 될 것입니다 의미합니다. 기본 기록 매개 변수를 사용합니다. 그것이 나중에 검토 할 수 있도록 촬영은 등급의 기록을 작성합니다. 학년 보행 및 운동 장애. 보행 운동 장애를 들어, 다음의 등급을 사용 1 등급 = 없음, 뒷다리와 함께 앉아 학년 2 = 확장, 3 학년 = 뒷다리와 토끼 홉, 4 학년 = 셔플 거리, 그리고 5 학년 = 걸을 수 없습니다. GR 1 등급 = 없음 : 이동 방해를 들어, 다음 학년을 사용ADE 2 = 정상보다 뒷다리, 4 학년에 점프 할 수 없습니다 3 학년을 = 누워 주위에 이동 어려움, 그리고 5 학년 = 일어나서 주위를 이동할 수 없습니다 증가. 15m를 실행하려면이 개를 걸리는 시간. , 15m를 측정 출발 선에서 개를 배치하고 15m 마크까지 실행하도록 권장합니다. 다음 등급 척도를 사용하여 사지의 근육 위축을 확인합니다 : 1 등급 = 없음, 2 등급 = 용의자 경도, 3 학년은 = 경도를 느끼게하거나 성적 3과 5 사이의 얇은, 4 학년 = 나타날 수 있습니다 학년 5 = 매우 얇은 하드. 등급은 다음과 스케일을 사용하여 침을 흘리고 없습니다 : 1 등급 = 없음, 등급 2 = 먹거나 음주, 그리고 5 학년 = 연속 잠꼬대 때, 3 학년 = 일부 먹는 잠꼬대과 음주, 4 학년 = 잠꼬대의 문자열을 앉아 때 가끔 침을 드리블. 혀 (대설) 다음과 같은 스케일을 사용 학년 비대 : 1 등급 = 없음, 2 등급 = 약간 확대, 3 학년 = 확장 outsi드 치열, 4 학년 = 확대 약간 두껍게, 그리고 5 학년 = 확대 및 농축. 학년 이하 규모의 사용 삼키는 강아지의 능력 : 1 학년 = 더 어려움, 2 등급 =가, 씹는에 접시에서, 4 학년 = 어려움을 음식을 복용 음식, 3 학년 = 어려움을 복용 삼키는 시간과 노력이 필요하거나 음주를 식사를하고, 5 학년 = 수 없습니다. (55) (15 미터 주행 시험 제외) 각 카테고리에서 점수를 추가하여 총 점수를 계산합니다. 주 : 바이어스를 도입하지 않도록 연구를 멀게한다. (6) 자기 공명 영상 (MRI) 뒷다리 – 사지의 T2 강조 영상을 얻기 위해 3 테슬라 (3T) MRI와 18cm 직경 / 18cm 길이 인간의 말단 코일을 사용합니다. 티 오펜 탈 20 ㎎ / ㎏으로 CXMD 개를 주입하여 동물을 마취. 건조에서 눈을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 전신 마취를 유지하기 위해 2~3% 이소 플루 란 흡입을 사용합니다. 근육의 반사 신경을 확인하고 심장을 모니터링하고 속도를 호흡하는 것은 마취의 깊이를 평가하기 위해. 95~100%, HR : 80 – 분 당 120 비트 (BPM : – RR : 20 호흡 / 분, SPO 2~10 다음과 같이 정상적인 호흡 속도 (RR), 심박동 수 (HR) 및 전신 마취 SPO 2는 ). T2 강조 영상 획득하기 위해 다음 설정을 사용 TR / TE는 = 4000 / 85 밀리 초, 슬라이스 두께 = 6mm, 슬라이스 격차 = 0mm,보기 = 18cm의 필드 X 18cm를, 매트릭스 크기 = 256 X 256, 및 빠른 스핀 에코 (그림 4) 동안 인수 = 3의 수입니다. 7. 근육 샘플링 및 준비 (부검) 참고 : 근육은 지난 AON 주입 후 1 또는 2 주 샘플링해야합니다. 20 mg을 가진 개를 주사 / 티 오펜 탈 나트륨 kg 그들을 마취합니다. 