虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

全ての動物実験は、動物のケアのために応じて標準に準拠する必要があります（ 例えば 、米国国立衛生研究所、NIH公開番号85-23によって公開実験動物の管理と使用に関する指針は、1996年改訂）し、承認されなければなりません適切な状態当局による。 試薬の調製消化緩衝液（半球あたり1ミリリットル）：カルシウム（Ca）とマグネシウムを含むハンクス平衡塩溶液中でミリリットル2U /（HBSS）の濃度に低サーモリシン濃度（TL）と、例えば 、リベラーゼを精製した消化酵素の標準化された混合物を溶解マグネシウム（Mg） DNアーゼでの洗浄バッファーは：HBSSで666U / mlの濃度にDNアーゼIを溶解（カルシウム/マグネシウムを含まない）ウシ胎児血清を10％含む（FCS） DNアーゼのない洗浄緩衝液：HBSS（カルシウム/マグネシウムを含まない）10％のFCSを含みます密度勾配媒体（半球あたり5 ml）を：準備ストック等張密度勾配0;一部1.5 M塩化ナトリウムで密度勾配媒体九部を混合し、培地（100％SIP）。 FCSの3％を含有するHBSS（カルシウム/マグネシウムを含まない）の適切な量を添加することによって25％の密度にSIPを希釈フローサイトメトリー（FC）バッファ：FCSの3％を含有する準備リン酸緩衝生理食塩水（PBS） 2.一過中大脳動脈閉塞注：18の12週齢の雄のC57BL / 6マウスに、前述のように管腔内縫合技術を介して過渡中大脳動脈閉塞（MCAO）を行いました。 簡潔には、100％酸素中の2.0％イソフルランでマウスを麻酔。 36.5℃の体温を維持するフィードバック制御加熱装置により0.5℃、±。 総頸動脈と外頸動脈の結紮した後、中央のCの原点に総頸動脈、事前にそれを標準化されたシリコンゴムコーティングされたモノフィラメントを紹介erebral動脈。 45分後の再灌流を可能にするために、フィラメントを削除します。偽手術動物では、すぐに虚血を回避するために、中大脳動脈を閉塞した後、フィラメントを撤回。 3. Transcardial灌流および脳解剖氷冷HBSS（カルシウム/マグネシウムを含まない）にチューブの一端を浸漬することにより、蠕動灌流ポンプを準備します。灌流チューブの他端に鈍23 G針を修正し、完全にHBSS（カルシウム/マグネシウムを含まない）でチューブを埋めるためにポンプのスイッチを入れます。 深く4％イソフルランでマウスを麻酔し、CO 2吸入によって安楽死させます。 プラスチックトレイに埋め込まれた解剖ボード上でマウスの背側を置きます。スプレッドフォアとできるだけ広いと20 G針で解剖ボード上でそれらを修正後足。 ストレート1×2歯鉗子でつかみ、腹部の皮膚および外皮と腹壁を通して横切開を作り、公開するためにシャープアイリスはさみを使用肝。 胸骨を持ち上げて、シャープ/鈍いアイリスはさみの鈍い刃で振動板を切開。 caudocranial方向の両側に横方向胸郭をカットし続けます。肺、心臓および胸部動脈を傷つけないように注意してください。 鈍鉗子で皮膚弁を持ち上げて、解剖ボードにピン。慎重に結合組織から心臓を分離するために平滑末端鉗子とハサミを使用してください。 平滑末端鉗子で心を持ち、左心室の頂部に取り付けられた灌流チューブと鈍い23Gの針の先端を挿入します。注：心室中隔の損傷を避けるために、左心室にすぎ針を挿入しないでください。必要に応じて、ストレート鋭いピンセットで所定の位置にカニューレを固定します。 シャープアイリスはさみで右心房を切開し、直ちにポンプ（流量：8〜10ミリリットル/分）をオンにします。 肝臓は、光のコーヒー色（HBSSの〜30ミリリットル）を示すまで灌流を続けます。ずっと灌流は、慎重にチューブ内の任意の気泡の形成を避けます。 ちょうど頭蓋骨の後ろにまっすぐ手術用ハサミでマウスを刎ねます。頭蓋骨を露出するように頭皮の正中切開を作るために、虹彩のはさみを使用してください。 大後頭孔にシャープアイリスはさみ1先端を置き、頭蓋骨の中に横方向に切断しました。もう一方の側について、この手順を繰り返します。 慎重に鼻に向かって正中線まで同キャビティからカットするシャープアイリスはさみを使用してください。脳の損傷を避けるために、可能な限り表面的なはさみの終わりを保つようにしてください。 静かに各脳半球から頭蓋骨を剥離する微細な鉗子を使用してください。注：梗塞組織は髄膜や頭蓋骨に付着することがあります。無謀な解剖に脳組織を失わないように注意してくださいへらで脳を持ち上げ、慎重に頭蓋骨にそれを修正脳神経線維を分析するためにシャープアイリスはさみを使用しています。 HBSS（+のCa / Mg）を10mlで満たされた15ミリリットルチューブに脳を置き、それがね保ちますhortly氷の上。 単一細胞懸濁液への脳組織の4解離慎重にきれいなかみそりの刃で脳幹や小脳を削除します。脳を二等分するとほぼ同じ大きさの3枚に前頭面に沿って各半球を切断するためにきれいなカミソリの刃を使用してください。 