JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Bir Manyetik microbead Oklüzyon Modeli Farelerde Glokom Oküler Hipertansiyon Bağımlı tetikleyebilecek

Published: March 23, 2016
doi:
10.3791/53731
, , ,
1Department of Neuroscience,CRCHUM and University of Montreal

Summary

Burada, glokom görüldüğü gibi, retinal ganglion hücre kaybına neden murin göz oküler hipertansiyon uyarılması için bir protokol mevcut. Manyetik mikroboncuklarının ön kamaraya enjekte ve sulu mizah çıkışı engellemek için bir mıknatıs kullanarak iridokorneal açı çekti.

Abstract

glokom kemirgen modellerinde kullanılması bu çok faktörlü nörodejeneratif hastalıkların patofizyolojisinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için gerekli olmuştur. çok sayıda transgenik fare hatları ile birlikte, oküler hipertansiyon uyanlabilir murin modellerinde artan bir ilgi vardır. Burada, bir yontulmuş konik olarak değiştirilmiş bir mikroiğne ile gözün ön odasına manyetik mikro boncuklar enjeksiyonu göre glokom bir tıkayıcı bir model sunmaktadır. Manyetik mikroboncuklarının ön kamaraya sulu mizah drenaj engellemek için bir el mıknatıs kullanarak iridokorneal açısına çekti. İnsan glokom hastalarında gözlendiği gibi sonradan, retina ganglion hücrelerinin kaybına yol açar göz içi basıncı, sürekli bir yükselme sulu dinamikleri sonuçlarında Bu bozulma. Bu yazıda sunulan microbead oklüzyon modeli aynı zamanda son derece diğer uyarılabilir glokomun modelleri ve basit karşılaştırıldığındaetkili ve yeniden üretilebilir. Önemlisi, burada sunulan değişiklikler genellikle tıkanıklığı modellerinde ortaya çıkan yaygın sorunları en aza indirmek. İlk olarak, kesik cam Mikroiğnenin kullanımı mikro-boncuk geri akışını engeller ve en az bir hasar, böylece yaralanmaya bağlı etkilerinin azaltılması, enjeksiyon sırasında korneaya oluşmasını temin eder. İkinci olarak, manyetik mikro boncuklar kullanımı etkili diğer yapılarla temas kaçınarak ön kamara yüzen boncuklar (örneğin., Iris, lens) sayısının azaltılması, iridokorneal açısı en boncuklar çekmek yeteneği sağlamaktadır. etkin bir şekilde, manyetik mikro-boncuklar yönlendirmek ve mikroiğne geri çekildiğinde göz mikro-küçük geri akış yok olduğundan emin olmak için küçük bir fare göz tutarken Son olarak, bir el mıknatıs kullanılması esneklik sağlar. Özetle, burada sunulan microbead tıkanıklığı fare modeli Glau başlangıcı ve ilerlemesi sırasında meydana gelen nörodejeneratif değişiklikleri incelemek için güçlü bir araştırmacı bir araçtırkoma.

Introduction

Glokom 2020 1 dünya çapında tahminen 80 milyon insanı etkileyecek ilerici ve geri dönüşümsüz kör bir durumdur. Glokomlu hastalarda, görme kaybı, retina ganglion hücrelerinin (RGCs), görsel bilgi iletimi çıktı nöronları seçici ölüm nedeni beyne retina. Glokom en yaygın yüksek göziçi basıncı (GİB) olduğu birçok risk faktörüne sahip bir yaşa bağlı nörodejeneratif bir hastalıktır. glokom ve güncel tedaviler göz tansiyonu yönetmeye odaklanmak Gerçekten de, GİB'in tek değiştirilebilir risk faktörüdür. Ancak, çoklu genetik hücresel ve çevresel faktörler bu hastalığın başlamasını ve ilerlemesini etkiler. Bu nedenle, nihai olarak, nöronal ölüme katkıda bulunan çeşitli mekanizmaların anlaşılması glokom için etkili bir tedavi geliştirmek için gereklidir.

glokom Hayvan modelleri hastalık patofizyolojisini incelemek ve tespit ve test için gerekli olanumut verici terapötik. genetik olarak kodlanmış floresan izleyiciler taşıyan koşullu nakavt suşları ve fareler de dahil olmak üzere transgenik fare hatları artan kullanılabilirliği uyarılabilir fare glokom modelleri için ihtiyaç sürüklemiştir. Glokomun Birkaç kemirgen modelleri (2,3 gözden) yıl boyunca geliştirilmiştir. Bu modellerin birçoğunda, glokom IOP yükselme ile sonuçlanır, sulu humor dinamiklerini bozarak indüklenir. Mikro-ya da diğer maddeler, sulu bir boşalmayı bloke gözün ön odasına enjekte edildiği oklüzyon modelleri, kısmen IOP 4-14 geliştirmek için göreceli kolaylığı için son yıllarda popülerlik kazanmıştır.

İlk primatlarda 12'de gerçekleştirilen glokom microbead tıkanması modeli, tavşan 8 ve sıçanlar 4,9,11, farelerde 5,6,10 kullanım için adapte edilmiştir. Bu çalışmalarda, polistiren mikro-boncuk intrakameral enjeksiyon tek başına veyaviskoelastik malzeme ile birlikte, daha sonra RGC ölüm 6,10 giden IOP yükselmesi ile sonuçlanmıştır. Ancak, iğne iridokorneal açıdan mikro-boncuk göz ve çıkartılmasından çekilir geri akış işlemi sırasında ortaya çıkan ortak bir sorun vardır. Bu dezavantajları minimuma indirmek için, mıknatısların göz 4,9 arasında iridokorneal açısına manyetik mikro-boncuklar çekmek için kullanılmaktadır.