눈의 건조를 방지하기 위해 마취 동안 눈에 수의사 연고를 사용합니다. anes을 유지하기 위해 이소 플루 란 흡입 3 % – 2를 사용하여thesia. 근육의 반사 신경을 확인하고 심장을 모니터링하고 속도를 호흡하는 것은 마취의 깊이를 평가하기 위해. RR : 다음과 같이 전신 마취하에 정상적인 호흡 속도 (RR), 심박수 (HR) 및 SPO 2는 10-20 호흡 / 분; SPO 2 : 95~100%, HR : 80-120 BPM. (부검 전용) 전신 마취 하에서 방혈하여 개를 안락사. 분자 분석 혈액 유래 인자 (예를 들어, 심장 근육)에 의한 영향을 피하기 위해 깊은 전신 마취 하에서 방혈을 사용합니다. 해부 다음과 같은 근육 (그림 5) : CT, 신근 심지 longus (EDL), 비복근, 가자미근, 대퇴 이두근, 직근 대퇴골, 상완 이두근, 삼두근 상완, 삼각근, ECU, 신근 요측 수근 (ECR), 굴곡 수근의 척골 쪽 손목 펴짐 근 (FCU ), 요측 수근 굴근 (FCR), 박근, 늑간, 복부 근육, 다이아 프램, 측면 dorsi, 식도, 흉쇄, 심장. 독성 검사, 신장 및 리를 수집버전 샘플. 사용 에반스와 해부 기술 (56)에 대한 기준으로 알렉산더 드 Lahunta (2009). 잘라 CT, EDL, 비복근, 가자미근, 대퇴 이두근, 직근 대퇴골, 상완 이두근, 삼두근 상완, 삼각근, ECU, ECR, FCU, FCR, 박근, 늑간, 복부 근육, 측면 dorsi, 식도, 흉쇄, 심장, 신장, 작은 부분 약 1로 간 – 길이가 1.5 cm. 최대 조리개 롤 다음 1로 잘라 – 1.5 cm 섹션 56. 코르크 디스크에 1cm 두께 -이 약 0.5가되도록 트라가 칸트 고무를 놓습니다. 트라가 칸트 검과 반대측 동물의 식별 및 근육 이름 라벨 디스크. 트라가 칸트 검의 코르크에 수직 자신의 종축과 근육을 놓습니다. 액체 질소에 앉아 이소 펜탄의 용기에 마개를 놓습니다. 1 분 또는 완전히 고정 될 때까지 핀셋으로 끊임없이 주위를 이동합니다. 코르크에 저장 근육-80 ° C에서 유리 병입니다. 운반시, 드라이 아이스에 튜브를 넣어. 동물 식별 / 근육 이름과 날짜가 표시 유리 슬라이드를 준비합니다. 그라 이오 스탯은 -25 ° C로 냉각에서 스탠드에 코르크를 탑재합니다. 원하는 수준의 단면 두께를 설정한다. 면역 조직 화학 8 μm의 헤 마톡 실린 및 에오신 (HE) 염색 12 μm의를 사용합니다. 웨스턴 블롯 샘플 15 μm의를 사용합니다. 적절한 근육 샘플링 평면 근육을 얻을 근육 1/4 정도 트림. 계획이 면역 조직 화학에 대한 샘플을 사용하거나 HE는 염색하면 한 번에 근육의 한 부분을 절단, 같은 유리 슬라이드에 매 6 번째 섹션을 배치합니다. -80 ° C에서 튜브 및 상점에서 40 절 – 서양 말에 대한 샘플을 사용하는 경우, 30했습니다. 슬라이드의 준비를 한 후, 슬라이드는 실온에서 1.5 시간 동안 건조 할 수 있습니다. 스토어는 -80 ° C에서 슬라이드. 8. 면역 조직 화학 저장소에서 준비된 슬라이드를 제거하고에 배치수분을 분리 챔버 슬라이드를 유지하고 수분을 유지한다. 아래는 그냥 물 (물 약 1mm)으로 덮여되도록 습기 챔버를 입력합니다. 공기 건조 0.5 시간 동안. 