허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석
Summary
Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.
Abstract
허혈성 뇌졸중은 혈관 구획에서 시작 뇌 상주 세포의 빠른 활성화를 포함하는 강력한 염증 반응을 시작합니다. 이 염증 반응의 핵심 메커니즘은 케모카인의 방출 증가 내피 세포 부착 분자의 발현에 의해 촉진 허혈성 뇌에 면역 세포를 순환의 이동이다. 뇌 – 침입 백혈구는 초기 단계의 보조 허혈 손상에 기여 잘 알려져 있지만, 염증과 이상 뇌 수리의 종료에 대한 자신의 중요성은 최근에 발견되었다.
여기서, 허혈성 뇌에서 마우스 면역 세포의 효과적인 분리를위한 간단한 프로토콜이 제공된다. transcardial 관류 후, 뇌 반구는 해부 및 기계적으로 분해된다. Liberase과 소화 효소는 미엘린 및 세포 파편을 제거 밀도 (예 퍼콜 등) 구배 원심 분리된다. 이 프로토콜 내가 하나의 큰 장점구배 시간 소모적 인 제조를 필요로하지 않으며, 확실하게 행할 수있다 단층 밀도 구배 방법이야. 접근법은 뇌 반구 당 재현성 세포 수를 산출 한 생물학적 복제 여러 유동 세포 계측법 패널 측정을 허용한다. 실험 뇌졸중 후 표현형 특성화 및 뇌 침입 백혈구의 정량은 허혈 손상 및 수리에서의 다각적 인 역할의 더 나은 이해에 기여할 수있다.
Introduction
뇌졸중은 빠르게 로컬 혈류 중단 이후에 시작하고 면역계의 거의 모든 부분을 포함 지속적인 염증 반응을 트리거한다. 이 염증 반응의 한 가지 중요한 특징은 뇌 내피 세포, 실질적 케모카인 분비의 활성화에 의해 구동 교감 유출 1-3 증가 뇌 면역 세포의 유입 시간 제한이다. 염증성 세포의 침윤이 이전에 허혈성 뇌졸중에 해로운 것으로 간주되었다, 그러나, 무차별 뇌에 백혈구 출구를 차단하기위한 여러 가지 치료 임상 시험은 측정 가능한 임상 적 혜택 4를 유도하는 데 실패했습니다. 최근에, 그것은 처음에 허혈성 손상 (5)의 진행에 관여하는 단핵구 유래 세포는 염증과 후속 조직 수리 (6)의 해결을 위해 중추적 인 역할을 할 수 있음을 분명하게되었다.
표현형과를 functi의 식별 덕분에단핵 세포와 대 식세포 사이도 그러 이질성은, 개발 및 염증의 해상도에서 단핵 식세포의 역할에 대한 지식이 크게 확장했다. 마우스에서, 순환하는 단핵 림프구 항원 6 착물 (LY-6C) (7)의 그 표면 발현에있어서, 적어도 두 개의 별개의 기능 집합으로 분류 될 수있다. LY-6C 높은 'inflammatory monocytes' 명확 세균 감염 (8)의 제어에 필수적인 것으로 나타 동안, 멸균 부상에서 그들의 역할은 논쟁이다. 허혈성 뇌졸중에서 CCR2 + LY-6C 높은 단핵 세포의 선택적 제거는 출혈성 경색 변환 6 결과. 그러나 동일한 실험 방법은 뇌내 출혈 (9) 후 급성 장애를 개선. 이와 유사하게, T 세포의 서브 세트는 다른 허혈성 뇌 손상에서 어느 열 해로운 또는 방호 조치 (11)을 발휘하는 것으로 생각된다, 그러나, 데이터이다 controversi등 12, 13 및 보증 추가 조사. 이 증가하는 복잡성을 감안할 때, 그것은 허혈 손상 및 수리에 다양한 면역 세포의 역할에 대한 깊은 지식이 게시물 스트로크 염증을 대상으로 치료에 실험 결과를 번역을위한 중요한 것을 분명해진다.
