صيانة<em> ذبابة الفاكهة</em> عدد السكان قفص
Summary
This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Abstract
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
Introduction
جعلت القدرة على الجمع بين النهج الوراثية والبيوكيميائية ذبابة الفاكهة كائن مناسبة خاصة بالنسبة للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية الدراسات 1-3. وغالبا ما تتطلب هذه الدراسات كميات كبيرة من المواد البيولوجية، ليس فقط من الذباب الكبار، ولكن أيضا من اليرقات 4، 5 الشرانق والأجنة 6-8. للحصول على كميات كبيرة من المواد، الباحثين الذباب مثقف باستخدام الحاويات الكبيرة المعروفة باسم يطير "أقفاص السكان". تتكون هذه الأقفاص من اسطوانة مصنوعة من البلاستيك بواسطة شبكة من الجانبين مغطاة للسماح لإدخال المواد الغذائية داخل القفص دون الذباب الهرب. ويمكن لهذه الأقفاص تكون محلية الصنع 9-11 أو شراؤها من شركة (انظر الجدول المواد / معدات معينة).
والميزة الرئيسية لاستخدام هذا النظام لزراعة أعداد كبيرة من الذباب هي أن دورة من ذبابة الفاكهة 12 يمكن التحكم في الطريقة التي تتطور كل الذباب في إعادةتزامن latively الطريقة. ويتحقق هذا التزامن عن طريق بذر أجنة جديدة، وتغذية اليرقات / الذباب والتضحية الذباب الكبار في أوقات محددة. باستخدام السكان ذبابة متزامنة مفيدة بشكل خاص للدراسات التنموية 13.
بداية قفص السكان الجدد من عدد قليل من الذباب هي عملية تستغرق وقتا طويلا تتطلب العديد من الدورات من التضخيم 9-11. حتى باستخدام حاويات أكبر مثل زجاجات ثقافة ذبابة أو minicages، يمكن أن العملية برمتها تستمر لأشهر. لتجنب هذه تستغرق وقتا طويلا الخطوة، العديد من المختبرات ذبابة الفاكهة تحافظ بانتظام مثل هذه الأقفاص. ومن الأكثر ملاءمة لبدء قفص جديد ابتداء من جمع الأجنة من قفص السكان بالفعل. بشكل عام، فإن معظم معامل تحتفظ أقفاص السكان wildtype، مثل ولاية أوريغون R أو كانتون S. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة للحفاظ على أقفاص السكان الطاير.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن تبدأ مع 1.5 غرام من مادة واحدة الحصول على العائد من الأجنة التي تم جمعها ما بين 7 و 13 غ لكل دورة. للحصول على هذا المبلغ من المواد التي لا بد من المحافظة على ظروف زراعة المناسبة لجميع مراحل دورة الطيران.
أهم المعايير هي درجة الحرارة والرطوبة، والتي ينبغي أن تكون 24 درجة مئوية و 35٪ على التوالي. إذا كانت هذه المعلمتين لا يمكن ثابتة في البيئة الطبيعية للمختبر، ان احد الاحتمالات لوضع القفص يطير إلى حاضنة أو الغرفة البيئية. البروتوكولات الأخرى يوصى به 70٪ الرطوبة وأيضا 24 ساعة دورة ضوء الظلام مستمرة لزيادة الغلة من البيض المنتج 9،10. ولكن الحفاظ على الرطوبة حوالي 35٪ يتجنب التلوث الجرثومي، وبما أن الهدف من هذا البروتوكول هو فقط الحفاظ على قفص السكان، يتم الاحتفاظ الذباب في ضوء البيئة الطبيعية للمختبر.
نقطة أخرى مهمة هي أن تبقي ديsturbances إلى الكبار الذباب عند أدنى مستوى ممكن. قد يكون من المستحسن أن تبقي القفص في مكان منفصل عن غرفة ذبابة لتجنب التلوث من غيرها من الذباب.
لا ينصح زراعة من أعداد كبيرة من المعدلة وراثيا والذباب متحولة، لأنه من الصعب جدا للحفاظ على نقاء، وأنها يمكن أن تظهر وضوحا سلوك التزاوج الشاذ في أقفاص كبيرة من السكان 14.
مشكلة واحدة محتملة في حين زرع ذبابة الفاكهة بكميات كبيرة هو وجود كائنات حية أخرى مثل العث و / أو العفن، والتي سوف تنافس على الغذاء، وبالتالي تقليل العائد من البيض المنتج. لتجنب هذا، من المهم جدا للحفاظ على جميع المعدات نظيفة، وغسل القفص والشباك ويطير صناديق بالماء والصابون، والتخلص من المواد المتاح (شمعات الرغوة) بعد كل دورة. للحد من العفن تنمو، تضاف البروبيونيك وحمض الفوسفوريك في الخميرة الرطب عند إعداد الطعام ذبابة في الخطوة1.2 وTegosept عند إعداد العسل الأسود صينية في الخطوة 3.1. ومن المفيد في بعض الأحيان إلى المواد مكان مثل مربع من البلاستيك أو غرابيل في -20 C عندما يكون الوقت قصير والمواد لا يمكن تنظيفها على الفور.