Burada açıklanan protokol manyetik mikro-boncuklar ve fare göz için uyarlanmış bir el mıknatıs (Şekil 1) kullanan önceki çalışmalar 9,10 göre modifiye edilmiş bir işlemdir. Birkaç önemli değişiklikler farelerde etkili ve tekrarlanabilir GİB artışına sağlamak için protokol girmiştir. İlk olarak, mikro-enjeksiyon bir yontulmuş konik bir özenle hazırlanmış cam microneedle kullanılarak yapılır. Mikroiğnenin Elde edilen düzgün yüzeyler yanı sıra keskin ucu az hasar sağlaro korneayı deler olarak verdirdiler. Microneedle ucu böylece bu iris ve lens olarak zarar yakındaki yapıların riskini azaltır, ön kamara girdiğinde bu cam Mikroiğnenin kullanımı da artan kontrolü ile sonuçlanır. Buna ek olarak, küçük enjeksiyon lezyon kornea kendini onarım kolaylaştırır ve istenmeyen yaralanma ile ilgili etkilerini azaltır.

İkinci olarak, manyetik mikro-enjeksiyon ve bir el mıknatıs kullanımı hassas kontrol küçük fare gözünde iridokorneal açıya boncuk çekmek için izin verir. Bu microbead boyutu hazırlanan microneedle açılış tıkayabilir ve önemlisi, bir kez enjekte etmedi çünkü çapı 4,5 mikron kullanılan manyetik mikroboncuklarının, bu microbeads etkin bir sulu mizah drenaj engelledi. Bu yaklaşım, sadece enjekte mikro-geri akışını azaltır, aynı zamanda mikro-maksimum sayısı etkin aköz hümör boşalmayı bloke hedef alan birikir sağlar. furthermore bu strateji aynı zamanda, arka kamara iris ve mercek ve önlenmesi kanalı gibi diğer yapılar ile temas kaçınarak ön kamara yüzen tanelerin sayısını azaltır. Toplu olarak, bu değişiklikler, mikroboncuk enjeksiyon cerrahi göreli kolaylıkla ve farelerde oküler hipertansiyon yüksek, yeniden üretilebilir, etkili ve sürekli bir indüksiyon ile sonuçlanan bir zamanında gerçekleştirilir olduğundan emin olun.