소수성 장벽 펜을 사용하여 슬라이드에 근육 샘플을 둘러싸는 사각형을 그립니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)에 15 %의 염소 혈청을 추가하고 시약을 차단에서 실온에서 2 시간 동안 품어. (150 희석 1) 개 디스트로핀 염색에 대한 안티 디스트로핀로드 도메인 (DYS-1) 마우스 단일 클론 차 항체, 또는 C- 말단 단일 클론 항체 (DYS-2)를 추가합니다. PBS의 1.25 ml의 차단 에이전트를 사용하여 희석. O / N 냉장고에 4 °에 C를 품어. 5 분 동안 PBS로 세척을 3 회 반복. (2,500 일) (DYS-1) 또는 IgG2 (DYS-2) 마우스의 IgG1에 대해 이차 항체 알렉사 594 염소 항체를 추가합니다. PBS에서 차단 시약은 페놀에 톡실 레이트 옥틸 0.1 %를 함유하는 희석. 실온에서 0.5 시간 동안 품어. 5 분, 삼t PBS로 세척IME를. 슬라이드가 건조하도록 허용합니다. 2 방울 (4) (3 NG / ㎖) ', 6 diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 장착 솔루션 – 1을 추가합니다. 핀셋을 사용하여 거품을 방지 섹션의 맨 위에 유리 슬립을 배치합니다. 보기 dystrophin- (DYS-1 / DYS-2) 20X 배율에서 594 nm에서 형광 현미경으로 긍정적 인 섬유. 9. 웨스턴 블로 팅 극저온 절편 얼음에 샘플 버퍼 150 μL에에서 수집 된 근육 섹션을 추가합니다. 손을 균질기를 사용하여 간단히 단백질 시료 균질화. 5 분 – 3 95 ℃에서 가열 블럭 배양기에서 1.5 ㎖의 튜브에 열 샘플. 원심 분리기와 15 분 동안 16,500 × g에서하면 뜨는를 수집합니다. -70 ℃에서 상등액 스토어 분취. 100 배 희석 증류수를 사용합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정한다. 3 분 동안 샘플 및 열에 배 램 믈리 SDS 로딩 버퍼를 추가 &# 160; 95 ° C에서. 3에로드 샘플 – 150 V.에서 3 시간 동안 그것을 실행하기 전에 8 % 트리스 – 아세테이트 젤은 몇 희석 된 야생형 (WT) 샘플을 포함합니다 (예를 들어, 1 %, 10 %, 50 %) 정량. 디스트로핀의 1 % 미만 WT 수준은이 방법을 발견해야한다. 20 분 동안 음극 버퍼에 젤을 놓습니다. )이 각각.이이 시간 동안 여과지 9 곡을 음극 버퍼 [+], 애노드 완충액 (에 (전송 버퍼 3 종이를 넣어 – – [] [], 및 농축 애노드 버퍼 감도 (도 6)을 증가하는 반건식 전송 방법을 설명한다. 20 초 동안 메탄올에서 PVDF 멤브레인을 만끽하고 양극 버퍼에 배치합니다. 반 건조 전송을 위해 멤브레인과 겔을 설정하고 RT 또는 추운 방에서 400mA에서 1.5 시간을 실행할 수 있습니다. PBS와 멤브레인을 씻으십시오. 2 시간 동안 트윈 20 (PBST) 및 5 % 분유와 PBS의 혼합물 막을 인큐베이션. PBST로 DYS-1 (일차 항체)를 희석하고 1~5% 우유 분말 혼합물 : 100 희석. 막에 추가하고 적어도 1 시간 동안 배양 할 수 있습니다. 15 분마다 100 ㎖의 PBST로 3 회 씻는다. 1에서 65 μL / HRP 복합 이차 항체 (DYS1에 대한 항 – 마우스의 IgG2a)의 차선을 추가 : 5,000 희석 어두운 영역에서 실온에서 1 시간 동안. 그런 다음, 20 분 동안 200 ML의 PBST로 3 회 씻어. 지시에 따라 검출 키트에서 솔루션을 섞는다. 1 분 동안 품어. 밴드를 감지하고 ImageJ에 소프트웨어 48,57,58으로 분석 할 수있는 필름을 개발한다.