Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Transkriptions – Regulationselemente sind entscheidend für die räumlich-zeitliche Feinabstimmung der Genexpression während der Entwicklung ¹ und Modifikation dieser Elemente in Krankheits ² aufgrund aberrant Genexpression führen kann. Viele krankheitsassoziierten Regionen durch genomweite Assoziationsstudien identifiziert sind in nicht-kodierenden Regionen und verfügen über Funktionen von Transkriptionsverstärker ^3-4. Identifizieren Enhancer und passender sie mit den Genen regulieren sie ist kompliziert , da sie oft mehrere Kilobasen entfernt von den Genen liegen sie regulieren und kann ^5-6 in einer gewebespezifischen Weise aktiviert werden. Enhancer Prognosen werden auf Histonmodifikation Marken, Mediator-cohesin Komplexe häufig basiert und Bindung von zelltypspezifischen Transkriptionsfaktoren ^7-10. Validierung des vorhergesagten Verstärker wird am häufigsten durch einen vektorbasierten Assay durchgeführt , in dem der Verstärker ^11-12 Expression eines Reportergens aktiviert. Diese Daten liefern valuable Informationen über das regulatorische Potential mutmaßlicher Enhancer-Sequenzen, aber nicht offenbaren ihre Funktion in ihrer endogenen genomischen Kontext oder zu identifizieren, die Gene, die sie regulieren. Genome Bearbeitung dient als leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktion von Transkriptionsregulationselemente in ihrer endogenen Zusammenhang mit loss-of-function-Analyse zu untersuchen.

Jüngste Fortschritte in der Genombearbeitung, nämlich die CRISPR / Cas9 Genom Editing-System, ermöglichen die Untersuchung der Genomfunktion. Der CRISPR / Cas9 System ist einfach zu bedienen und anpassungsfähig für viele biologische Systeme. Das Cas9 Protein wird durch eine Führungs RNA (gRNA) ¹³ in das Genom an einer bestimmten Stelle ausgerichtet sind . Der SpCas9 / gRNA Komplex durchsucht das Genom für seine Ziel genomischen Sequenz , die 5 'angrenzend Motiv (PAM) Sequenz, NGG ^14-15 zu einem protospacer sein muss. Basenpaarung der gRNA zu seinem Ziel, eine 20 Nukleotid (nt) Sequenz, die komplementär zu der gRNA aktiviert SpCas9 Aktivität Nuklease in einem Doppe ergebe Strangbruch (DSB) 3 bp stromaufwärts der PAM-Sequenz. Die Spezifität wird durch vollständige Basenpaarung in der Seed-Region gRNA erreicht, die 6-12 nt neben dem PAM; Umgekehrt Mismatches 5 'des Saatgutes werden üblicherweise ^16-17 toleriert. Das eingeführte DSB repariert werden können, entweder durch die nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) DNA-Reparatur oder Homologie gerichteten Reparatur (HDR) mechanisms.NHEJ DNA-Reparatur oft Einfügen / Löschen (indels) von wenigen bp an der Zielstelle erzeugt, die stören können der offene Leserahmen (ORF) eines Gens. Um größere Deletionen im Genom zwei gRNAs erzeugen, welche die Region von Interesse flankieren, können ^18-19 verwendet werden. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Untersuchung der transkriptionalen Enhancer geclustert in Locus – Kontrollregionen oder super-Enhancer , die größer sind als herkömmliche Enhancer ^9,18,20-22.

Monoallelic Streichungen sind ein wertvolles Modell für cis -Regelung der Transkription zu studieren. Die beobachtete change in Transkriptebene nach monoallelic Deletion eines Enhancers korreliert mit der Stellung dieser Enhancer in Genregulation ohne die verwirrende Wirkungen, die potenziell Zell fitness Beeinflussung beeinträchtigt wird, wenn die Transkription von beiden Allelen auftreten können. reduzierte Expression Auswertung ist schwierig, jedoch ohne die Fähigkeit, die gelöscht aus dem Wildtyp-Allel zu unterscheiden. Weiterhin ohne die Fähigkeit , an jedem Allel – Deletionen Genotypisierung die beiden Allele zu unterscheiden , ist eine Herausforderung, insbesondere für große Deletionen von> 10 kb bis 1 Mb ²³ , in dem es schwierig ist, die gesamte Wildtyp – Region durch PCR zu amplifizieren. Die Verwendung von F1 – ES – Zellen erzeugt durch Kreuzen Mus musculus ¹²⁹ mit Mus castaneus können die zwei Allele durch allelspezifische PCR ^18,24 unterscheiden. Das Hybrid-Genom in diesen Zellen erleichtert Allel-spezifische Deletion Screening und Expressionsanalyse. Im Durchschnitt gibt es eine SNP alle 125 bp zwischen diesen beiden GenomeFlexibilität für den Ausdruck und die Genotypisierung in Primer-Design, Untersuchungen. Die Anwesenheit eines SNP können die Primer Schmelztemperatur (T _m) beeinflussen und Zielspezifität in real-time quantitative PCR (qPCR) Amplifikation unter Berücksichtigung Unterscheidung der beiden Allele ^25. Weiterhin ist ein Mismatch innerhalb des Endes des Primers '3 beeinflußt stark die Fähigkeit der DNA – Polymerase aus dem Primer verhindert Amplifikation des Allels unerwünschten Ziel ²⁶ zu erstrecken. Beschrieben in dem folgenden Protokoll ist die Verwendung von F1 – ES – Zellen für die Allel – spezifische Enhancer – Deletionen von mehr als 1 kb und anschließende Expressionsanalyse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 Genom Editiersystem (Abbildung 1).

Abbildung 1. Enhancer Löschen mit CRISPR / Cas9 cis -REG zu studierenulation der Genexpression. (A) F1 ES durch eine Kreuzung zwischen Mus musculus sind ¹²⁹ und Mus castaneus erzeugten Zellen für Allel – spezifische Löschen zu ermöglichen. (B) Zwei Führungs RNAs (gRNA) verwendet , um eine große Cas9-vermittelte Deletion des Enhancer – Region zu induzieren. (C) werden Primer – Sets verwendet , um große mono- und bi-allelische Deletionen zu identifizieren. Die orangefarbenen Primer sind die inneren Primer sind die lila Primer die äußeren Primer und die grünen Primer werden die gRNA flankierenden Primer. (D) Änderungen in der Genexpression verwenden allelspezifischen qPCR überwacht. RFU bezeichnet relative Fluoreszenzeinheiten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.