ミンスは5ミリリットルの注射器のプランジャ端部を使用して、100μmのセルストレーナーを介して各半球の組織を解剖しました。連続して氷冷HBSS（+のCa / Mg）を持つセルストレーナーをすすぎます。氷上で均質化したサンプルを保管してください。 5分間286×gで4℃で遠心し、慎重に上清を捨てます。消化緩衝液1ml中にペレットを再懸濁し、2mlチューブに懸濁液を移します。 37℃で1時間ゆっくりと連続回転の下でサスペンションをインキュベートします。 70μmのセルストレーナーを介してふるい細胞懸濁液およびDNアーゼを含まない洗浄緩衝液15mlを、続いてのDNAseを含む洗浄緩衝液3mlでよくすすぎます。 286×gで遠心分離し、5分間18℃、上清を捨てます。注：注：DNアーゼの使用は、細胞の生存を危うくする細胞凝集につながる可能性がある細胞溶解に起因するDNAの粘液を排除します。 ミエリンおよび細胞破片の除去のための5密度勾配遠心 25％の密度勾配培地5ml中に再懸濁し、細胞ペレットを、15 mlチューブに懸濁液をピペット。バブルの形成を回避繰り返し、穏やかにピペッティングすることによって十分に混合します。注：密度勾配培地は、細胞凝集を防止するために室温で使用されるべきです。 521×gで遠心分離し、20分間、18°C。ロータの最低加速プロファイルを使用して、ローターがブレーキなしで停止することができます。静かに振盪せずに遠心分離機からチューブを外します。チューブの底に細胞ペレットを保存しながら注意深くミエリンコートし、上清を吸引します。注：残ったとして全体ミエリンコートを削除することを確認してくださいimpaiますRフローサイトメトリー分析。 DNアーゼフリーの洗浄緩衝液10mlにペレットを再懸濁し、新しい15mlチューブにサスペンションをピペット。注：密度勾配媒体の十分な除去が著しく最終細胞試料の量と質に寄与するので、この洗浄工程は、重要です。 遠心分離し、再び5分間、286×gで、10℃で、上清を捨てます。冷たい洗浄用緩衝液100μl中で細胞を再懸濁し、血球計数器で、トリパンブルー排除によって細胞数及び生存率を決定します。 4°C、さらにプロセスすぐにそれらで保存するサンプル。 フローサイトメトリー分析のための6抗体染色非特異的結合を防ぐために：抗体標識の前に、抗マウスCD16 / CD32 Fc受容体ブロッキング試薬10分（200を2.5μg/ mlの最終濃度は、希釈係数1）4℃で細胞懸濁液をインキュベートします。 Aの蛍光団共役一次抗体を追加します。ppropriate細胞懸濁液の濃度（ 表1に示されるように）、暗所で20分間、4℃でインキュベートします。注：対照試料は、一次抗体で染色し、それ以外は同じように扱われていません。 350×gでFCバッファと遠心機の2mlで細胞を洗浄し、7 min.Carefullyための10°Cは、FC緩衝液200μlで上清と再懸濁細胞ペレットを吸引。フローサイトメトリー分析まで暗所で一時的に4°Cで保存するサンプル。 カウントビーズ7.絶対定量逆に蛍光ビーズの既知数を含む計数管にFC緩衝液40μl及び10μlの細胞懸濁液をピペット。注：ピペットは、白血球数のその後の計算は、このボリュームを参照するように、試料の正確に10μLを提供するように較正されていることを注意してください。 FITC標識CD45抗体（最終濃度で細胞懸濁液をインキュベート暗所で20分間、4℃、100）：5μgの/ mlの、希釈係数1の。 逆に任意の洗浄工程なしでFC緩衝液200μlと計数管を記入し、直接、フローサイトメーターでCD45 +細胞を記録。 8.フローサイトメトリー取得注：提案された抗体のパネルを分析するために、適切なサイトメーターは、青（488 nm）を装備する必要があり、赤（635 nm）をFITC、PE、PerCPをCy5.5標識、PECy7のための紫外線（405 nm）のレーザーおよびフィルター、 APC-Cy7をとAmCyan。 虚血性半球から非染色細胞を用いて、前方（FSC）および側方（SSC）散乱を調整します。 FSCの面積と高さを示すドットプロットで単一細胞からのダブレットを区別する。 使用される各蛍光チャネルのための単一パラメータヒストグラム内のすべての単一のセルを表示し、光電子増倍管（PMT）単一の細胞がはるかにヒストグラムの左側に表示されるように電圧を調整します。 CD45-FITCシングルを使用してください各ヒストグラムや散布図でCD45 高免疫細胞をバックゲートすることにより目的の細胞のための散乱およびPMT設定を確認するためにサンプルを染色しました。注：CD45陰性、中間体（INT）ようにFITCのPMT電圧を適応し、高発現細胞を互いに区別することができます。 マルチカラー補正を実行するために、抗体捕捉され、補償ビーズを使用してください。ミクログリアのためのゲート（CD45 int型）および白血球（ 高 CD45）を設定し、続いて、図1に表示されたゲーティング戦略に従って白血球亜集団を定義します。