Protocol

Aşağıdaki yordam Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Görme ve Oftalmoloji (ARVO) Araştırma Derneği'nden Oftalmik Hayvanların Kullanımı ve Görsel Araştırma Tablosu Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Anterior İntrakameral Enjeksiyon için Mikroiğnenin 1. Hazırlık Bir çektirmesi ile bir borosilikat cam kapiller bir microneedle oluşturmak Mikroskop altında, dikkatle Mikroiğnenin ucunda bir açılış oluşturmak için keskin bir bıçak kullanın. Elde edilen açıklık, sırasıyla, yaklaşık olarak 190 um ve 70 um arasında bir majör ve minör ekseni çapa sahip bir elips şeklinde olması gerekir. görüntü analiz yazılımı kullanılarak ölçümü takiben mikroskop altında yerleştirilen bir cetvel ile ilk satın görüntüleri hazırlanmış microneedle açılış alanını ölçün. Mikropipet pah sisteminde, 20 Degre de microneedle yerleştirinağzı açma plakasına e açısı göreli microneedle açılış plaka dokunmadan böylece. Konik kenarları kadar yaklaşık 10 dk düz ve pürüzsüz için. sürecine yardımcı olmak için damıtılmış su bir kaç damla ekleyin. ucu keskin kadar açıklığı çevreleyen iki kenarları konik microneedle döndürün. bir aerosol silgi kullanarak microneedle ucu açıklığı Temiz tüm enkaz ve su. Dikkatle mikroskop altında bitmiş microneedle inceleyin. kırıklı atın microneedles ameliyat sırasında microneedle kırılma riskini en aza indirmek için. daha sonra steril dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) ile, etanol ile, birinci durulama ile mikroiğne sterilize edin. Manyetik microbead Çözüm 2. Hazırlık Not: Bu çalışmada kullanılan manyetik mikro-epoksi gruplar ile kaplanır. Bu tür boncuk topaklanma ve istenmeyen moleküler etkileşimler gibi herhangi bir olumsuz etkileri önlemek için, bu epoksi grupları gerekirİlk enjeksiyon cerrahi ile devam etmeden önce mikro-çıkarılmalıdır. Manyetik boncuklardan Epoksi grupların uzaklaştırılması 10x Tris tamponu 0.02 M sodyum hidroksit (NaOH, MW 39,997 g / mol) ihtiva eden bir çözelti (MW 121.14 g / mol) hazırlayın. Yavaşça manyetik mikroboncuk çözeltisi stoku vorteks (4.5 mikron çapında, 4 x 10 8 boncuk / mi) boncuk eşit çözeltisi içinde süspansiyon haline kadar devam eder. Hızlı bir şekilde 10 x Tris tamponu, 0.02 M NaOH, 50 ml manyetik boncuk çözeltisi 1 mL pipet. boncuklardan epoksi gruplarını kaldırmak için oda sıcaklığında 24 saat boyunca döndürün. tüpün dibine bir mıknatıs güvence boncuk toplayın. tüm boncuklar mıknatıs çekici olmasını sağlamak için yatay tüp yönlendirmek. Oda sıcaklığında ilave bir 4 saat çevirin. Bir mikropipet ile dikkatlice boncuk pelet bozmadan süpernatant kaldırmak. Yavaşça 10x T 50 ml pelet vorteksboncuklar iyi askıya alınır kadar ris tampon. Tekrarlayın 2.1.6 için 2.1.4 adımları. Konsantrasyon ve steril Dengeli Tuz Çözeltisi içinde manyetik mikro boncuklar tabanda Not: 2.4 x 10 6 boncuklar ön odasına enjekte edilir, böylece 1.6 x 10 6 boncuk / ul nihai konsantrasyona ulaşmak için, steril dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) 'de manyetik boncuk çözeltisi stoku konsantre için gerekli olan küçük fare göz için uygun olan 1.5 ul, son hacmi. yavaşça, 2 dakika girdap oluşturarak ultra saf laboratuvar sınıfı 5 ml su boncuklar yıkayın. Bir mıknatıs ile tüpün dibine onları çekerek boncuk toplayın. Bir mikropipet ile dikkatlice boncuk pelet bozmadan su çıkarmak. Tekrarlayın 2.2.1 2.2.3 için üç kez daha yineleyin. bir laminar akış başlığı içinde, pipettin tarafından BSS 500 ul boncuk yıkayınyukarı ve aşağı g. Laminer akış başlığı içinde steril koşullar altında, bu bölümde kalan adımları. Bir mıknatıs ile tüpün dibine onları çekerek boncuk toplayın. Bir mikropipet ile dikkatlice boncuk pelet bozmadan BSS çıkarın. Tekrarlayın 2.2.5 2.2.7 için üç kez daha yineleyin. yukarı ve aşağı BSS 250 ul boncuk pipet ile tekrar süspansiyon. boncuk çözüm de homojenize olduğundan emin olun. Daha sonra, hızlı bir şekilde, steril 0.5 ml'lik tüplere süspansiyon 25 ul tablet. Hazır boncuk çözeltisi nihai konsantrasyon 1.6 x 10 6 boncuk / ml. 4 ° C'de saklayın. Oküler Hipertansiyon 3. İndüksiyon Not: Bölüm 3 iki kişilik bir işlemdir. Belirli bir işlem, belirli bir kişi tarafından yapılması gereken bir durumda, uygun bir kişi olarak tanımlanır. Kişi 2 r ise genel olarak, Kişi 1 mikroskop altında fare kollarımikroenjektör pompa işlenmesi için esponsible. cerrahi işlem toplam süresi en az 10 dakika olmalıdır (3.17 ile 3.9 adımlar). yetişkin C57BL / 6 farelerde prosedürleri uygulayın. Yiyecek ve su ad libitum erişimi olan standart bir ortamda Ev fareleri. Bu yazıda, yaş 3 ve 4.5 ay arasında dişi C57BL / 6 fareler kullanın. Bununla birlikte, bu protokol transgenik ve nakavt fareler de dahil olmak üzere erkek ve farklı yaşlardaki farelerde, hem de diğer fare suşları, adapte edilebilir. kalibre toparlanma tonometresi kullanılarak önceden anestezi ve microbead enjeksiyon uyanık farelerde bazal göz içi basıncı ölçün. kornea üzerinde proparacaine hidroklorür bir damla uygulayın. Yavaşça kulak arasındaki deriyi tutarak fareyi dizginlemek. hayvan rahat ve gözleri erişilebilir, böylece benchtop fare yerleştirin. kornea yüzeyine dik tonometresi tutun ve bir elde etmek için göze başına on ardışık okumanın en az üç set çekmekGİB'in ortalama. Uyanık farelerde GİB ölçüm GİB üzerine anesteziye bağlı etkileri atlamak için tercih edilir. Seçenek olarak ise, IOP adım 3.4 sonrası Narkoz farelerde ölçülebilir. 