التنمية والتحقق من طريقة PCR الكمي لEquid الفيروسة-2 التشخيص في الجهاز التنفسي السوائل
Summary
Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.
Abstract
The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.
Introduction
وتشارك هربس-2 Equid (EHV-2) في متلازمة الجهاز التنفسي، مع المظاهر السريرية المحتملة مثل الإفرازات الأنفية، والتهاب البلعوم وتضخم الغدد الليمفاوية 1-3. ويشتبه في هذا الفيروس أيضا أن تترافق مع ضعف الأداء من الخيول، والتي قد تؤدي إلى تأثير اقتصادي كبير وسلبي على صناعة الخيل 2.
حتى الآن، كان معيار الذهب أشعة غاما ذات الجهد العالي (γ-EHV) الكشف عن طريقة زراعة الخلايا. كان إزعاج الأول من هذا الإجراء عدم وجود تمييز بين EHV-2 وغيرها من γ-EHV (على سبيل المثال، EHV-5). كان إزعاج الثاني على التطور البطيء لعملية الاعتلال الخلوي، والتي تأخذ 12-28 أيام إلى إظهار 4،5.
تطوير الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل التحقق من صحة وتطبيع (QRT-PCR) طريقة سيساعد على الكشف بسرعة الفيروس، للتمييز بين EHV-2 وEHV-5 ودراسة العلاقة بين الحمل الجينوم الفيروسي وذلك بفضل المرض إلى الجانب الكمي.
وقد وصفت تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لأول مرة في عام 1986 من قبل موليس 6 و هو على وشك أن تصبح المعيار الذهبي الجديد في معظم مجالات التشخيص البيولوجي (الإنسان والبيئة والطب البيطري). هذا الأسلوب الذي يعتمد على التضخيم من جزء من الجينوم من مسببات الأمراض، ويقدم العديد من المزايا: خصوصية وحساسية وسرعة. وعلاوة على ذلك، من مخاطر التلوث amplicon تراجع منذ ظهور QRT-PCR وضمان الجودة 7. ومع ذلك، فإن الاعتراف PCR كوسيلة من وسائل المعيار الذهبي الجديد استلزم أكثر من مجرد تحسين بيانات الأداء ولكن أيضا مظاهرة من السيطرة على خطوات التطوير والمصادقة على طريقة كله دون تدهور الأداء مع مرور الوقت.
الأدوات الجزيئية الأولى التي استخدمت للكشف عن EHV-2 كانت المرة جالتضخيم onsuming وتشارك غير محددة مع متداخل PCR تليها التسلسل 8. كانت الجينات المستهدفة للفيروسات الهربس حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) الحمض النووي بوليميريز والتعبئة والتغليف 9. ومع ذلك، متداخل PCR يعرض لمخاطر عالية من التلوث amplicons. ومنذ ذلك الحين، وقد تم تصميم الاختبارات PCR التقليدية لتضخيم انترلوكين مثل 10 الجين أو بروتين سكري الجين B، استعرض في عام 2009 (2). وفي الآونة الأخيرة، وقد وصفت خصائص PCR في الوقت الحقيقي لتقدير حجم EHV-2 10 لكن لم تتوفر بيانات بشأن المصادقة على طريقة كله بما في ذلك عملية الاستخراج.
في هذا البروتوكول، ووصف إجراءات التطوير والتحقق من صحة طريقة PCR الكمي للكشف وتقدير من EHV-2 الحمض النووي في سوائل الجهاز التنفسي الخيول وفقا للجمعية الفرنسية للتطبيع (AFNOR) المعيار NF U47-600 3،11،12، وهو الممثل الفرنسي فيلجنة تطبيع الدولية. تفاصيل هذه القاعدة "متطلبات وتوصيات لتنفيذ وتطوير والتحقق من صحة PCR البيطري في الحيوان أسلوب التحليل الصحة" 11،12، وفقا لNF EN ISO / CEI 17025، 2005 13 وOIE (المنظمة العالمية لصحة الحيوان) توصيات، ينطوي 2010 14 بروتوكول التحقق من صحة QRT-PCR EHV-2 إجراء ثلاثة أجزاء: (أ) تطوير فحص QRT-PCR، (ب) توصيف QRT-PCR فحص وحدها و (ج) توصيف للمجلس بكامل هيئته المنهج التحليلي (من استخراج الأحماض النووية من العينة البيولوجية لتحليل PCR).
