A Magnetic Microbead Oclusión Modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones

El siguiente procedimiento se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales para el Uso de Animales Experimentales y de la Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visual de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO). 1. Preparación de la microaguja para anterior intracameral Inyección Con un extractor, generar una microaguja a partir de un capilar de vidrio de borosilicato Bajo el microscopio, utilizar una hoja afilada cuidadosamente para crear una abertura en la punta de la microaguja. La apertura resultante debe tener una forma elíptica con un diámetro mayor y eje menor de aproximadamente 190 micras y 70 micras, respectivamente. Medir el área de la abertura de microagujas preparado por primeras imágenes que adquieren con una regla colocada bajo el microscopio seguido por la cuantificación usando software de análisis de imágenes. En el sistema de biselado micropipeta, coloque la microaguja en un 20 degree ángulo respecto a la placa de biselado de manera que la abertura de microagujas está en contacto con la placa. Bevel durante aproximadamente 10 min hasta que los bordes son plana y lisa. Añadir unas cuantas gotas de agua destilada para ayudar en el proceso. Girar la microaguja para biselar los dos bordes que rodean la abertura hasta que la punta está afilada. Limpiar toda la suciedad y el agua de la abertura de la punta de microagujas usando un plumero de aerosol. Examine cuidadosamente la microaguja acabada con un microscopio. microagujas de descarte con fracturas para reducir al mínimo el riesgo de que se rompa durante la cirugía de microagujas. Esterilizar la microaguja enjuagando primero con etanol, luego con solución salina equilibrada estéril (BSS). 2. Preparación de la solución Microbead Magnética Nota: Las microperlas magnéticas utilizadas en este estudio se recubren con grupos epoxi. Para evitar los efectos adversos, tales como la aglutinación de las perlas y las interacciones moleculares deseados, estos grupos epoxi debeprimero ser retirado de las microperlas antes de proceder con la cirugía de la inyección. La eliminación de los grupos epoxi de perlas magnéticas Preparar una solución de hidróxido de sodio 0,02 M (NaOH, MW 39.997 g / mol) en 10x tampón Tris (MW 121.14 g / mol). Vórtice suavemente el stock de solución microbead magnética (4,5 m de diámetro, 4 x 10 8 perlas / ml) hasta que las perlas se suspendieron de manera uniforme en la solución. pipetear rápidamente 1 ml de solución de perlas magnéticas en 50 ml de NaOH 0,02 M en tampón 10x Tris. Rotar durante 24 horas a RT para eliminar los grupos epoxi de las perlas. Recoger las perlas asegurando un imán a la parte inferior del tubo. Oriente el tubo horizontalmente para asegurar que todos los granos son atraídos por el imán. Gire durante 4 horas adicionales a temperatura ambiente. Con una micropipeta, retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento de perlas. vórtice suavemente el sedimento en 50 ml de 10x Tris tampón hasta que las cuentas están bien suspendidos. Repita los pasos 2.1.4 a 2.1.6. La concentración y la resuspensión de las microperlas magnéticas en solución salina equilibrada estéril Nota: Es necesario concentrar el stock de solución de perlas magnéticas en solución salina equilibrada estéril (BSS) para alcanzar una concentración final de 1,6 x 10 6 perlas / l de modo que 2,4 x 10 6 perlas pueden ser inyectados en la cámara anterior en una volumen final de 1,5 l, que es apropiado para el ojo pequeño ratón. Lavar las perlas en 5 ml de agua ultra pura de grado de laboratorio mediante agitación suave durante 2 min. Recoger las perlas por atraer a la parte inferior del tubo con un imán. Con una micropipeta, retirar con cuidado el agua sin alterar el sedimento de perlas. Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.3 tres veces más. En una campana de flujo laminar, lavar las perlas con 500 l de NBS por pipetting arriba y hacia abajo. Realice los pasos restantes de esta sección en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Recoger las perlas por atraer a la parte inferior del tubo con un imán. Con una micropipeta, retirar con cuidado el BSS sin perturbar el sedimento de perlas. Repita los pasos 2.2.5 a 2.2.7 tres veces más. Volver a suspender pipeteando las cuentas arriba y hacia abajo en 250 l de BSS. Asegúrese de que la solución de bolas está bien homogeneizada. Entonces, rápidamente alícuota de 25 l de la suspensión en recipientes estériles de tubos de 0,5 ml. La concentración final de la solución madre de perlas es de 1,6 x 10 6 perlas / l. Almacenar a 4 ° C. 3. La inducción de la hipertensión ocular Nota: La sección 3 es una operación de dos personas. En el caso de que una acción específica debe ser realizada por una persona específica, se identifica a la persona adecuada. En general, la Persona 1 maneja el ratón bajo el microscopio, mientras que la Persona 2 es responsable para manipular la bomba microjeringa. La duración total del procedimiento quirúrgico debe ser inferior a 10 min (pasos 3.9 a 3.17). Realizar procedimientos en ratones C57BL / 6 adultos. Los ratones domésticos en un entorno estándar con acceso a comida y agua ad libitum. En este papel, utilice la hembra C57BL / 6 ratones de entre 3 y 4,5 meses de edad. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar a los machos y ratones de diferentes edades, así como otras cepas de ratón, incluyendo ratones transgénicos y knockout. Medir la PIO basal en ratones despiertos antes de la inyección de anestesia y microbead utilizando un tonómetro de rebote calibrado. Aplicar una gota de clorhidrato de proparacaína en la córnea. frenar suavemente el ratón mediante la celebración de la piel entre las orejas. Coloque el ratón en la mesa de trabajo de modo que el animal está cómodo y los ojos son accesibles. Mantenga el tonómetro perpendicular a la superficie de la córnea y tomar al menos tres series de diez lecturas consecutivas por cada ojo para obtener unala media de la PIO. Se prefiere la medición de la PIO en ratones despiertos para eludir los efectos relacionados con la anestesia en la PIO. Alternativamente, se puede medir IOP en ratones anestesiada después de la etapa 3.4. Preparar una mezcla de anestesia cóctel stock ratón compuesta de 20 mg / ml de ketamina, 2 mg / ml de xilazina y 0,4 mg / ml de acepromazina. Inducir la anestesia en el ratón mediante la administración intraperitoneal de la mezcla de cóctel (1 l / g de peso corporal). El uso de un cóctel anestésico inyectable se prefiere sobre los anestésicos de gas (por ejemplo, isoflurano), ya que permite flexibilidad al manipular la cabeza de ratón como el animal no está conectado a una máscara de inhalación. Además, el periodo de recuperación más largo requerido con un anestésico inyectable se asegura de que las microperlas se depositan en el ángulo iridocorneal sin desplazar de nuevo en la cámara anterior. Administrar 0,05 mg por kg de peso corporal por vía subcutánea de buprenorfina. Tratar el ojo con una ey tropicamidae soltar para inducir dilatación de la pupila. Debido al tamaño pequeño de la cámara anterior murino, el alumno debe ser dilatado para visualizar fácilmente el posicionamiento y el avance de la microaguja durante la inyección. Aplicar la pomada tópica en el ojo contralateral (no operada) para evitar la desecación de la córnea durante el procedimiento. Adjuntar una microaguja limpia para el conjunto de inyección de la bomba microjeringa. Vuelva a colocar la microaguja después de cada operación para evitar la contaminación cruzada de los animales. Persona 1: Transferir el ratón anestesiado a la plataforma operativa. Bajo el microscopio, asegúrese de que la pupila está completamente dilatado y que los músculos oculares están relajados de modo que no hay movimiento del ojo. La ausencia de movimientos oculares asegura la estabilidad durante la inyección. limpie con cuidado el colirio de tropicamida del ojo utilizando hisopos absorbentes. Persona 2: Mezclar la solución microbead magnética pipeta hacia arriba y hacia abajo. El uso de la bomba microjeringa, cargar inmediatamente el microneedle (preparado en el apartado 1) con 1,5 l de la solución homogeneizada microbead magnética (2,4 x 10 6 bolas). Asegurarse de que las burbujas de aire están ausentes en la punta de la microaguja. Una vez cargado el microagujas, realice los pasos 3.12 a 3.13 lo más rápido posible para que la solución microbead magnética permanece en una suspensión homogénea. Coloque la microaguja cargado en un ángulo de 45 °, colocado