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Immunologia e infezioni

Desenvolvimento e validação de um método PCR quantitativa para equídeo herpesvírus 2 Diagnostics em fluidos respiratórios

Published: March 17, 2016
doi:
10.3791/53672
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1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655),Normandy University, 3Hippolia Foundation

Summary

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

Abstract

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.

Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.

This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Introduction

Equid herpesvírus-2 (EHV-2) está envolvido em uma síndrome respiratória, com possíveis manifestações clínicas como corrimento nasal, faringite e inchaço dos gânglios linfáticos 1-3. Este vírus também é suspeito de estar associado com o pobre desempenho de cavalos, o que pode resultar em um impacto económico significativo e negativo para a indústria de cavalo 2.

Até agora, o padrão ouro para gamma-EHV (γ-EHV) de detecção foi o método de cultura de células. O primeiro inconveniente desse procedimento foi a ausência de discriminação entre EHV-2 e outro γ-EHV de (por exemplo, EHV-5). O segundo inconveniente foi o lento desenvolvimento do processo citopático, que leva de 12 a 28 dias para se manifestar 4,5.

Desenvolvimento de uma reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo validado e normalizado (qRT-PCR) vai ajudar a detectar rapidamente o vírus, para discriminar entre EHV-2 e EHV-5 e para estudar a relação entre a carga genoma viral e que a doença graças ao aspecto quantificação.

Reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi descrita pela primeira vez em 1986 por Mullis 6 e está prestes a tornar-se o novo padrão de ouro na maior parte dos campos de diagnóstico biológico (humana, ambiente e veterinária). Este método, que é baseada na amplificação de uma parte do genoma de organismos patogénicos, apresenta muitas vantagens: a especificidade, sensibilidade e rapidez. Além disso, o risco de contaminação do amplicon recuado desde o advento de qRT-PCR e controlo de qualidade 7. No entanto, o reconhecimento de PCR tal como um novo método padrão de ouro necessária mais do que apenas os dados de desempenho melhorado, mas também a demonstração de controlo do desenvolvimento e validação de passos de todo o método, sem degradação do desempenho ao longo do tempo.

As primeiras ferramentas moleculares utilizados para a detecção de EHV-2 eram tempo camplificação não específica onsuming e envolvido com PCR seguido de seqüenciamento 8. Os genes-alvo para vírus do herpes foram ácido desoxirribonucléico (DNA) polimerase e DNA embalagem 9. No entanto, a PCR aninhada apresenta um elevado risco de contaminação por produtos de amplificação. Desde então, os testes de PCR convencionais foram concebidos para amplificar a interleucina 10-like gene ou gene B glicoproteína, revisto em 2009 2. Mais recentemente, as características de PCR em tempo real foram descritas para a quantificação do EHV-2 10, mas não havia dados disponíveis relativas à validação de todo o método, incluindo o processo de extracção.

Neste protocolo, os procedimentos de desenvolvimento e validação são descritas para um método de PCR quantitativo para a detecção e quantificação de DNA EHV-2 em fluidos respiratórias em eqüinos de acordo com a Association Française de normalização (AFNOR) norma NF U47-600 3,11,12, que é o representante francês noa comissão de normalização internacional. Esta norma detalha os "Requisitos e recomendações para a implementação, desenvolvimento e validação de PCR veterinária em animais método de análise de saúde" 11,12, de acordo com a NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 e OIE (Organização Mundial de Saúde Animal) . recomendações de 2010 14 o qRT-PCR protocolo de validação EHV-2 envolve um processo de três partes: (a) o desenvolvimento do ensaio qRT-PCR, (b) caracterização de ensaio de qRT-PCR sozinho e (c) caracterização do todo método analítico (obtida por extracção de ácidos nucleicos a partir da amostra biológica para análise de PCR).

A caracterização do ensaio de qRT-PCR e de todo o método analítico incluir a definição de dois limites: o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ). O LOD 95% de PCR representa o menor número de cópias de ácidos nucleicos por unidade de volume que pode ser detectado em 95% de todos os CASes. O LOQ 95% PCR representa o menor quantidade de cópias de ácidos nucleicos que podem ser determinados tendo em conta as incertezas.

Este método de qRT-PCR permite a detecção rápida e precisa quantificação de EHV-2 em fluidos respiratórios. Além disso, o método pode ser aplicado em outros laboratórios de assegurar um procedimento padronizado e como modelo geral para o desenvolvimento de outros ensaios de qRT-PCR novos.