توصيف فحص QRT-PCR والمنهج التحليلي كله يشمل تعريف حدود اثنين: الحد من الكشف (اللد) والحد من الكمي (LOQ). يمثل اللد 95٪ PCR أقل عدد من نسخ الحمض النووي لكل وحدة حجم التي يمكن الكشف عنها في 95٪ من جميع الاكاديميةوفاق. وLOQ 95٪ PCR يمثل أقل كمية النسخ الحمض النووي التي يمكن تحديدها مع الأخذ بعين الاعتبار عدم اليقين.
هذه الطريقة QRT-PCR يسمح للكشف الدقيق وتقدير السريع لEHV-2 في سوائل الجهاز التنفسي. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة في غيرها من المختبرات لضمان إجراءات موحدة والقالب العام لتطوير أخرى المقايسات QRT-PCR جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ 2000s في، تم في الوقت الحقيقي PCR لتحل محل تقنيات الذهب القياسية (زراعة الخلايا وأساليب ثقافة البكتيريا) في عدد متزايد من المختبرات. تنفيذ أسلوب سهل نسبيا. ومع ذلك التحقق من صحة أساليب المختبر ضروري للكشف الجزيئي وتقدير من مسببات الأمراض لضمان بيانات دقيقة وقابلة للتكرار وموثوق بها.
منذ الخطوة استخراج هي المصدر الرئيسي لفقدان المواد البيولوجية، فإنه يمكن اعتبار المصدر الرئيسي للخطأ الكمي بين بروتوكول واحد وآخر. على هذا النحو، وإنشاء منحنى مستوى DNA البلازميد خلال QRT-PCR، ذكرت أساسا في الأدب، ويشير إلى تحميل الجينوم الفيروسي ولكن لا يأخذ بعين الاعتبار خطوة الاستخراج.
وصف لدي نوفو استراتيجية لعملية التحقق من صحة الطريقة كاملة في القاعدة AFNOR NF U47-600-2 يمثل تقدما كبيرا في هذا المجال. كما هو موضح فيهذه الورقة لEHV-2 في الخيول، أو من قبل الآخرين في النحل 21، وهذا يتطلب تمايز واضح بين الخطوة التنمية وخطوة التحقق مع توصيف PCR وتوصيف طريقة كله. الحد واحد في هذا النهج المثير للاهتمام هو أن أي تغيير في البروتوكول سوف يؤدي إلى التزام إعادة تأكيد العملية الكاملة التي يمكن أن تكون مكلفة للغاية. وأبرز هذا القيد أيضا من حقيقة أن حدود الكمي تعتمد على المصدر الذي يستخرج فيروس (على سبيل المثال سوائل الجهاز التنفسي، وأجهزة، والدم أو البول). في الواقع، تقدم كل مصفوفة خصوصيات مختلفة في خصائصها الفيزيائية والكيمياء، وأنه من المهم أن تحدد بشكل مستقل كل مصفوفة المختلفة المستخدمة للكشف عن الفيروس وتقدير من قبل QRT-PCR. وهكذا، وتحميل الجينوم الفيروسي من كل عينة بيولوجية يمكن قياس أكثر دقة من استخراج. يأخذ التوصيف في الاعتبار أيضا وزارة الدفاع thermocyclerايل وعندما استخدام الأسلوب سابقا تتميز جيدا (على سبيل المثال، EHV-2 طريقة QPCR وصفها في هذه الورقة) يتطلب نوعا جديدا من جهاز في المختبر الوالدين أو مختبر آخر، لا بد من تأكيد أداء هذا الصك. تأكيد لأداء فحص QPCR هو شرط أساسي لجميع الاختبارات تجلب إلى المختبر. ويتحقق ذلك عادة عن طريق تحليل عينة مرجعية مع الخصائص المعروفة. مثل هذا الاختيار هو شرط أساسي ويعتبر إلزاميا على النحو المطلوب من قبل القاعدة NF 47-600-1 AFNOR من أجل التحقق من صحة أداء (كفاءة اللد، LOQ) QPCR ومتانة الأسلوب كله (اللد، LOQ). ليس فقط خلال خطوات التطوير وتوصيف ولكن أيضا عندما تستخدم في البحوث أو لأغراض التشخيص، عوامل الخطر يمكن تحديد وتسيطر عليها بشكل جيد لضمان توحيد البروتوكول. ومما يثير القلق بشكل خاص هو تدريب عدد كاف من الموظفين، الموظفين المؤهلين تأهيلا عاليا، ومراقبة جودة المواد الاستهلاكيةوتستخدم وتخزينها، والسيطرة على الظروف البيئية المباشرة والوعي الظروف المترولوجية التي قد تؤثر على أداء الأجهزة العلمية المعنية في الفحص. استخدام العينات المرجعية لإجراء المقارنات بين المختبرات يمكن أن يساعد أيضا في السيطرة على الشكوك. بهذه الطريقة، يمكن تسهيل مقارنة البيانات بين المختبرات. في الواقع، بين المختبرات اختبارات الكفاءة ضرورية لتقييم وتأكيد استنساخ الأسلوب.