تحدث دورة جمع كلها في 14-15 يوما تبدأ عندما يتم المصنف الأجنة في مربع الطاير وتنتهي مع اليوم جمع الماضي. خلال هذه الفترة من الزمن، فمن المستحسن لتنظيم جدول زمني من أجل أن نتذكر جميع الخطوات اللازمة لصيانة قفص الطيران السكان (الشكل 2)، مفصلة في قسم البروتوكول. من اليوم أن البيض المصنفة، حتى تظهر الذباب الكبار، فمن الضروري فقط لتفقد مربع من البلاستيك، وعندما يحدث التشرنق، لوضعها داخل القفص. بعد ذلك، والذباب يجب أن يكون الطعام كل 2-3 أيام حتى يتم المصنف الأجنة لدورة جديدة. في البروتوكول كله، وأطول يوم هو خلال جمع وزرع الأجنة لبدء دورة جديدة. اق علق في البروتوكول، وأفضل عائد البيض هو 3 – 5 أيام بعد eclosion الكبار، وأخيرا يتراجع في وقت لاحق 2 أيام. هذا يعطينا بعض المرونة لاختيار اليوم الذي سيتم تنفيذ حصاد البيض.
إذا لأي سبب من الأسباب العائد من الأجنة التي تم جمعها أقل من المبلغ المطلوب بدءا (1.5 غرام)، واحد دائما يمكن إضافة العسل الأسود صينية جديدة وجمع المزيد من البيض في اليوم التالي. لمجموعات ثابتة، فمن المستحسن للحفاظ 2 أقفاص في موازاة ذلك، وإذا كانت هناك حاجة كميات أكبر من الأجنة، فمن غير الممكن أيضا استخدام أقفاص أكبر. في حالة القيام مجموعات زمنية قصيرة، طريقة واحدة لزيادة الغلة للاستفادة من انفجار وضع البيض في الصباح.
هناك العديد من المزايا من جمع كميات كبيرة من مراحل النمو المختلفة. على سبيل المثال، تم استخدام الأجنة التي تم جمعها من أقفاص السكان بنجاح كبير في فحوصات مناعي 6-8، collectio الشاملوقد أثبتت ن من أنسجة اليرقات من اليرقات فصلها لتكون مصدرا جيدا للغاية بالنسبة 3C التجارب 4 والاستعدادات RNA 15، ولقد تم استخدام رؤوس من الذباب الكبار للتجارب رقاقة 16. وبالإضافة إلى ذلك، غالبا ما يحتاج الكبار إلى جعل مقتطفات الطيران لزراعة الأنسجة 17.
واحدة من أكثر التطبيقات الواعدة من القفص هو توفير المواد لفحوصات عالية الإنتاجية التي تسمح للتحليل وفحص الجينات، النصوص والبروتينات والأيض ردا على التعرض لمسببات الأمراض، والجزيئات البيولوجية، والمواد الكيميائية والإشعاع المؤين. في هذه المقايسات على نطاق واسع مطلوب أعداد كبيرة من الأفراد، والقفص السكان ذبابة الموصوفة هنا يمكن أن تكون مفيدة جدا من أجل الحصول على كميات كبيرة من المواد خلال مراحل مختلفة من دورة حياة ذبابة الفاكهة لتحليل وفحص 18.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Materials
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
Riferimenti
- Lim, S. J., Boyle, P. J., Chinen, M., Dale, R. K., Lei, E. P. Genome-wide localization of exosome components to active promoters and chromatin insulators in Drosophila. Nucleic Acids Res. 41, 2963-2980 (2013).
- Ong, C. T., Van Bortle, K., Ramos, E., Corces, V. G. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 26, 148-159 (2013).
- Gonzalez, I., Mateos-Langerak, J., Thomas, A., Cheutin, T., Cavalli, G. Identification of regulators of the three-dimensional polycomb organization by a microscopy-based genome-wide RNAi screen. Mol Cell. 8, 485-499 (2014).
- Magbanua, J. P., Runneburger, E., Russell, S., White, R. A variably occupied CTCF binding site in the ultrabithorax gene in the Drosophila bithorax complex. Mol Cell Biol. 35, 318-330 (2014).
- Maksimenko, O. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Res. 25, 89-99 (2015).
- Lei, E. P., Corces, V. G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nat Genet. 38, 936-941 (2006).
- Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., Lei, E. P. Tissue-specific regulation of chromatin insulator function. PLoS Genet. 8, e1003069 (2012).
- King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., Lei, E. P. The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner. J Cell Sci. 1, 2956-2966 (2014).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of drosophila for protein biochemistry. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Roberts, D. B., Standen, G. N., Roberts, D. B. The elements of Drosophila biology and genetics. Drosophila: A practical approach. , 1-53 (1998).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: The laboratory setup. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Dahlberg, O., Shilkova, O., Tang, M., Holmqvist, P. H., Fb Mannervik, M. P-TEb, The super elongation complex and mediator regulate a subset of non-paused genes during early Drosophila embryo development. PLOS Genet. 13, e1004971 (2015).
- Zhang, S. D., Odenwald, W. F. Misexpression of the white (w) gene triggers male-male courtship in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 6, 5525-5529 (1995).
- Chak, L. L., Mohammed, J., Lai, E. C., Tucker-Kellogg, G., Okamura, K. A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA. RNA. 21, 375-384 (2015).
- Moshkovich, N., Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLOS Genet. 12, e1000880 (2010).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, 411-436 (2011).