Protocol

Nota: Consulte a todos os diferentes passos que são ilustradas na Figura 1. 1. Extracção de Ácidos Nucleicos Nota: Execute a extracção sob um exaustor para limitar a contaminação das vias aéreas com ácidos nucléicos. Incluir um controlo negativo extracção com água tratada com DEPC para assegurar que nenhum dos reagentes estão contaminados com DNA indesejado. Extrair os ácidos nucleicos a partir da amostra biológica de acordo com um protocolo previamente descrito protocolo 15 e do fabricante. Adicionar 140 ul de amostra biológica a 560 ul de solução de lise (tampão AVL) e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. Adicionar 560 ul de etanol. Aplicar os primeiros 630 ul desta solução (amostra + + lise solução de etanol) a uma coluna de sílica e centrifugar. Aplicar os restantes 630 ul desta solução para a mesma coluna de sílica e centrifugar. Em seguida, lava-se a coluna com 500 ulde 2 tampões de lavagem diferentes (AW1 e AW2). Elui-se ácido nucleico com 50 ul de tampão de eluição (tampão de AVE) e equilibrar à temperatura ambiente. Fechar a tampa e incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar a 6000 g durante 1 min. 2. procedimento de amplificação Prepare 22.5 ul de mistura reaccional para cada reacção. Adicionar 12.5 ul de PCR Master Mix, x ul de 20 uM de iniciadores para a frente, X ul de 20 fiM de primer reverso, Y ul de sonda de 10 uM e Z ul de água ultrapura, conforme necessário para atingir 22,5 ul (x, y e z volumes são obtidos após a titulação, ver Secções 3.2.3 e 3.2.6). Aliquota de 22,5 uL da mistura de reacção apropriada para cada cavidade de reacção numa placa de 96 poços. Nota: incluir controlos negativos para a extracção e para a PCR para assegurar que nenhum dos reagentes estão contaminados com DNA indesejado. Adicionar 2,5 mL da amostra, 2,5 ul de negativ extracçãoe controle, 2,5 l de controle PCR negativo e 2,5 ul de amostra positiva (estirpe de referência ou plasmídeo) para a reação correspondente bem. Após a distribuição, cobrir a placa com um selo placa adesiva. Centrifugar a placa durante 10 segundos a 6.000 g. Colocar a placa num sistema de PCR em tempo real. Seleccione o modelo para o layout de ensaio e iniciar a execução. Utilize a definição do programa de PCR: 10 min a 95 ° C, seguido de 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C (Tabela 1). Transferir os dados brutos do sistema de PCR em tempo real para uma planilha. Definir o limite nas parcelas de amplificação acima da linha de base e dentro da região de crescimento exponencial para se obter o ciclo limite para cada amostra. Traçar cada padrão ponto definido como uma curva padrão para obter linearidade. Calcular o número de cópias para as diferentes amostras com base na curva padrão. 3. Desenvolvimento de RT-PCR quantitativo Nota: O desenvolvimento de um teste de qRT-PCR requer estirpes de referência, um plasmídeo titulada específico, e diferentes controlos e implica a titulação dos iniciadores e sonda. Teste preliminar Iniciadores do projeto e sondas com software específico de acordo com as recomendações anteriores 16. Extraia cepas de referência, conforme descrito na seção 1. Amplificar tal como descrito na secção 2 com 900 nM para a concentração final de iniciadores e 250 nM para a concentração final de sonda. Analisar o sinal como descrito na seção 2.5. Ao mesmo tempo, realizar a amplificação de DNA cepas de referência (como descrito na seção 3.1.3), sem sondas. Sequenciar os produtos de amplificação obtidos pelo método de Sanger 17,18. Analisar as sequências, executando uma BLAST nucleotídeo 19. Titulação de iniciadores e a sonda Prepare 3 misturas diferentes com 250 nM concentração final da sonda e com diferentes concentr finaisções do iniciadores directos e inversos (50 nm / 50 nm, 300 nm / 300 nm, 900 nm / 900 nm) para os 3 repetições de amostra positiva e um controlo negativo. Para cada mistura, adicionar o mesmo volume apropriado de 20 uM de iniciadores para a frente e 20 fiM de primer reverso (0,25 uL para se obter a concentração final de 50 nM, 1,5 ul para se obter os 300 nM de concentração final ou 4,5 ul para se obter a concentração final de 900 nM) , 50 ul de PCR master mix, 2,5 l de sonda 10 mM e água ultrapura como necessária para alcançar 90 mL. Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Escolha a melhor condição para obter o mais alto nível de amplificação, o limiar mais antigo ciclo (Ct) e melhor repetibilidade entre as 3 condições. Determinar a melhor concentração e o volume correspondente a X ul de iniciadores directos e inversos. Prepare 5 misturas diferentes para as 4 amostras (3 repetições de amostra positiva e um controlo negativo)com 5 diferentes concentrações finais de sonda (50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM). Para cada mistura, adicione x ul de 20 mM de primer para a frente e x ul de 20 mM primer reverso (previamente determinado, no ponto 3.2.3), 50 ul de PCR master mix, volume apropriado de 10 mM sonda (0,5 ul para obter a concentração de 50 nM, 1 uL para se obter a concentração de 100 nM, 1,5 uL para se obter a concentração de 150 nM, 2 uL para se obter a concentração de 200 nM ou 2,5 ul para obter a concentração de 250 nM) e água ultrapura, conforme necessário para atingir 90 ul. Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Escolha a melhor condição para obter o mais alto nível de amplificação, o limiar mais antigo ciclo (Ct) e melhor repetibilidade entre as 5 condições. Determinar a melhor concentração e o correspondente volume de y ul para a sonda. 