الفيروسية نتائج الحمل الجينوم التي يتم التعبير عنها في وحدة دولية (IU) من مصفوفة البيولوجية تحليلها (وحدة دولية: نسخة / مل للسوائل أو نسخ / ز لأنسجة) هي أسهل للاستخدام من أجل مقارنة النتائج بين المختبرات المختلفة. يتم التعبير عن نتائج فوق LOQ عن نسخ / مل ونتيجة لذلك بين اللد وLOQ يؤخذ نتيجة إيجابية وغير قابلة للقياس الكمي. عرض البيانات quantificational من الجينوم بهذه الطريقة يتفق أكثر دقة لبروسسالصورة من التحليلات (التضخيم من الجينوم). في الواقع، في تجارب زراعة الخلايا، والتعبير عن الحمل الفيروسي بواسطة TCID 50 (الأنسجة متوسط ثقافة معدية جرعة) يعتمد على طبيعة الخلايا وسلالات الفيروس. كل سطر سلالة تمتلك فيها حركية عدوى فريدة من نوعها وبعض الفيروسات مثل EHV-2 يمكن أن يستغرق عدة أيام قبل أول تأثير ممرض للخلايا هو واضح.
في الختام، يجب أن هذا الأسلوب الجديد من توصيف QRT-PCR تسهيل المواءمة بين العرض وتفسير البيانات بين المختبرات. وسيكون هذا مفيدا جدا لتطبيقات جديدة محتملة من QRT-PCR في المستقبل مثل إنشاء قيمة قطع للإعلان على الحالة المرضية بدلا من مجرد وجود أو عدم وجود العوامل المسببة للأمراض.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.
Materials
| AB-1900 natural color ABgene 96 well plate | Dutsher | 16924 | |
| Adhesive film QPCR Absolute | Dutsher | 16629 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| 0.5 mL microtubes, skirted, caps | Dutsher | 039258 | |
| Ethanol 98% | Sodipro | SAF322941000 | |
| Primers | Eurofins | Custom order | |
| Probe | Life Technologies | Custom order | |
| Plasmid | Eurofins | Custom order | |
| QIAamp RNA viral Mini Kit (containing: QIAamp Mini column, AVL buffer, AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) |
Qiagen | 52906 | AVL buffer: pre-warm 5 min at 72°C |
| Sequencing by Sanger method | Eurofins | Custom order | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4364340 | |
| Tris-EDTA buffer solution | Santa Cruz | sc-296653A | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-2000C | |
| StepOnePlus Real-Time PCR systems | Life Technologies | 4376600 | pre-warm 15 min |
Riferimenti
- Brault, S. A., et al. The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness. Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).
- Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis. Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).
- Hue, E. S., et al. Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method. J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).
- Diallo, I. S., et al. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).
- Williams, K. J., et al. Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease. Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).
- EPA Office of Water (4607). . EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).
- Telford, E. A., et al. Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses. Virology. 195 (2), 492-499 (1993).
- Fortier, G., et al. Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007. Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).
- Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals. Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).
- Association Francaise de Normalisation. . NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).
- Association Francaise de Normalisation. . NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).
- ISO. . EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).
- . . Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , (2009).
- Apaza, S., et al. Detection and genogrouping of noroviruses from children’s stools by Taqman One-step RT-PCR. J Vis.Exp. (65), e3232 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis.Exp. (63), e3998 (2012).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- NCBI. . BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).
- Greiner, M., Gardner, I. A. Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies. Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).
- Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method. J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).