20 mg / ml ketamin, 2 mg / ml ksilazin ve 0.4 mg / ml asepromazin oluşan bir stok fare kokteyli anestezi karışım hazırlayın. Kokteyl karışımı (vücut ağırlığının 1 ul / g) periton içine fare anestezi neden. Hayvan bir inhalasyon maskesi bağlı değil olarak fare kafasını işlerken bu esneklik sağlar, çünkü bir enjektabl anestezi kokteyl kullanımı (örneğin, izofluran) gaz anestezikler tercih edilir. Buna ek olarak, bir enjektabl anestezi ile gerekli uzun iyileşme dönemi microbeads ön kamaraya geri yerinden oynatmamaya olmadan iridokorneal açıda yerleşmek sağlar. buprenorfin subkutan vücut ağırlığının her kilogramı için 0.05 mg yönetme. Bir tropikamid ey ile göz tedavisie öğrenci dilatasyon ikna etmek için bırakın. Nedeniyle fare ön kamaraya küçük boyutu, öğrenci kolayca enjeksiyon sırasında Mikroiğnenin konumlandırma ve ilerleme görselleştirmek için dilate edilmelidir. İşlem sırasında korneanın kurumasını önlemek için kontralateral göz (un-işletilen) topikal merhem sürün. mikroenjektör pompa enjeksiyon düzeneğine temiz bir microneedle takın. Çapraz hayvan bulaşmayı önlemek için her operasyondan sonra microneedle değiştirin. 1. Kişi: işletim platformu için anesteziye fare aktarın. Mikroskop altında, öğrenci tam dilate olduğu ve hiçbir göz hareketi olduğunu bu yüzden göz kaslar gevşer emin olun. göz hareketlerinin yokluğu enjeksiyonu sırasında kararlılığı sağlar. Yavaşça emici bezlerden kullanarak gözünden tropikamid göz damla silin. Kişi 2: yukarı ve aşağı pipetleme manyetik microbead çözüm karıştırın. mikroenjektör pompası kullanarak hemen MICR yükoneedle homojenize manyetik microbead solüsyonu (2.4 x 10 6 boncuk) 1.5 ul (bölüm 1 hazırlanan). Bu hava kabarcıkları Mikroiğnenin ucundaki yok olduğundan emin olun. Microneedle yüklendikten sonra, yürütmek manyetik microbead çözüm homojen bir süspansiyon içinde kalacak şekilde mümkün olduğunca hızlı 3.12 3.13 için yineleyin. limbusa öne göreceli yerleştirilen bir 45 ° 'lik açıyla yüklenen microneedle, yerleştirin. 1. Kişi: plastik forseps kullanarak göz destekler. Mikroiğnenin ve plastik forseps arasındaki açı yaklaşık 90 ° olduğundan emin olun. Kişi 2: Mikroiğnenin ucu ön odasına girer ve böylece yüklenen microneedle ile hafifçe kornea delinme. Yüklenen Microneedle ponksiyon sırasında limbus bir 45 ° açıda kalmasını sağlamak. lens veya iris ile herhangi bir temastan kaçının. Microneedle arka odasına girmediğinden emin olun. Kişi 1: göz desteklemeye devamplastik forseps kullanarak. Kişi 1: Fare hareketli kafa olmaksızın, ön odacık içine manyetik boncuklar çekmek ve kornea iç yüzeyi ile tanelerin temas en aza indirmek için, karşı mikroiğne ucu, göz yanında mıknatıs yerleştirin. Kişi 2: mikroenjektör pompası kullanılarak, ön kamaraya manyetik boncuk çözeltisi 1.5 ul enjekte edilir. mikroboncuk çözelti, 15 ila 30 saniye arasında bir süre boyunca enjekte edilir. 1. Kişi: enjeksiyon tüm süresi boyunca microneedle ucu mıknatıs karşısında tutmaya devam edin. Kişi 2: boncuk dolu hacmi enjekte edildikten sonra, yavaş yavaş gözden microneedle çıkarın. Kişi 1: mikro-geri akışını önlemek için, ek bir 30 ila 60 saniye boyunca aşağıdaki göz mıknatıs tutarak ön odanın karşı manyetik boncuklar çekmek için devam etmektedir. Kişi 1: mıknatıs kullanarak iridokorneal açıya boncuklar çekmek. Boncuklar bir eşit olarak dağıtılmış bir halka oluşturur emin olunön kamara çevresi. Bu adım sırasında, bu temas üzerine korneanın iç yüzeyine yapışma eğilimi olarak korneada boncukların çeken önlemek. enfeksiyon riskini en aza indirmek için bir antibiyotik göz damlası ile çalışan göz davranın. Fare (~ 3-4 saat) tamamen uyanık kadar ısı pad üzerinde kurtarmak için izin verin. ameliyat göz yukarı bakacak şekilde fare yerleştirin. Bu konumlandırma çekimi korneanın iç yüzeyine enjekte tanelerin birikmesi önleyecektir. Buna ek olarak, bu konum ameliyat göz bir yatak ve / veya kafes içinde mevcut olabilecek diğer malzemeler ile temas olmayacak şekilde enfeksiyon potansiyelini azaltır. gerektiği gibi bir hayvan sıkıntı belirtisi gösteren durumunda, buprenorfin ek dozları yönetmek. Fareler GİB ölçümü almadan önce en az 2 gün prosedürü kurtarmak için izin verin. 3.2 açıklandığı gibi göz içi basıncı ölçün. Monitor GİB'in en az haftada bir kez ya da gerektiği gibi daha sık, ve günün aynı saatinde sirkadiyen ilgili dalgalanmaları en aza indirmek için. GİB, bir iç kontrol olarak işletilen fare kontralateral göz kullanın. Alternatif olarak, bozulmamış, olmayan çalışan veya sahte çalışan fareler olarak naif kontrollerden ölçümleri kullanın. 