4. Caracterização da Quantitativa Real-time PCR (qRT-PCR) Nota: Após o passo de desenvolvimento e determinação dos melhores condições a utilizar, o passo de caracterização da PCR inclui a especificidade, o limite de detecção, a gama de linearidade e do limite de quantificação de qRT-PCR. Preparação e titulação do plasmídeo Encomendar plasmídeo comercial contendo o fragmento relevante do gene alvo DNA escolhido para o PCR (neste protocolo, os nucleótidos 2081-2381 de EHV-2 gene glicoproteína B, ver Tabela 1). Nota: Para limitar o risco de contaminação das vias aéreas com o ADN sintético, realizar diluições em série de plasmídeos sob um exaustor num quarto separado e trabalhar com ADN diluído durante todas as etapas do desenvolvimento e procedimento de validação. Re-suspender o plasmídeo com água ultrapura para preparar uma solução de reserva a 50 ng / ml. Agitar em vórtice e centrifugação brevemente a solução estoque do plasmídeo. Nota: Determinar a concentração real do sto plasmídeoCK solução após a re-suspensão de modo a calcular o número de cópias do plasmídeo. Adicionar 1 ml de plasmídeo para o espectrofotómetro. Leia a densidade óptica (OD) a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Regista-se a concentração de ADN no software espectrofotómetro (OD, 260 nm). Calcular o número de cópias do plasmídeo usando o número de Avogadro (N A) e a fórmula: Número de cópias / mL = (N A [plasmídeo em ng / mL]) / (comprimento plasmídeo x 10 9 x peso médio de um par de bases) = (6.022 x 10 23 x [plasmídeo]) / (comprimento plasmídeo x 10 9 x 660) Testando a especificidade (Inclusão e exclusividade) de qRT-PCR Teste a inclusão do sistema de PCR. Amostras de DNA positivos Select 2 EHV-, previamente caracterizados por sequenciamento (estabelecido estatuto positivo). Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. analisar odados de PCR para cada amostra como descrito na seção 2.5. Verifique a presença de uma curva exponencial para todas as amostras escolhidas na secção 4.2.1 e confirmar a inclusão de RCP. Teste a exclusividade do sistema de PCR utilizando extractos de ADN de agentes patogénicos com semelhanças genéticas para o alvo (neste caso, outros herpesvírus equid tais como EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 e asinino herpesvírus-5 tal como descrito na Tabela 2) e outros agentes patogénicos envolvidos em doenças respiratórias do anfitrião (neste caso, o vírus da arterite equina, vírus da influenza equina, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus e Klebsiella pneumoniae, ver Tabela 2). Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Analisar os dados de PCR para cada amostra como descrito na seção 2.5. Entrada para a ausência de uma curva exponencial para todas as amostras escolhidas deseção 4.2.4 para confirmar a exclusividade do PCR. Limite de Detecção de qRT-PCR Dispensar 90 l de água ultrapura para 6 tubos. Realizar 6 dez diluições em série do plasmídeo para atingir a zona de redução (perda de detecção Ct). Transferir 10 uL do plasmídeo de diluição de trabalho ao tubo com 90 ul de água ultrapura. Vortex e centrifugar brevemente o tubo. Repetir o passo 4.3.2 até o último tubo em a diluição em série recebeu o plasmídeo. Realizar a amplificação dos 6 diluições em série de dez vezes do plasmídeo, tal como descrito na secção 2. Determinar a zona de redução: a zona compreendida entre a última diluição de plasmídeo que apresenta um sinal positivo e a primeira diluição sem detecção (ver Figura 2). Para iniciar os 6 diluições em série de duas vezes, escolha a última diluição de plasmídeo que dá um sinal positivo (ver secção 4.3.4). Nota: Execute 3 tri independenteals para determinar o limite de detecção de qRT-PCR (LOD 95% de PCR) Dispensar 25 l de água ultrapura para 6 tubos. Realizar 6 duplas diluições em série do plasmídeo. Transferir 25 uL da diluição de trabalho de plasmídeo, tal como determinado na secção 4.3.5, para o tubo com 25 ul de água ultrapura. Vortex e centrifugar brevemente o tubo. Repetir o passo 4.3.7 até o último tubo em a diluição em série recebeu o plasmídeo. Realizar a amplificação dos 6 diluições em série de duas vezes do plasmídeo, tal como descrito na secção 2. Repetir os passos 4.3.7 4.3.8 para duas vezes, para se obter 3 ensaios com 8 repetições (24 réplicas) de cada um dos dez vezes seis diluições em série do plasmídeo. Nota: O limite de detecção de qRT-PCR (PCR LOD 95%) é definida como o mais baixo número de cópias de ADN por unidade de volume que é detectado em 95% dos casos. Calcule o número de repetições positivas de 24 repetições para cada nível da Concentra plasmídeoção. Determinar a LD 95% de PCR. O LOD 95% de PCR é o nível que resulta na detecção de 23 repetições positivos de 24 repetições. Linearidade Gama e limite de quantificação de qRT-PCR Nota: Realizar ensaios independentes com 4 6 diluições em série de dez vezes do plasmídeo para assegurar que a concentração mais baixa utilizada no intervalo corresponde ao LOD 95% de PCR previamente determinada ao 4.3.10. Dispensar 45 l de água ultrapura em 6 tubos. Inicie o 6 diluições em série de dez vezes com a concentração de plasmídeo diluição de trabalho que corresponde a 10% 95 7 LOD de PCR. Realizar 6 dez diluições em série do plasmídeo. Transferência de 5 ul da diluição de trabalho plasmídeo (determinado na secção 4.4.2) para o tubo com 45 ul de água ultrapura. Vortex e centrifugar brevemente o tubo. Repita o passo 4.4.3 até o último tubo na diluição em série recebeu plasmid. Amplificar a 6 dez diluições em série do plasmídeo, tal como descrito na secção 2. Traçar a regressão linear y = ax + b com um para a inclinação e b para a intercepção (Figura 3). Calcula-se a eficiência de amplificação (E) a partir do declive de uma curva padrão (ver 4.4.5) usando a equação: . Repita os passos 4.4.1 a 4.4.6 três vezes. Nota: a eficiência da amplificação representa a quantidade de aumento de produto de PCR após cada ciclo. Uma reação ideal atinge