en sentido anterior con relación al limbo. Persona 1: apoyar el ojo con unas pinzas de plástico. Asegúrese de que el ángulo entre la microaguja y las pinzas de plástico es de aproximadamente 90 °. Persona 2: Con la microaguja cargado, perfore suavemente la córnea de modo que la punta de la microaguja penetra en la cámara anterior. Asegúrese de que la microaguja cargado se mantiene en un ángulo de 45 ° con relación al limbo durante la punción. Evitar cualquier contacto con la lente o el iris. Asegúrese de que la microaguja no entra en la cámara posterior. Persona 1: continúan apoyando el ojoutilizando pinzas de plástico. Persona 1: Sin mover la cabeza de ratón, coloque el imán al lado del ojo, frente a la punta de microagujas, para atraer a las perlas magnéticas en la cámara anterior y minimizar el contacto de las perlas con la superficie interior de la córnea. Persona 2: El uso de la bomba Inyectar 1,5 l de la solución de perlas magnéticas en la cámara anterior. La solución de microperlas se inyecta durante un periodo de 15 a 30 seg. Persona 1: Continúe sujetando el imán opuesto a la punta de microagujas durante toda la duración de la inyección. Persona 2: Una vez que se ha inyectado el volumen total de cuentas, retirar lentamente la microaguja del ojo. Persona 1: Para evitar el reflujo de las microperlas, siguen atrayendo a las perlas magnéticas hacia la cámara anterior manteniendo el imán al lado del ojo de un adicional de 30 a 60 seg. Persona 1: Usando el imán, atrae a las cuentas del ángulo iridocorneal. Asegúrese de que los granos forman un anillo uniformemente distribuidaalrededor de la circunferencia de la cámara anterior. Durante este paso, evitar atraer perlas a la córnea, ya que tienen una tendencia a pegarse a la superficie interior de la córnea tras el contacto. Se trata el ojo operado con un colirio antibiótico para minimizar el riesgo de infección. Deje que el ratón para recuperarse de una almohadilla de calor hasta que esté completamente despierto (~ 3 a 4 horas). Coloque el ratón de modo que el ojo operado esté orientado hacia arriba. Este posicionamiento evitará la acumulación de las perlas inyectados a la superficie interior de la córnea por fuerza de gravedad. Además, esta posición disminuirá el potencial de infección como el ojo operado no estará en contacto con la ropa de cama y / o de otros materiales que pueden estar presentes en la jaula. En el caso de que un animal muestra ningún signo de sufrimiento, administrar dosis adicionales de buprenorfina, según sea necesario. Permitir a los ratones para recuperarse del procedimiento durante al menos 2 días antes de tomar mediciones de la PIO. Medir la PIO como se describe en 3.2. monitor IOP al menos una vez a la semana o con mayor frecuencia, según sea necesario, y, al mismo momento del día para minimizar las fluctuaciones relacionadas con circadianos. Para mediciones de la PIO, utilizar el ojo contralateral desde el ratón operado como un control interno. Como alternativa, se emplean mediciones de controles intactos, que no son operados o ratones con operación simulada como ingenuos. 4. Evaluación de la célula retiniana de Soma y Axon Supervivencia Perfundir ratones sometidos a la hipertensión ocular por inyección intracardiaca de la solución de 0,1 M de tampón de fosfato (PBS), seguido inmediatamente por el frío de hielo 4% de paraformaldehído (PFA). Perfundir ratones intactos, no operados como se describe en 4.1 y utilizarlos como controles no lesionados. No se recomienda el uso de los ojos contralaterales de ratones operados para evaluar la supervivencia de CGR, porque los cambios en los ojos contralaterales después de la lesión se ha informado de 15,16 y pueden confundir la interpretación de los datos. Por otra parte, el uso de los ojos con operación simulada inyectados con 1.5 L de BSS como controles. El uso de micro tijeras, corte con cuidado el tejido conectivo alrededor del ojo para aislarlo de la cuenca del ojo. Separar el nervio óptico del ojo mediante la reducción en el nivel de la cabeza del nervio óptico. Usando una aguja G 30, hacer un agujero en la córnea para permitir la penetración de la solución de fijación en el ojo. Coloque el ojo en 4% PFA y se incuba durante 1 hora a 4 ° C para la fijación adicional. Coloque el nervio óptico en una solución que contiene 2% PFA y 2,5% de glutaraldehído en cacodilato de sodio 0,1 M (MW: 214 g / mol) y se incuba O / N a 4 ° C para la fijación adicional. 