4. Değerlendirme Retina Ganglion Hücre Soma ve Akson Survival Hemen buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit (PFA), ardından 0.1 M fosfat tampon çözeltisi (PBS) intrakardiyak enjeksiyonu ile göz hipertansiyonu tabi fareler serpmek. 4.1 anlatıldığı gibi sağlam olmayan çalışan fareler serpmek ve yaralanmamış kontroller olarak kullanın. Ameliyat farelerden kontralateral göz kullanımı yaralanmasını takiben kontralateral göz değişiklikler 15,16 bildirilmiştir ve veri yorumlanmasına neden olabilir, çünkü RGC yaşam değerlendirmek için tavsiye edilmez. Alternatif olarak, kullanım sham operasyonu gözleri 1 ile enjektekontrol grubu olarak BSS 0,5 ul. microscissors kullanarak, dikkatli bir şekilde göz soketten izole etmek gözün çevresinde bağ dokusu kesti. optik sinir başının seviyesinde keserek göz optik sinir ayırın. 30 G iğne kullanılarak göz içine fiksatif çözüm penetrasyonunu sağlamak için korneada bir delik açın. % 4 PFA göz yerleştirin ve ek tespit için 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. (MW: 214 g / mol),% 2 PFA ve 0.1 M sodyum kakodilat içinde% 2.5 glutaraldehit ihtiva eden bir çözelti içinde, optik sinir yerleştirin ve ek tespit için 4 ° C'de O / N inkübe edin. 5. RGC Soma Yoğunluk Niceleme Flat monte Retinaları . Aşağıdaki prosedür, Nadal-Nicolas ve ark 17 ile bir protokol uyarlanmıştır ve retina düz bağlar beyin ozel homeoboks / pou domain proteini 3A (Brn3a) karşı bir antikor kullanılarak RGCs miktarının özetlenmektedir: edin. alternatif metEtiketleme RGCs için ODS Fluorogold ya DII ile birden çok ekleme (RBPMS) ya da geriye doğru etiketi ile RNA bağlayıcı proteine ​​karşı bir antikor ile imünohistokimya dahil kullanılabilir. bir mikroskop altında, kornea kolayca ayrılana kadar tüm limbusta boyunca bir kesi yaparak gözün ön kısmını kaldırın. kornea ve lensi çıkarın. Dikkatle ora serrata ve optik sinir boyunca kesim yaparak göz retina ayırın. açıkça dört retina kadran tanımlamak için optik sinir doğru retina çevresinden dört küçük eşit kesiler yaparak retina düz montaj hazırlayın. küçük bir fırça kullanarak, yavaşça retina kalan vitrözü çıkarın. mümkün olduğunca vitreus çıkarılması ve temiz bir güçlü bir immünohistokimyasal sinyal elde edilmesi için çok önemlidir. Retina, böylece dikkatle PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ihtiva eden bir 48-gözenekli düz tabanlı kültür plakasının retina aktarınserbest yüzen. ganglion hücre tabakası yukarı baktığından emin olun. 15 dakika boyunca -70 ° C 'de kültür plakasına yerleştirin. PBS taze% 2 Triton X-100 içinde iki kez yıkanarak retina, daha geçirgenliği çözündükten sonra. PBS,% 2 Triton X-100 ve% 2 normal eşek serumu içeren 0.5 ml ug / – 0.3 Brn3a antikor seyreltilir. yavaşça 4 ° C'de O / N çalkalanarak Brn3a birincil antibodi çözeltisinin içine retina inkübe edin. retinalar her zaman tamamen çözelti 150 ile 200 ul içinde daldırılmalıdır. PBS,% 2 Triton X-100 içeren ml 2 ug / eşek anti-keçi IgG sekonder antikor seyreltilir ve hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 2 saat boyunca bu çözelti içinde retina inkübe edin. Retina tam olarak her zaman bir antikor çözeltisine batırılmış olmalıdır. photobleaching önlemek için kalan adımlar için alüminyum folyo ile kültür plaka örtün. Doku pos gibi düz duracak şekilde bir fırça kullanarak, dikkatli bir slayt retina aktarmaksible. 10 dakika boyunca hava kuru. anti-solmaya montaj orta kullanarak monte edin. Bir floresan mikroskop altında retina düz bağlar inceleyin. Açıklandığı gibi retina kadran başına üç örtüşmeyen alanlarda Brn3a pozitif RGCs sayısını ölçmek. 18 Optik Sinir Çapraz Bölümleri üzerinde RGC Aksonlar 6. sayısallaştırılması Aşama 4.5 optik disk toplamak ve 2 saat boyunca 2% ozmiyum tetroksit (OSO 4, MW 254,23 g / Mol) inkübe edilir. Dikkat: Yüksek toksisite nedeniyle, osmiyum tetroksit uygun laboratuvar kıyafetleri ile bir davlumbaz ele alınmalıdır. Her biri 15 dakika için (% 50,% 70,% 90,% 95 ve% 100) etanol içinde artan konsantrasyonlarda batırılarak optik sinir kurutmak. Aşağıdaki tarifi kullanarak epoksi reçine hazırlayın: 15.72 ml Sitene Ekle-812, süksinik anhidrit dodesenil 6.45 ml, 7.83 ml nadik metil anhidrit, 0.45 ml DMP-30. Sıralı oluşan çözümlerde optik sinir inkübe0: 1, 1: 1, 0.75: 0.25 ve 1: Aşağıdaki propilen oksit, epoksi reçinesinin oranları (MW 58.08 g / mol) 0. Optik sinir bir O / N süreyle oda sıcaklığında, her çözelti içinde inkübe edilir. Ek bir 48 saat boyunca 60 ° C'de% 100 epoksi reçinesi (6.4 son safha) gömülü optik sinirler inkübe edin. Bir mikrotom kullanılarak yarı-ince optik sinir kesitleri (0.75 mikron) oluşturun. % 1 toluidin mavisi ile optik sinir kesitleri Leke. Açıklanan 19 olarak her optik sinir bölümünün beş örtüşmeyen alanlarda RGC aksonlar ölçmek.