eficiência próxima de 100%. Na prática, E (%) foi entre 75% e 125%. E superior pode indicar a amplificação de produtos não específicos ou a erros de pipetagem na diluição em série. Lower E também pode indicar um erro de pipetagem na diluição de série, desenho de primers pobres ou condições de reação não-ideais. Calcule o viés (Tabela3). Verificar para cada nível de plasmídeo que o valor absoluto de polarização é menor do que o valor crítico de polarização (0,25 log10). Determinar o enviesamento significativo e as incertezas linearidade (L lini) para cada nível de plasmídeo (Tabela 3) para avaliar o desempenho de regressão linear para EHV-2 qPCR (Figura 4). L lini é a incerteza linearidade determinada para cada i plasmídeo nível calculado do desvio padrão (SD'i) e média de viés. Determinar a incerteza linearidade combinada (L LIN) de EHV-2 qPCR dada pela seguinte fórmula: Nota: A aceitação de polarização é especificado pelo laboratório (em viés absoluto geral de 0,25 log 10) e correspondem à diferença entre o valor mais baixo e o valor mais alto de 0,5 log 10 (quantidade medida em log 10 do número de cópias). U LIN </sub> valor poderia ajudar a comparar o desempenho de qPCR de diferentes laboratórios. Determinar o limite de quantificação da qRT-PCR (PCR LOQ): LOQ PCR é a concentração mais baixa, com uma polarização de 0,25 log 10 utilizado para o intervalo de linearidade (Tabela 3). 5. Caracterização de todo o método analítico (de DNA Extraction ao Resultado qRT-PCR) Nota: A caracterização de todo o método é a validação de todos os passos necessários para obter dados qRT-PCR (ou seja, desde a extração de DNA a partir da amostra respiratória (ver secção 1) para a amplificação e quantificação do alvo (ver secção 2 )). Estabelecer uma correspondência entre o número de cópias na reacção de PCR e o número de cópias presentes na amostra biológica com a fórmula: . o <img alt="5,1-2" src="/files/ftp_upload/53672/5.1-2.jpg" /> É o número de cópias do plasmídeo na reacção de PCR, é o volume da amostra adicionada à mistura de PCR para a amplificação, é o volume de tampão de AVE usado para eluir os ácidos nucleicos e é o volume da amostra extraída. Testar a sensibilidade e especificidade de todo o método analítico Nota: As amostras Apenas conhecidos EHV-2 positivas (ou negativas) são usados ​​nesta seção. Teste a "sensibilidade" do método de qRT-PCR por análise de amostras positivas para o alvo (EHV-2). Amostras de DNA positivos Select 2 EHV-, previamente caracterizados (status positivo). Extrair o ácido nucleico como descrito na seção 1. Execute um procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Determinar o número de positivos reais (amostras positivasque são positivas com este RT-PCR) e o número de falsos negativos (conhecido amostras positivas que são negativas com este RT-PCR). Teste a "especificidade" do método de qRT-PCR por análise das amostras negativas Amostras de DNA negativos Select 2 EHV-(status negativo). Extrair o ácido nucleico como descrito na seção 1. Execute um procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Determinar o número de negativos reais (amostras negativas que são conhecidos como sendo negativo com este RT-PCR) e o número de falsos positivos (amostras negativas conhecidas que são positivas com este RT-PCR). Calcule a "sensibilidade diagnóstica" (Se) e "especificidade diagnóstica" (Sp) de todo o método (Tabela 4) da seguinte forma: Se = número de positivos reais / (número de positivos reais + falsos negativos) e Sp = número de bens negativos / (número de real negativoS + falsos positivos) (ver Tabela 4). Calcular o intervalo de confiança de 95% para a sensibilidade e especificidade de todo o método com a fórmula de Greiner e Gardner relação 12,20: onde e é o erro estimado, θ é o Se (ou Sp) e n o número de amostras analisadas. Nota: Para um pequeno número de amostras, utilizar a tabela de Schwartz de acordo com a norma AFNOR 12 para calcular o intervalo de confiança de 95% para a sensibilidade e especificidade de todo o método. Preparação de Negative recurso material para a caracterização de todo o método analítico CUIDADO: Para determinar os limites de detecção e de quantificação de todo o método (Método LOD e o Método LOQ), adicionar concentrações conhecidas de plasmídeo para as amostras biológicas que são conhecidos por serem livresdo alvo (EHV-2 neste caso). Estas amostras, juntamente com o plasmídeo quantificada, constituem normas positivas com que para determinar o método LOD eo Método LOQ. Confirmar a ausência de alvo (EHV-2) nas amostras biológicas utilizadas para construir padrões positivos. Escolha diferentes amostras biológicas negativos conhecidos. Extrair amostras biológicas como descrito na seção 1. Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Confirmar a ausência de alvo pela ausência de sinal de PCR nestas amostras. Nota: Use o mesmo material de recurso negativo para todas as etapas entre 5,4 e 5,5. Reúnem-se os diferentes amostras negativas para se obter 15 ml de material de recurso negativo (o volume necessário para a validação completo). Dispense 135 ul deste material recurso negativo em 100 tubos. Manter tubos a 4 ° C ou a -80 ° C para armazenamento a longo. Limit de Detecção de todo o método analítico Determinar a zona de redução de todo o método. Dispensar 45 l de água ultrapura em 6 tubos. Realizar 6 dez diluições em série do plasmídeo. Transferência de 5 ul da diluição de trabalho plasmídeo correspondente a 10 7% LOD 95 de PCR (como determinado na secção 4.3.10) para o tubo com 45 ul de água ultrapura. Vortex e centrifugar brevemente o tubo. Repita o passo 5.4.1.2 até o último tubo na diluição em série recebeu plasmídeo. Transferência de 5 ul de cada diluição de plasmídeo para 2 tubos com 135 uL de o material de recursos negativo para obter 2 6 réplicas para a padrões positivos. Agitar em vórtice e centrifugação brevemente. Realizar a extração dos 2 repetições para os 6 padrões positivos como descrito na seção 1. Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Determinar a zona de redução: a zona compreendida entre o último concentration do plasmídeo dando um sinal positivo e a primeira concentração que mostra nenhum sinal. Limite de Detecção do Método (Method LOD) Determinado por 2 Trials Independentes Nota: Efectuar 2 ensaios independentes para determinar o limite de detecção de todo o método (Método LOD). Inicie o 6 diluições em série de duas vezes com a diluição de trabalho de plasmídeo que é 4 vezes mais concentrada que a última concentração do plasmídeo que deu um sinal positivo (ver secção 5.4.1.5). Dispensar 25 l de água ultrapura em 6 tubos. Realizar 5 duplas diluições em série do plasmídeo. Transferir 25 uL da diluição de plasmídeo de trabalho (como determinado na secção 5.4.2.1) para o tubo com 25 ul de água ultrapura. Vortex e centrifugar brevemente o tubo. Repita o passo 5.4.2.3 até o último tubo na diluição em série recebeu plasmídeo. Transferência de 5 ul de cada diluição de plasmid para 4 tubos com 135 ul do material de recurso negativo para obter 4 repetições dos 5 padrões positivos. Vortex e brevemente centrifugar os tubos. Realizar a extração dos 4 repetições para os 5 padrões positivos como descrito na seção 1. Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Repita os passos 5.4.2.1 a 5.4.2.5 uma vez para obter 8 repetições para cada nível de concentração plasmídeo. Contar o número de repetições positivas de 8 repetições para cada nível de concentração plasmídeo. Determine o método LOD. O Método LOD é o último nível a que replica 8 de 8 repetições são positivas (como descrito na secção 5.4.2.7). Linearidade Gama e limite de quantificação de todo o método analítico Nota: Para determinar o limite de quantificação de todo o método (Método LOQ), adicionar concentrações conhecidas do plasmídeo para biológicaAs amostras que são conhecidos por estar livre do alvo (EHV-2 neste caso). Estas amostras constituem padrões positivos para determinar o método LOQ. Dispensar 45 l de água ultrapura em 6 tubos. Realizar 6 dez diluições em série do plasmídeo. Transferência de 5 ul da diluição de trabalho plasmídeo correspondente a 10 7 Método LOD (como determinado na secção 5.4.2.8), para o tubo com 45 ul de água ultrapura. Vortex e centrifugar brevemente o tubo. Repetir o passo 5.5.2 até o último tubo em a diluição em série recebeu o plasmídeo. Transferência de 5 ul de cada diluição de plasmídeo para 2 tubos com 135 uL de material de recurso biológico negativo para se obter 2 replicados dos padrões 6 positivos. Agitar em vórtice e centrifugação brevemente. Realizar a extração dos 2 repetições para os 6 padrões positivos como descrito na seção 1. Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Repita os passos 5.5.15.5.4 a três vezes. Definir um perfil de precisão, para a avaliar e validar o desempenho quantitativo do método. Definir os limites de aceitabilidade de todo o método para o laboratório. Neste protocolo, os limites de aceitabilidade são definidos como ± 0,75 Log 10 pela Labeo Frank Duncombe. Para um ensaio, um primeiro rastreio de regressão linear y = ax + b (a é o declive e b é a intercepção) com uma réplica dos valores Ct corresponde a cada valor estimado da curva padrão. Com esta primeira regressão linear, calcular o valor experimental do número de cópias para as repetições de valores de Ct utilizados para esta primeira curva padrão. Repetir o passo 5.5.5.2 com a segunda repetições de valores de Ct obtidos para uma segunda regressão linear e calcular o valor experimental do número de cópias para a segunda repetições de valores de Ct utilizados para a segunda curva padrão. <li> Repita o passo 5.5.5.2, com o segundo e terceiro ensaios. Calcular os limites de precisão, rigor e precisão para cada nível plasmídeo de acordo com a NF U47-600-2 12. Crie uma planilha para compilar as informações para todos os pontos padrão (5.5.5.4) e criar um perfil de precisão com os limites de aceitabilidade previamente definidos em 5.5.5.1 e a veracidade dos dados juntamente com o menor e os limites de precisão superiores, como calculada em 5.5 .5.4 (Figura 5). Determinar o Método LOQ: esta corresponde à concentração mais baixa de uma curva padrão com exactidão de 0,75 log 10 tal como utilizado para o intervalo de linearidade calculado em 5.5.5.5. Avaliação da repetibilidade e reprodutibilidade Nota: Verifique a repetibilidade e reprodutibilidade através do rácio entre o desvio padrão ea média de medições repetidas (coeficiente de variação, ou CV = desvio padrão /significar). Avaliar a repetibilidade do Método todo por 1 Analista: Escolha 3 amostras biológicas com 3 cargas genoma viral distintas (previamente testados por PCR em, por exemplo). Extraia 8 repetições das 3 amostras conforme descrito no capítulo 1. Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Calcule a média eo desvio padrão do valor Ct coletadas para cada amostra. Calcular o CV intra-ensaio utilizando a fórmula CV = desvio padrão / média. Avaliar a reprodutibilidade do método inteiro por 3 Analistas: Escolha 3 amostras biológicas com 3 cargas genoma viral distintas (previamente testados em PCR, por exemplo) Extraia 2 repetições de 3 amostras escolhidas em 5.6.2.1 (como descrito na seção 1). Execute o procedimento de amplificação como descrito na seção 2. Repita os passos 5.6.2.2 por 2 analistas independentes. Calcule a média eo desvio padrãodo valor de Ct para cada amostra recolhida. Calcule a inter-ensaio utilizando a fórmula CV = desvio padrão / média.

