Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
Een beter begrip van signaalwegen vereist gedetailleerde kennis over de ligand-receptor interactie. De meeste werkwijzen voor het beoordelen van de interactie van een bepaalde ligand met zijn specifiek receptor zijn duur, tijdrovend, arbeidsintensief en vereist speciale uitrusting en deskundigheid 1.
In dit artikel worden twee snelle en betrouwbare punt-punt protocollen bij de ligand-receptor interactie op basis van een enzym onderzoeken linked immunosorbent assay (ELISA): de directe ligand-receptor interactie assay (LRA) en de concurrentie LRA. ELISA is een zeer gevoelig, specifiek en gemakkelijk beschikbare techniek routinematig gebruikt in bijna elk laboratorium. ELISA kan worden uitgevoerd en aangepast in verschillende modes. De gepresenteerde protocollen zijn geoptimaliseerd voor het onderzoek naar de interactie tussen verschillende lambda interferonen (INFLs) en hun receptor.
De directe LRA zorgt voor een quantificatieen van ligand-receptor binding ten opzichte van ligand concentratie en derhalve een bindende curve oplevert. Gebruikmaking van een geschikt model voor de ligand-receptor interactie, kunnen de gegevens verder worden geanalyseerd om de dissociatieconstante (KD) te schatten.
In de gepresenteerde protocol, wordt de gebruikte Hill-vergelijking toegepast op de ligand-receptor binding te modelleren. Hoewel andere methoden zoals de oppervlakte plasmon resonantie technologie 2,3 maken de bepaling van bindingsaffiniteiten tussen twee eiwitten, deze technologie is vaak arbeidsintensief, duur, en vereist speciale laboratoriumapparatuur.
De competitie LRA maakt de screening van remmende peptiden: de ligand-receptor binding wordt gekwantificeerd ten opzichte peptideconcentratie. Dit levert een dosis-response curve beschrijft het remmende effect van het peptide. De gegevens kunnen verder worden geanalyseerd om de halve maximale remmende concentratie te schatten (IC 50 </sub>) van de blokkerende peptide.
Beide ELISA-protocollen zijn gemakkelijk te gebruiken en kan worden aangepast aan een breed scala van onderzoek vragen. Recombinante eiwitten van elke soort kan worden gebruikt om snel en betrouwbaar bepalen van de interactie delen. Bovendien kan de concurrentie LRA worden gebruikt om kritische interactieplaatsen van liganden en receptoren bepalen via blokkerende peptiden, die zijn ontworpen om ofwel het ligand of de receptor nabootsen. Wanneer de blokkerende peptide toont efficiënte en specifieke remming, het peptide heeft een kritische interactieplaats van de ligand (indien het peptide bootst de receptor) of de ligand (indien het peptide bootst de ligand).
Het eerste protocol beschrijft de K-D-waarde bepalen van verschillende INFLs en de alfa-subunit van hun receptor, dat wil zeggen, de interleukine-28 receptor (IL28RA) met behulp van de directe LRA. Vervolgens wordt het tweede protocol laat zien hoe het vermogen van een 20 aminozuren lang peptide te bepalenremmen de INFL-IL28RA interacties. Het peptide is ontworpen om te concurreren met IFNLs hun receptorbindingsplaats en maakt daarmee een moleculair begrip van de interactie. Verder kan dit peptide worden gebruikt om IL28RA in vitro experimenten blokkeren de effecten op downstream signaaleffecten 4 bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA is een standaard en gevestigde methode voor vele laboratoria. We hebben verder gemodificeerd en verbeterd eerder gepubliceerde werkwijze 5,7. De aangetoonde stap-voor-stap protocol duidelijk dat het kan worden gebruikt op een eenvoudige manier de KD-waarden van ligand-receptor-interacties te bepalen. Bovendien kan de IC50 van een blokkerend peptide dat interfereert met de ligand-receptor interactie te bepalen.
Belangrijke voordelen zijn de snelle installatie, eenv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
Riferimenti
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O’Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochimica. 35, 6786-6794 (1996).