현재, 세포 면역 반응 분석을위한 가장 강력한 도구 다색 유동 세포 계측법이다. 그것은 편견에 필요한 생체 표지 또는 유전자 조작 (14)에 의해 시스템없이 염증의 사이트에 식별 및 다양한 면역 세포 하위 집합의 정량화 할 수 있습니다. 세포 내 사이토 카인 15 전사에 대한 항체와 세포 표면 마커의 동시 염색 (16)이 별도로 개인 식별 표현형 세포의 기능 상태에 관한 정보를 제공 인자. 하나의 큰 단점으로, 단일 세포 현탁액을 유세포 분석법 및 LOC 필요에 따라서 정보세포 침윤의 세계화가 손실됩니다. 조직학은 공간 정보를 얻기 위해 적합한 반면 그러나,이 특정 조직에서 면역 세포 아형의 특성을 한 번에 사용할 수있는 항체의 수에 의해 제한된다. 오늘날, 다양한 표면 마커의 유무의 조합이 명확 염증 17 중에 드문 면역 세포의 서브 세트, 특히 별개의 단핵구 – 유래 세포 집단을 식별하는 데 필요하다.
여기에서는 간단한 단층 밀도 구배를 사용하여 마우스의 뇌 허혈에서 높은 백혈구 수를 분리하기 위해 효율적인 프로토콜을 설명한다. 수득 된 세포 현탁액 중 세포 계측법 또는 상기 다차원 흐름에 의해 분석 될 수있는 매우 특이 하류 분석을 수행하는 유세포 분류 또는 면역 자기 선택에 의해 농축 될 수있다. 이 방법은 단일 세포 펜던트에 transcardial 관류, 뇌 반구의 제거, 뇌 조직의 분리 자세한 사항ensions, 유세포 분석 미엘린 제거 밀도 구배 원심 분리뿐만 아니라 항체 염색.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 실험 뇌졸중 후 쥐 뇌에서 백혈구의 분리를위한 간단하고 효과적인 방법을 설명한다. 접근 한 생물학적 확실 복제 상이한 흐름 패널을 측정 할 수 있도록 뇌 반구 당 재현성 세포 수를 산출한다.
명백하게, 혈액을 포함한 면역 세포의 불완전한 제거는 허혈성 뇌 입력 염증 세포의 실제 양에 대한 왜곡도 발생한다. 이 프로토콜을 사용하는 경우 즉, 비염증성 순환 백혈구 침투 면역 세포의 오염을 방지하기 위해 철저한 transcardial 관류에 특히주의. 경험에서, 좌심실 펑크에 대한 무딘 바늘의 사용은 전신 순환의 관류를 우회 할 심실 중격의 부상에 대한 위험을 줄일 수 있습니다. 콧 구멍에서 관류 액의 출현 관류 따라서, 너무 높은 pressureis 기호이며,보이드 유량> 10 ㎖ / 분. 분홍빛이 도는 색상이 좋지 관류의 표시 상태에서 뇌 조직의 화이트 색상에 창백한 좋은 관류를 나타냅니다.
이 프로토콜의 다른 중요한 단계는 기계적 분열뿐 아니라 소화 효소를 포함하는 뇌 조직을 효율적으로 분리된다. 셀 스트레이너를 통해 조직을 닦지하는 프로테아제의 개선 된 효능을 제공하기 위해 중요하다. 조직을 균질화 할 때 단핵 식세포가자가 분해 (22)에 매우 민감하지만, 과도한 압력을 피하십시오. 효소 소화 Liberase TL의 경우 중립 프로테아제 써모의 낮은 농도를 포함 고순도 콜라겐 I 및 II의 혼합물 인 것이 좋습니다. Liberase TL 처리 (KM 게시되지 않은 데이터)에 의해 실행 가능한 세포의 상당히 높은 복구를 밝혀 앞서 설명한 분리 프로토콜 14,22,23와 직접 비교. 콜라게나 제에 비해 자주 사용되는뇌에서 면역 세포의 분리를위한 d를, Liberase TL은 독소의 무시할 수준이 포함되어 있습니다. 독소의 높은 수준의 면역 세포 (24)의 작동 상태를 변경하고 심각한 세포 배양을 방해 할 수 있으므로 셀 (25)의 하류 성과 분석을 위해 정렬되는 경우에 특히 중요하다. 전통적인 콜라게나 제의 또 다른 단점 결과의 재현성을 위태롭게하고 각 로트 (26)의 작업 농도의 결정을 필요로하는 효소 활성에 중요한 로트의 차이입니다.