Representative Results

Bu protokol açıklanan erişkin farelerin ön kamaraya manyetik mikro-enjeksiyon GİB sağlam ve tekrarlanabilir yükselmesi ile sonuçlanmıştır. *** P <0.001; Bir hafta işleminden sonra, GİB'in Student t-testi (hipertansif gözünde 19, 10 ± 0.6 mm Hg (ortalama ± SEM), kontralateral gözlerde ortalama başlangıç ​​GİB den ± 0.5 mm Hg artış n = 12, Tablo 1, Şekil 2). IOP bundan sonra kararlı ve en az 6 hafta, bu çalışmada incelenen en uzun zaman noktası için 20 mm Hg ortalama yüksek kaldı. ameliyat sonrası 2, 3 ve 6 hafta sonra mikroboncuk enjekte gözlerde ortalama zirve IOP 25 mm Hg. Tedavi edilen farelerin büyük çoğunluğu bu nedenle bu protokol mikro boncuklar bir ikinci enjeksiyon gerektirmez, sürekli yüksek göz içi basıncı geliştirdi. Bu modelde RGC kaybı zaman seyrini değerlendirmek için, RGC soma vardıİlk Brn3a, bir RGC özgü işaret 17 ile immün sayılabilir. Brn3a-pozitif hücre sayısı, oküler hipertansiyon indüksiyonundan sonra, 1, 2, 3 ve 6 hafta sonra, düz monte retina üzerinde nicelleştirilmiştir. Önemli bir GİB yükselmesi gibi erken 1 olarak hafta microbead enjeksiyonundan sonra tespit edildi rağmen, RGC soma anlamlı kaybı prosedürü (Şekil 3) ilk 2 hafta içinde gözlenmiştir. Önemli RGC ölümü (% 22), ancak, (ortalama 2,430 ± 67 RGCs / mm2 ortalama ± SEM, n = 12) 3 hafta açıktı ve 6 hafta (2.350 ± 74 RGCs / mm2, n = 10) sonrası un çalışan farelerin (3141 ± 49 RGCs / mm2, n = 23) (ANOVA, p <0.001) bozulmamış kontrol gözlere kıyasla oküler hipertansiyon indüksiyon,. RGC akson disfonksiyon ve dejenerasyon glokom bir kardinal özelliğidir. Bu nedenle, aksonal kayıp mikroboncuk enjeksiyonla sonra 3. ve 6. haftalarda incelenmiştirtoluidin mavisi (Şekil 4) ile boyanmış, optik sinir kesitleri RGC akson ölçümü. RGC akson önemli bir zararı (% 25) 3 hafta gözlenmiştir (ortalama ± SEM 28.401 ± 702 aksonlar / sinir, s = 5) ve 6 hafta (29.426 ± 948 aksonlar / sinir, n = 6) mikro-enjekte edildikten sonra (39467 ± 137 akson / sinir n = 4) un çalışan gözlerden sağlam optik sinirlere oranla (ANOVA, p <0.001). Topluca, bu veriler fare ön kamaraya manyetik mikro-enjeksiyon tekrarlanabilir yol açar ve RGC soma ve akson dejenerasyonu ile sonuçlanır GİB yükselmesi sürekli olduğunu göstermektedir. OHT ameliyat sonrası zaman N GİB'in (mmHg) ortalama ± SEM Pik GİB (mmHg) Karşı glakom difference Karşı glakom 1 hafta 12 10 ± 0.4 19 ± 0.5 9 ± 0.6 12 ± 0.4 22 ± 0.6 2 hafta 13 11 ± 0.5 20 ± 0.8 9 ± 0.5 12 ± 0.9 25 ± 0.7 3 hafta 10 11 ± 0.8 20 ± 0.7 10 ± 0.9 13 ± 0.2 25 ± 0.9 6 hafta 12 12 ± 0.5 20 ± 0.6 9 ± 0.7 13 ± 0.5 24 ± 0.6 Fare Manyetik microbead Occlusi Göz İçi Basıncı Tablo 1. YükseklikModeli. uyanık Kadınlarda C57 BL / 6 fareler, GİB'in kalibre toparlanma tonometresi kullanılarak ölçüldü. Kumandalı gözleri işlemden sonra en az altı hafta boyunca yüksek kaldı bir hafta sonrası cerrahi tespit GİB artış göstermiştir. Glokom Fare Manyetik microbead Oklüzyon Modeli ilgilendim adımlar Şekil 1. İş Akışı. Öncesinde, sırasında gerçekleştirilen tüm prosedürlerin adım adım anahat ve ameliyat sonrası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Fare Manyetik microbead Oklüzyon Modeli Göz İçi Basıncı Şekil 2. artış. Uyanık olarakdişi C57 BL / 6 fareleri, IOP kalibre edilmiş TONOMETRENİN kullanılarak ölçülmüştür. microbead enjekte gözlerin GİB belirgin bir hafta sonrası cerrahi (ANOVA, p <0.001) yüksek bulundu. IOP önemli ölçüde en az 6 hafta (ANOVA, p <0.001) enjekte edilmiş farelerin diğer göz göreli yüksek kaldı. (Bozulmamış: n = 12; 1 hafta: n = 12, 2 hafta: n = 13, 3 hafta: n = 10, 6 hafta: n = 12). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Murin Manyetik microbead occlusion modelde. RGCs Şekil 3. retinal ganglion hücresi ölümü başlatmak için microbead enjeksiyon sonrası 3. ve 6. haftalarda tam kontrol retinaları (A) ve glokomatöz retinalarında Brn3a kullanarak düz monte retina immün ile görselleştirilmiştir(OHT) (B, C). Ölçek çubukları: 20 mikron. (D) Kantitatif analiz prosedürü kontrol gözlere kıyasla sonra microbead enjeksiyon 3 ve 6. haftalarda önemli RGC soma kaybına yol açtığını doğruladı. bozulmamış, glokom dışı C57 / BL6 farelerinde RGC soma yoğunluğu referans (beyaz barlar,% 100 hayatta kalma) olarak gösterilmiştir. 2 gün boyunca, n = 6: n = 6, 3 hafta: n = 12, 6 hafta, n = 10, ANOVA, *** p <;: Değerler SEM (Bozulmamış ± ortalamasıdır 1 hafta, n = 23 0.001). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Fare Manyetik microbead Oklüzyon Modeli. RGC akson Şekil 4. Aksonal Dejenerasyon toluidin mavisi ile optik sinir kesitleri boyanması ile görüntülendimikroboncuk enjeksiyon sonrası 3. ve 6. haftalarda tam kontrol (A) ve glokomatöz retinaları (OHT) (B, C) ​​ikna etmek için. Ölçek çubukları: 10 mikron. (D) Kantitatif analiz prosedürü kontrol gözlere kıyasla sonra microbead enjeksiyon 3 ve 6. haftalarda önemli RGC akson kaybı ile sonuçlanan doğruladı. bozulmamış, glokom dışı C57 / BL6 farelerinde RGC akson yoğunluğu referans (beyaz barlar,% 100 hayatta kalma) olarak gösterilmiştir. Değerler ortalama ± SEM olarak ifade edilir (Bozulmamış: n = 4; 3 hafta: n = 5, 6 hafta: n = 6, ANOVA, *** p <0.001). Tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için .