Representative Results

O método de RT-PCR quantitativa, como descrito acima, foi aplicado para detectar e quantificar herpesvírus-2 equídeo em fluidos respiratórios. A Figura 1 ilustra um gráfico de fluxo esquemático para o desenvolvimento e validação de um método de RT-PCR quantitativo de acordo com a norma AFNOR NF U47-600. A especificidade dos iniciadores e sondas foram validados durante o desenvolvimento passo-a-passo do PCR. Apenas EHV-2 estirpes foram amplificadas neste sistema. Subsequentemente, o desempenho do qRT-PCR teve de ser caracterizada. Em primeiro lugar, para estimar a LOD de PCR, uma diluição em série de dez vezes 6 foi realizada para estabelecer a zona de redução (Figura 2). Neste exemplo, foram feitas 6 diluições em série de dez vezes entre 10 e 10 -5 -10 (entre 26.000 e 0,26 de cópias / 2,5 uL de amostra) para estimar o LOD de PCR. A zona de redução ls entre diluições de 10 -9 e -10 10 (entre 2,6 e 0,26 de cópias / 2,5 uL de amostra). Para determinar o valor de LOD de PCR neste caso, 6 diluições em série de duas vezes do plasmídeo foram feitas nessa zona de redução entre 5,2 e 0,16 de cópias / 2,5 ul de amostra. O valor de LOD de PCR foi de 2,6 cópias / 2,5 ul de amostra. Para determinar a gama de linearidade e LOQ PCR, o valor de LOD de PCR foi utilizado para iniciar o intervalo de 6 diluições em série de dez vezes, entre 2,6 (LOD PCR) e 260.000 cópias / 2,5 amostra ul. A Figura 3 ilustra uma regressão linear para o EHV2 qRT-PCR a partir de um ensaio. Os desempenhos de regressão linear (Figura 4) são validados em quadruplicado utilizando os cálculos descritos na Tabela 3. Os cálculos são realizados para definir o intervalo de linearidade de acordo com os critérios de polarização absoluto i value ≤0.25 log 10, seja qual for o nível i de carga plasmídeo. Neste caso, a gama de linearidade estabelecer entre 2,6 e 260000 cópias / 2,5 ul de amostra. O LOQ PCR é a mais baixa concentração na gama de linearidade (isto é, 2,6 cópias / 2,5 ul de amostra, neste caso). LIN L foi determinado ser de 0,12 log 10 no intervalo 2.6-260,000 cópias / 2,5 ul de ADN. Após o desenvolvimento (Figura 1, azul) e da caracterização de qRT-PCR (Figura 1, amarelo), a norma AFNOR NF U47-600 recomenda caracterização de todo o método analítico de extracção de ADN de qRT-PCR (Figura 1, laranja). A sensibilidade e especificidade de diagnóstico foram calculados tal como descrito na Tabela 4. Os desempenhos quantitativos do método analítico toda qRT-PCR foi avaliada e validado com um perfil de precisão ( <strong> Figura 5). Este protocolo, que usa a tecnologia molecular state-of-the-art, permitiu-nos para detectar e quantificar a carga viral genoma EHV-2 em 172 amostras de swab nasal obtidos a partir de cavalos com doenças respiratórias e / ou suspeita clínica de infecção. A incidência de EHV-2 a partir de campo amostras (biológicas) foi de 50% (86/172) na população estudada. As análises quantitativas mostraram que cargas genoma viral de EHV-2 foram significativamente maiores em cavalos jovens ea repartição de cargas genoma viral diminuiu com a idade (Figura 6). No presente estudo, detectou-se a mais elevada carga de EHV-2 genoma viral (1,9 x 10 11 cópias / ml) em potros (Figura 6). Figura 1: Gráfico de fluxo de trabalho para o desenvolvimento (azul), a caracterização do RT-PCR quantitativo(amarelo) e a caracterização de todo o método analítico de extracção de ADN de qRT-PCR (laranja) de acordo com a norma AFNOR NF U47-600-2. O gráfico de fluxo de trabalho retoma as diferentes etapas de desenvolvimento, a caracterização da TR quantitativa -PCR e a caracterização de todo o método analítico de extracção de ADN de qRT-PCR. Para cada etapa, o gráfico de fluxo de trabalho indica o número de execuções necessários, diluições a ser executar e o número de analistas necessários. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Determinação da zona de redução com resultados representativos a partir de curvas de PCR em tempo real obtidos com 6 diluições em série de dez vezes do plasmídeo. Para estimar a zona de redução, série 6 dez vezesdiluições são feitas entre 10 -5 (26.000 cópias / 2,5 ul da amostra e 10) -10 (0,26 cópias / 2,5 uL de amostra). A zona de redução situa-se entre diluições de 10 -9 (2,6 cópias / 2,5 ul da amostra e 10) -10 (0,26 cópias / 2,5 uL de amostra). Neste caso, 6 diluições em série de duas vezes de plasmídeo foram feitas nesta zona de redução para determinar o LOD 95% PCR, entre 5,2 e 0,16 cópias / 2,5 mL da amostra. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3:. A regressão linear para EHV2 qRT-PCR A linearidade do ensaio quantitativo é a capacidade para gerar resultados que são proporcionais à concentração do alvo presente num intervalo específico. Isto pode ser modelada pelaregressão linear (y = ax + b) entre a (limiar Ciclo ou Ct) resposta instrumental eo logaritmo da quantidade do alvo (número de cópias alvo / 2,5 amostra ul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura . Figura 4:. Desempenho de regressão linear de EHV-2 qPCR média polarização representam a média da diferença entre a quantidade medida de plasmídeo ( ) E a quantidade de plasmídeo teórico (X 'i) para cada nível de plasmídeo. As barras verticais representam a incerteza linearidade (L lini) dada pela fórmula onde SD'i é o desvio padrão o f quantidade plasmídeo medida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5:. Perfis de precisão com base nos resultados de validação do método EHV-2 qRT-PCR A linha verde (círculos) representa a veracidade dos dados (erro sistemático, ou preconceito). Os limites de aceitabilidade são definidos em ± 0,75 log 10 pelo laboratório (linhas tracejadas). Os limites de precisão inferiores e superiores a foram determinadas para cada nível de carga plasmídeo a partir do viés significa ± duas vezes o desvio padrão dos dados de confiança (linhas vermelhas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 1 "> Figura 6:. Quantificação de cargas genoma viral de EHV-2 de acordo com a idade A distribuição da carga viral genoma de EHV-2 detectados em amostras de swab nasal é representado para os diferentes grupos etários. As linhas horizontais representam os valores médios dentro do desvio padrão (m = meses). * Significativamente diferente por ANOVA com o teste post-hoc de Newman-Keuls (p <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. gene alvo Primers, sequências de sondas e plasmide (5'-3 ') posição de nucleótido Tamanho do produto (nucleotídeos) <strong> condições de ciclos térmicos Referências EHV2 gB (HQ247755.1) Forward: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-2130 78 95 ° C 5 min 11 Reverso: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA 2189-2170 95 ° C 15 seg 45 ciclos Sonda: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB 2132-2157 60 ° C 1 min plasmídeo: ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG 2081-2381 Tabela 1:. Sequências de iniciadores, sondas e controles de DNA sintético positivos utilizados neste protocolo A sequência de plasmídeo (DNA sintético positivo) corresponde ao nucleótido posições 2081-2381 da sequência EHV2gB (HQ247755.1). A concepção de iniciadores e sondas utilizadas neste protocolo foi obtido através de software específico. PATÓGENOS De referência (origem) Número de estirpes RESULTADOS EHV-2 EHV-2 VR701 (ATCC) <td rowpalmo = "2"> 20 Positivo 20 amostras (coleta FDL) EHV-5 KD05 (Gerc) 20 Negativo 20 amostras (coleta FDL) EHV-3 VR352 (ATCC) 2 Negativo T934 WSV (Gerc) EHV-1 estirpe Kentucky Ky A (ATCC) 3 Negativo 2 amostras (coleta FDL) EHV-4 VR2230 (ATCC) 1 Negativo Asinine herpesvírus AHV5 Coleção FDL 1 Negativo equinovírus influenza A / equino / Jouars / 4/2006 (H3N8) 1 Negativo (Número de acesso JX091752) Equine Virus Arterite VR796 (ATCC) 2 Negativo Rhodococcus equi Coleção FDL 1 Negativo Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Coleção FDL 1 Negativo Streptococcus equi subsp. equi Coleção FDL 1 Negativo burnetii Coxiella ADI-142-100 (Adiagene) 1 Negativo Chlamydophila abortus ADI-211-50 (Adiagene) 1 Negativo Klebsiella pneumoniae Coleção FDL 1 Negativo Tabela 2: Especificidade analítica de qRT-PCR para EHV-2. Tabela 3: Cálculo do preconceito e linearidade incerteza (adaptado de NF U47-600-2 12). Para cada ensaio, os desempenhos de regressão linear (y = ax + b) são validados utilizando a tabela onde y é o limiar de ciclo obtido; a é o declive obtido;. X é o nível de plasmídeo e b é a intercepção i é o plasmídeo nível (i varia de 1 a k níveis); k é o número de níveis de plasmídeo utilizado (por exemplo, K = T 6 emsua tabela); j é o ensaio (j varia de 1 a ensaios I); I é o número de ensaios, compreendido entre 3 e 6 ensaios (por exemplo, I = 4 nesta tabela) x i é a quantidade de plasmídeo estimado para cada. i plasmídeo nível. x 'i é a quantidade teórica plasmídeo obtido com a equação x' i = log 10 (x i) para cada i plasmídeo nível. Durante cada ensaio, J, o ciclo limiar obtido para cada i nível plasmídeo é calculada com a regressão linear y i, j = a j X i, j + j b. representa a quantidade de plasmídeo medida durante o ensaio de j. i polarização </sub> é a diferença observada entre a quantidade medida de plasmídeo e a quantidade teórica de plasmídeo para cada ensaio e cada nível de plasmídeo. é o valor médio de por cada i plasmídeo nível; SD 'i é o desvio padrão do valor medido para cada i nível plasmídeo; bias Média é a média de Bias i; U Lini é a incerteza linearidade determinado para cada i plasmídeo nível calculado a partir SD'i e viés dizer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 1 "fo: manter-together.within-page =" 1 "fo: manter-com-next.within-page =" always "> estatuto real da amostra Positivo Negativo Os resultados obtidos com o método de toda Positivo RP (real positivo) FP (falso positivo) Negativo FN (falso negativo) RN (real negativo) Total RP + FN FP + RN Se = RP / (RP + FN) Sp = RN / (RN + FP) Tabela 4:. Cálculo de sensibilidade de diagnóstico (Se) e especificidade (Sp) de todo o método Uma tabela Schwartz foi usada para calcular a confidintervalo cia a 95% de sensibilidade e especificidade de todo o método, tal como descrito na norma NF U47-600-2.

