Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

Elementi regolatori trascrizionali sono fondamentali per la messa a punto spazio-temporale dell'espressione genica durante lo sviluppo ¹ e la modifica di questi elementi può portare a malattia a causa di espressione genica aberranti ^2. Molte regioni associate alla malattia identificati da studi di associazione genome wide sono nelle regioni non codificanti e hanno caratteristiche di esaltatori trascrizionale ^3-4. Identificare esaltatori e abbinandoli con i geni che regolano è complicato in quanto sono spesso trovano diversi kilobases lontano dai geni che regolano e possono essere attivati ​​in maniera tessuto-specifica ^5-6. Previsioni Enhancer sono comunemente basate su segni modificazione degli istoni, complessi mediatore-cohesin e vincolante di trascrizione specifici per tipo di cellula fattori ^7-10. Convalida di esaltatori previsti è più spesso fatto attraverso un saggio basato vettore in cui l'enhancer attiva espressione di un gene reporter ^11-12. Questi dati forniscono vinformazioni aluable circa il potenziale normativo di sequenze enhancer putativi, ma non rivelano la loro funzione nel loro contesto genomico endogena o identificare i geni che regolano. la modifica del genoma serve come un potente strumento per studiare la funzione di elementi regolatori trascrizionali nel loro contesto endogena di analisi perdita-di-funzione.

I recenti progressi nella modifica del genoma, cioè il / Cas9 sistema di editing genoma CRISPR, facilitano la ricerca della funzione del genoma. Il sistema / Cas9 CRISPR è facile da usare e adattabile per molti sistemi biologici. La proteina Cas9 si rivolge ad un sito specifico nel genoma da un RNA guida (gRNA) ^13. Il complesso SpCas9 / gRNA esegue la scansione del genoma per il suo obiettivo di sequenza genomica che deve essere 5 'ad una sequenza protospacer motivo adiacente (PAM), NGG ^14-15. appaiamento delle basi del gRNA al suo obiettivo, a 20 nucleotidi (nt) sequenza complementare al gRNA, attiva SpCas9 attività nucleasi con un conseguente Doublpausa e filamento (DSB) 3 bp a monte della sequenza PAM. Specificità è ottenuto attraverso l'accoppiamento base completa nella regione seme gRNA, il 6-12 nt adiacente al PAM; Al contrario, disallineamenti 5 'del seme di solito sono tollerati ^16-17. La DSB introdotta può essere riparato entro la fine non omologa unirsi (NHEJ) riparazione del DNA o di omologia riparazione diretta (HDR) mechanisms.NHEJ riparazione del DNA spesso crea inserzione / delezione (indels) di pochi bp al sito di destinazione che possono disturbare l'open reading frame (ORF) di un gene. Per generare delezioni grandi nel genoma due gRNAs, che fiancheggiano la regione di interesse, può essere utilizzato ^18-19. Questo approccio è particolarmente utile per lo studio di esaltatori di trascrizione raggruppati in regioni di controllo locus o super-stimolatori che sono più grandi di esaltatori convenzionali ^9,18,20-22.

Eliminazioni monoallelic sono un modello valido per lo studio -Regolamento cis di trascrizione. Il chang osservatae nel livello di trascrizione dopo la cancellazione monoallelic di un potenziatore correlato al ruolo di detta enhancer nella regolazione genica senza gli effetti confondenti che possono verificarsi quando la trascrizione di entrambi gli alleli è influenzata potenzialmente influenzare il fitness cellulare. Valutare ridotta espressione è difficile ma senza la capacità di distinguere la eliminato dal tipo di allele selvatico. Inoltre, genotipizzazione delezioni in ogni allele senza la capacità di distinguere i due alleli è impegnativo, soprattutto per le grandi delezioni di> 10 kb a 1 Mb ²³ in cui è difficile per amplificare l'intera regione di tipo selvatico mediante PCR. L'uso di cellule ES F1 generati dal passaggio a Mus musculus ¹²⁹ con Mus castaneus permette ai due alleli per essere differenziati mediante PCR allele-specifica ^18,24. Il genoma ibrido in queste cellule facilita allele specifico di screening cancellazione e analisi di espressione. In media c'è un SNP ogni 125 bp tra questi due genomi, Fornendo flessibilità nella progettazione di primer per l'espressione e la genotipizzazione analisi. La presenza di uno SNP può influenzare la temperatura di innesco di fusione (T _m) e destinazione specificità amplificazione real-time PCR quantitativa (qPCR) consentendo la discriminazione dei due alleli ^25. Inoltre un disadattamento all'interno all'estremità 3 'del primer influenza notevolmente la capacità della DNA polimerasi di estendere dal primer impedendo amplificazione del bersaglio indesiderato allele ^26. Descritto nella seguente protocollo è l'uso di cellule ES F1 per l'allele specifico delezioni enhancer di maggiore di 1 KB e la successiva analisi di espressione utilizzando il / Cas9 sistema di editing genoma CRISPR (Figura 1).

Figura 1. eliminazione Enhancer usando CRISPR / Cas9 per studiare cis -REGlamento di espressione genica. cellule (A) F1 ES generati da un incrocio tra Mus musculus ¹²⁹ e Mus castaneus sono utilizzati per consentire l'eliminazione allele specifico. (B) Due RNA guida (gRNA) vengono utilizzati per indurre una grande delezione Cas9-mediata della regione enhancer. (C) Set di primer sono utilizzati per identificare grande mono e bi-delezioni alleliche. I primer di colore arancione sono i primer all'interno, i primer viola sono i primer esterni ei primer verde sono i primer fiancheggianti gRNA. (D) Le variazioni di espressione genica sono monitorati utilizzando allele-specifica qPCR. RFU denota unità di fluorescenza relativa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.