Discussion

Burada sunulan video teknikler etkin ve üretken farelerde GİB yükselmesi ikna etmek için manyetik mikro-boncuk intrakamaral enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği hakkında ayrıntılı adım adım yönergeler sağlar. Ek enjeksiyon gerektirir ve oküler hipertansiyon induction.Elevated GİB ilk 3 hafta içinde saptanabilir RGC soma ve akson kaybı teşvik değil sürekli GİB'in artış Bu prosedür sonuçları, insanlarda glokom gelişimi için önemli bir risk faktörüdür. Bu nedenle, bu geniş bir uygulama aralığı için bir potansiyele sahip değerli murin oküler hipertansiyon bağımlı glokom modelidir.

ön odaya mikro-enjeksiyonu ile bağlantılı ortak bir dezavantajı iğnesi geri çekildiğinde, genellikle sulu bir çıkış ve artan değişkenlik ancak kısmen tıkanması ile sonuçlanan, enjeksiyon yeri üzerinden geri akış boncuk ile ilgilidir. Bu sorunu gidermek için, birçok önemli değişiklikler hayata geçirilmiştir. Firs T, bir yontulmuş konik bir temiz ve keskin bir cam Mikroiğnenin dikkatli bir hazırlık mikroboncuk başarılı bir enjeksiyon için gereklidir. Bir düzgün hazırlanmış microneedle narin göz yüzeyine basınç minimal uygulama ile korneanın kontrollü ve düzgün penetrasyonunu sağlar. küçük korneal delinme mikro boncuklar geri akmasını önler. Buna ek olarak, ince microneedle olmayan hastalık ile ilgili inflamasyona neden olabilir örneğin iris ve lens olarak zarar yakındaki yapıların, riskini azaltır. İkincisi, sırasında ve enjeksiyondan sonra stratejik göz alanlarına el mıknatıs uygulaması bu tekniğin bir başka önemli yönüdür. Enjeksiyon sırasında, manyetik mikroiğne geri çekildiğinde mikroboncuk ön kamara önlenmesi geri akış manyetik mikro-boncuklar çekmek için kullanılır. Enjeksiyondan sonra, mıknatıs sonra sulu humor çıkışı engellemek için iridokorneal açıya mikroboncukları yönlendirmek için kullanılır.

çadır "> genellikle microbead tıkanıklığı modellerinde karşılaşılan bir başka sorun, tekrarlanan boncuk enjeksiyonları genellikle GİB artışı 10,11. Bu ile zaman. iridokorneal açıdan bir el mıknatıs kombinasyonunu yerinden oynatmamaya mikro boncuklar sonucu olabilir sürekli başarmayı için gerekli olmasıdır yukarıda açıklanan ve fare konumlandırma sonrası operasyon büyük ölçüde sonucu artırır. esneklik uzun bir post-operatif iyileşme sürecini işlemi sırasında kafa taşımak ve ihtiyaç için izin enjektabl anestezik kullanımını olarak, tercih edilir. Yerleştirme ve ameliyat göz ameliyatından sonra birkaç saat için yukarı bakacak şekilde fare iridokorneal açıda mikro-çözümüne katkıda bulunur ve ön kamaraya geri yerinden oynatmamaya riskini azaltır.

Enjekte boncuk sayısının nispeten tutarlı sağlanması arası hayvan varyasyonları en aza indirmek için bir başka önemli adımdır. mikroboncuklarının b yerleşmek beriottom borunun, tamamen mikroboncuk çözelti homojen hale getirmek ve zamanında mikroiğne, uygun hacim çekmek için gereklidir. ön kamaraya az boncuk Enjeksiyon kötü veya değişken GİB yol açması muhtemel olan sulu mizah drenaj yapılarının eksik tıkanma, neden olabilir. microbead enjeksiyon nihai amacı göz içi basıncını yükseltmek için olmasına rağmen uyanık farelerden alınan GİB ölçümleri bu çalışmada (~ 25 mmHg) bildirilen tepe değerlerinden daha yüksek olduğunda notun, dikkatli alınmalıdır. Son derece yüksek GİB iskemik hasar riskini arttırır ve aynı zamanda hayvana ağrıya neden olabilir. GİB yükselmesi cerrahinin başarısını değerlendirmek için birçok faktörlerden biri olarak kabul edilmelidir. Bu nedenle, işlemin sonucu GİB artışı, RGC soma ölüm ve akson kaybı dahil olmak üzere birçok parametrelere dayalı teraziye alınmalıdır.