5. Las retinas La cuantificación de las CGR Soma densidad sobre el Flat-montados Nota: El siguiente procedimiento es una adaptación de un protocolo por el Nadal-Nicolas et al 17 y describe la cuantificación de la CGR utilizando un anticuerpo contra el homeobox / POU dominio de la proteína 3A-específica del cerebro (Brn3a) en montajes planos de la retina.. met alternativaSAO para CGR etiquetado también se puede utilizar incluyendo inmunohistoquímica con un anticuerpo contra la proteína de unión al ARN con empalme múltiple (RBPMS) o el etiquetado retrógrada con Fluorogold o DiI. Bajo un microscopio de disección, retirar la parte anterior del ojo mediante una incisión a lo largo de todo el limbo hasta la córnea se separa fácilmente. Retire la córnea y el cristalino. separar cuidadosamente la retina del ojo, mediante cortes a lo largo de la ora serrata y el nervio óptico. Preparar un montaje plana de la retina al hacer cuatro pequeñas incisiones equidistantes de la periferia de la retina hacia el nervio óptico para delimitar claramente los cuatro cuadrantes de la retina. El uso de un cepillo pequeño, retire con cuidado vítreo restante de la retina. La extirpación de tanto humor vítreo como sea posible es crucial para obtener una señal de inmunohistoquímica limpia y fuerte. transferir cuidadosamente la retina a una placa de cultivo de fondo de 48 pocillos plana que contiene 0,5% de Triton X-100 en PBS de manera que la retina esde libre flotación. Asegúrese de que la capa de células ganglionares está orientado hacia arriba. Coloque la placa de cultivo a -70 ° C durante 15 min. Después de descongelar las retinas, más permeabilizar por lavado dos veces en fresco 2% de Triton X-100 en PBS. Diluir el anticuerpo Brn3a a 0,3 a 0,5 g / ml con PBS que contenía 2% de Triton X-100 y 2% de suero normal de burro. Incubar la retina en la solución de anticuerpo primario Brn3a agitando suavemente O / N a 4 ° C. Las retinas deben estar completamente inmersos en 150 a 200 l de solución en todo momento. Diluir el anti-anticuerpo secundario de cabra IgG de burro a 2 mg / ml con PBS que contenía 2% de Triton X-100 y se incuba la retina en esta solución durante 2 horas a RT con agitación suave. La retina debe estar completamente sumergido en la solución de anticuerpo en todo momento. Cubrir la placa de cultivo con papel de aluminio para el resto de pasos para evitar photobleaching. Usando un cepillo, transferir cuidadosamente la retina a un portaobjetos de modo que el tejido se encuentra tan plano como possible. Deje secar al aire durante 10 minutos. Montar utilizando medio de montaje anti-fade. Examinar los montajes planos de la retina bajo un microscopio de fluorescencia. Cuantificar el número de CGR Brn3a positivos en tres áreas que no se solapan por cuadrante retiniano como se describe. 18 6. Cuantificación de las CGR axones en el nervio óptico Secciones representativas Recoger el nervio óptico desde el paso 4.5 y se incuban en un 2% tetróxido de osmio (OsO4, MW 254.23 g / mol) durante 2 horas. Precaución: Debido a su alta toxicidad, tetróxido de osmio debe ser manejado en una campana extractora con traje de laboratorio adecuada. Deshidratar el nervio óptico sumergiéndolo en concentraciones de etanol creciente (50%, 70%, 90%, 95% y 100%) durante 15 minutos cada uno. Mezclar la resina epoxi usando la siguiente receta: 15.72 ml Insertar-812, 6,45 ml dodecenilo anhídrido succínico, 7,83 ml de anhídrido nádico de metilo, 0,45 ml DMP-30. Secuencialmente incubar el nervio óptico en soluciones compuestasde las siguientes proporciones de resina epoxi a óxido de propileno (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25, y 1: 0. Se incuba el nervio óptico en cada solución a TA durante una O / N período. Incubar nervios ópticos embebidos en resina 100% epoxi (último paso de 6,4) a 60 ° C durante una 48 h adicionales. Generar secciones transversales del nervio óptico semi-delgadas (0,75 m) utilizando un microtomo. Teñir secciones transversales del nervio óptico con 1% de azul de toluidina. Cuantificar los axones de CGR en cinco áreas no superpuestas de cada sección del nervio óptico como se ha descrito 19.