성인 뇌에서 밀도 구배 원심 분리에 의해 제거 미엘린은 유전자 또는 단백질 발현에 유동 세포 계측법 또는 추가 연구 다운 스트림 애플리케이션에 필수적인 단계이다. 프로토콜의 한 가지 중요한 장점은 구배 시간 소모적 인 제조를 필요로하지 않고 단일 층 밀도 절차이다. 또한, 분리 프로토콜은 신뢰할 수있는 결과를 생성오히려 경험 실험자에 의해 수행되는 경우에도에요. 이 사이에 인터페이스를 방해하지 않고 하나의 피펫하기 어려운 그 다른 가까운 밀도 층 그라디언트없는 것입니다.
표면 마커 CD45의 발현에 기초하여, 프로토콜은 허혈성 뇌 세포 세 가지 주요 카테고리를 산출한다. 세포의 대부분은 신경 세포, 별아교 세포, 뇌실막 및 내피 세포로 구성된 CD45 네가티브 인구에 속한다. 그들의 존재가 풍부한 주로 효율적 수초 나 이물질의 제거를 목표로 단층 밀도 구배에 기인한다. 또한, 주민 미세 아교 세포 (27)를 나타내는 CD45의 INT 인구는 주로 혈행 백혈구 침투가 포함 된 CD45 높은 인구 차별화 할 수 있습니다. 그러나, 활성화 된 미세 아교 세포는 혈액 태생 골수 세포의 표현형 및 기능을 채택 할 수 있음에 유의해야한다. 따라서, 만 적용 닳고 닳은28 parabiosis로 D 기술 등, 골수는 29 키메라 또는 운명 매핑 분석 (30)는 염증 동안 두 집단 사이에 명확한 구분을 할 수 있습니다.
유동 세포 계측법에서 데이터 분석은 종종 특정 세포 집단의 비율 분포로 제한된다. 비 경색 뇌 조직에 반구 경색 비교 때 허혈 손상에 의해 변경되는 전체 뇌 백혈구 수를 고려하지 않기 때문에,이 정보가 잘못 될 수있다. 면역 세포 하위 집합의 스트로크 상대 분포는 절대 세포 수에 의해 보완되어야한다 후에 따라서, 크기 및 염증성 침윤의 표현형에 대한 전체 그림을 그립니다. 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 마이크로 비드를 사용하는 경우, 정확한 샘플 부피 피펫은 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 절대적으로 필수적이다. 또한, 역 피펫 강하게 계산 튜브에 거품 형성을 방지하는 것이 좋습니다. 기포 발생마이크로 비드 예상 용적을 감소시키고, 따라서 샘플 절대 CD45 높은 백혈구의 과대 추정을 초래할 것이다.
요약하면,이 프로토콜은 뇌로부터 면역 세포를 분리하기 쉽고 신뢰성있는 방법을 제공한다. 또한 허혈성 뇌졸중에 염증성 반응의 복잡성을 해부 유용한 도구로서 작용할 수있다. 미래의 애플리케이션은 전파 및 허혈성 뇌 염증 해상도 단핵구 서브 세트의 시간에 따른 역할 조사를 포함한다. 마찬가지로, 뇌졸중 후 적응 면역 시스템의 역할을 제대로 이해된다. 장기 뇌졸중 후 회복과 새로운 치료 방법의 개발을위한 따라서 오픈 유망 도로에 미치는 영향을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다 현장에서 일부 특정 전사 인자 또는 사이토 카인의 발현에 의해 확인 된 T 세포 개체군의 세포 계측 분석 흐름.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 뛰어난 기술 지원 이사벨 슐츠 감사합니다.
Materials
| Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
| Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
| FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
| Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
| Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
| Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | use at room temperature |
| Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
| Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
| Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
| Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
| CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
| CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
| CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
| CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
| CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
| Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
| Silicone Tubing, 1m | World precision instruments | 503022 | |
| Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Straight 1×2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
| Cell strainer, 100µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
| Omnican Fine dosage syringe 1ML | Braun | TBD | |
| Cell strainer, 70µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
| FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
| serological pipettes, 10ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
| serological pipettes, 10ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
| serological pipettes, 25ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
| serological pipettes, 5ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
| serological pipettes,25ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
| serological pipettes,5ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
| Tips, 0,1-10µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
| Tips, 100-1000µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
| Tips, 10-200µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
| Reaction tubes 1,5ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
| Reaction tubes 2ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
| Bacteriological petri dish, 94x16mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
| Falcon 15ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
| Falcon 50ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
| Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
| razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |
Riferimenti
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