Burada açıklanan protokol çoğu microbeads başarılı sonuçlanır rağmenly açıda yerleşen, bu modelin bir potansiyel sınırlama ön kamarada yüzen kalır o boncuk kornea aracılığıyla canlı retina görüntüleme yanı sıra ışığın etkin geçişini gerektiren elektrofizyolojik veya davranışsal deneyleri etkileyebilir olmasıdır. Bu microbead tıkanıklığı modeli kullanan GİB artışı ve sonraki RGC dejenerasyon ölçüde işletilen fare [4] yaş ve genetik arka plan ile değişir olduğunda diğer önemli yönü dikkate. Bu nedenle, GİB yükselmesinin kapsamı ve RGC dejenerasyon zaman çizelgesi her spesifik transgenik fare hattı ve / veya yaş aralığı için tespit edilmesi gerekir.

Bu modelin bir özelliği microbead enjeksiyonu ve önemli RGC ölümünden sonra ilk üç haftasında RGC ölüm kademeli kaybı yüksek GİB'in sonuçları işlemden sonra 3 hafta tespit olmasıdır. Bu nedenle, bu model, bu D meydana erken ve / veya hafif değişiklikleri inceleme sağlarhastalığı bulunanlarda, önceki RGC soma ve akson kaybı ile belirgin. RGC ölüm önemli bir artış oküler hipertansiyon indüksiyondan sonra 3 ve 6 hafta arasında gözlenmemiştir. Başarılı rağmen 3 ila 6 hafta arasında% 25 ve bu zaman noktalarında GİB yükselmesi sürekli – Aslında, RGC soma ve akson kaybı ~ 22 sabit kaldı. Sürekli IOP daha uzun süre C57BL Diğer fare suşlarının göre RGC hasara karşı daha dayanıklı olduğu görülmektedir / 6 fareleri, oluşacak ek RGC kaybı için gerekli olabilir. 5 ek değişiklikler burada sunulan protokol, boncuk büyüklüğü ayarlama dahil olmak üzere ve ilave enjeksiyonlar, daha sonra zaman noktalarında RGC kaybı incelemek için gerekli olabilir. Bu nedenle, bizim protokol insan glokom başlangıcı ve erken ilerlemesi alakalı mütevazı RGC nörodejenerasyon ile ilişkili erken patofizyolojik değişikliklere odaklanan çalışmalar için idealdir.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.

Materials

Puller Narishige PC-10
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW150F-4 Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm
Stereo Microscope Zeiss MZ9.5 Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.
Footswitch Linemaster T-91-SE
Stainless Steel Blade Feather No. 11
Microelectrode Beveler Science Products BV-10
Aerosol Duster Fisher 23-022-523
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
Vortex Fisher Scientific 12-812
Dynabeads M-450 Epoxy Life Technologies 14011 Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4°C.
Mini-Tube Rotators Fisher Scientific 05-450-127
3 Handheld Magnets Geomag 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.
25 mL serological pipet Costar 4489
Pipet Drummond 4-000-101
Biological Containment Hood Biostad 377355
Balanced salt solution (BSS) Alcon 0065-0800-25
P1000 Micropipet Gilson F123602
Microtube 1.5 mL Sarstedt 72.690
P200 Micropipet Gilson F123601
0.2 mL PCR tube Sarstedt 72737.002
Ketamine Controlled substance
Xylazine Bayer Healthcare
Acepromazine Vetoquinol
U-100 Insulin Syringe Becton Dickinson and Company 329461
Balance Ohaus CS 200
Buprenorphine Controlled substance
Tropicamide ophthalmic solution Alcon 0998-0355-15 1% Mydriacyl
Manual Microsyringe Pump with Digital Display World Precision Instruments DMP
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Platform Fisher Scientific 14-673-52 8 x 8 inch
Absorbent swabs Kettenbach 30601
P20 Micropipet Gilson F123600
Plastic forcep Euroband 1001 Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye
Fluoroquinolone ophthalmic solution Alcon Vigamox
Heating pad Sunbeam E12107-834
Tonometer iCare TV02 TONOLAB rebound tonometer 
Paraformaldehyde, Para Fisher Scientific T353-500
Dissection tools
Small brush
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G7651
Sodium Cacodylate, tryhydrate Canemco and Marivec 124-65-2
Brn-3a antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-31984
Tissue Culture Plate, 48 well Falcon 353078
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Life Technologies A-11058
Aluminum foil
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Slow fade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5E
Osmium tetroxide 2% aqueous solution Electron Microscopy Sciences 3294949
Embed-812 Electron Microscopy Sciences 14900
Dodecenyl succinic anhydride Electron Microscopy Sciences 13710
Nadic methyl anhydride Electron Microscopy Sciences 19000
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205-1L
Embedding mold-Dykstra Electron Microscopy Sciences 70907
Porter-Blum ultra-microtome Sorvall MT-2
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) Fisher-Scientific T161-25
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
  2. Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).
  3. Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
  4. Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
  5. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
  6. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
  7. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neuroscienze. 35, 2329-2343 (2015).
  8. Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
  9. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
  10. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
  11. Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
  12. Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
  13. Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
  14. Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
  15. Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92 (2012).
  16. Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133 (2014).
  17. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
  18. Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
  19. Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27 (2010).

Tags

Magnetic MicrobeadOcular HypertensionGlaucomaMouse ModelMicro-needleMicro-pipetteBevelingIntraocular PressureIOPProparacaine HydrochlorideTonometer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Ito, Y. A., Belforte, N., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice. J. Vis. Exp. (109), e53731, doi:10.3791/53731 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image