Discussion

Desde a década de 2000, PCR em tempo real tem vindo a substituir as técnicas padrão ouro (cultura de células e métodos de cultura de bactérias) em um número crescente de laboratórios. Implementação da técnica é relativamente fácil. No entanto validação de métodos laboratoriais é essencial para a detecção molecular e quantificação de patógenos para garantir dados precisos, repetíveis e confiáveis.

Uma vez que o passo de extracção é a principal fonte de perda de material biológico, que pode ser considerada como a principal fonte de erros de quantificação entre um e outro protocolo. Como tal, a criação de uma curva padrão de DNA do plasmídeo durante qRT-PCR, relataram principalmente na literatura, indica a carga do genoma virai, mas não tem em conta o passo de extracção.

Descrição de uma estratégia de novo para um processo de validação do método inteiro na norma AFNOR NF U47-600-2 representa um progresso significativo nesta área. Como ilustrado naeste papel para EHV-2 em cavalos, ou por outros em abelhas 21, isso exige clara diferenciação entre a etapa de desenvolvimento e a etapa de validação com a caracterização da PCR e caracterização de todo o método. Uma limitação desta abordagem interessante é que qualquer alteração no protocolo irá resultar na obrigação de revalidação o processo completo que poderia ser muito dispendiosa. Esta limitação também foi evidenciada pelo facto de os limites de quantificação dependem da fonte a partir do qual o vírus é extraída (por exemplo, fluidos respiratórios, órgãos, sangue ou urina). Na verdade, cada matriz apresenta especificidades diferentes nas suas características físico-químicas, e é importante para definir de forma independente cada matriz diferente utilizado para a detecção e quantificação viral por qRT-PCR. Assim, a carga genoma virai de cada amostra biológica pode ser quantificada de forma mais precisa a partir da extracção. A caracterização também leva em conta o mod termocicladorel e, quando o uso de um método previamente bem caracterizado (por exemplo, o método 2 de EHV-qPCR descrito no presente documento) necessita de um novo tipo de máquina no laboratório dos pais ou outro laboratório, deve-se confirmar o desempenho desse instrumento. A confirmação do desempenho de um ensaio de qPCR é um pré-requisito para todos os testes pôr em laboratório. Isto é normalmente conseguido através da análise de uma amostra de referência, com propriedades conhecidas. Tal verificação é um pré-requisito e considerada obrigatória, conforme solicitado pela norma NF 47-600-1 AFNOR, a fim de validar o desempenho do (eficiência LOD, LOQ) qPCR e a robustez de todo o método (LOD, LOQ). Não só durante os passos de desenvolvimento e de caracterização mas também quando usados ​​em investigação ou para fins de diagnóstico, os factores de risco podem ser identificados e bem controlada para assegurar a padronização do protocolo. De particular preocupação é a formação de pessoal adequado, pessoal altamente qualificado, o controle dos consumíveis de qualidadeusadas e sua armazenagem, controle das condições ambientais imediatos e consciência das condições metrológicas que podem afetar o desempenho dos instrumentos científicos envolvidos no ensaio. O uso de amostras de referência para comparações interlaboratoriais também poderia ajudar a controlar as incertezas. Desta forma, a comparação de dados entre os laboratórios podem ser facilitadas. Na verdade, os testes de proficiência interlaboratoriais são essenciais para avaliar e confirmar a reprodutibilidade do método.

Virais resultados de carga genoma que são expressos em unidades internacionais (UI) da matriz biológica analisados ​​(IU: cópias / ml para fluidos ou cópias / g para os tecidos) são mais fáceis de usar, a fim de comparar os resultados entre diferentes laboratórios. Todos os resultados acima do LOQ são expressas em cópias / ml e um resultado LOD entre o LOQ e é tomada como um resultado positivo não-quantificável. Apresentando dados quantificacionais do genoma desta forma conforma mais precisamente para os process de análises (amplificação do genoma). De facto, em experiências de cultura de células, expressão de a carga viral por TCID50 (tecido infecciosa mediana da cultura de dose) está dependente da natureza das células e estirpes de vírus. Cada linha cepa possui sua cinética de infecção original e alguns vírus como EHV-2 pode demorar vários dias antes do primeiro efeito citopatogénico é aparente.

Em conclusão, este novo método de caracterização de qRT-PCR deverá facilitar a harmonização da apresentação e interpretação de dados entre laboratórios. Isto será muito útil para novas aplicações potenciais de qRT-PCR, no futuro, como o estabelecimento de um valor de cut-off para a declaração do estado da doença, em vez de apenas a presença ou ausência do agente patogénico.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.

Materials

AB-1900 natural color ABgene 96 well plate  Dutsher 16924
Adhesive film QPCR Absolute  Dutsher 16629 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
0.5 mL microtubes, skirted, caps Dutsher 039258
Ethanol 98% Sodipro SAF322941000
Primers Eurofins Custom order
Probe Life Technologies Custom order
Plasmid Eurofins Custom order
QIAamp  RNA viral Mini Kit
(containing: QIAamp Mini column, AVL  buffer,  AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) 		 Qiagen 52906 AVL buffer: pre-warm 5 min at 72°C
Sequencing by Sanger method Eurofins Custom order
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4364340
Tris-EDTA buffer solution Santa Cruz sc-296653A
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermoscientific ND-2000C
StepOnePlus Real-Time PCR systems Life Technologies 4376600 pre-warm 15 min 
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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, A. M., Quesnelle, Y. F., Fortier, G. D., Legrand, L. J., Pronost, S. L. Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids. J. Vis. Exp. (109), e53672, doi:10.3791/53672 (2016).
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